張拔山 李榮 王文鋒 周雪明 羅北京 朱梓年 張錫波 丁愛嬌

成骨不全（Osteogenesis Imperfecta，OI）是一組遺傳性結(jié)締組織疾病，其特點是兒童早期骨脆性增加、骨量減少和骨折頻繁［1］。目前認為大約90%的OI 病例是由col1a1 和col1a2 的常染色體顯性突變引起的。然而，大約20%～25%的中度至重度OI 患者在其他基因中存在致病性突變［2］。突變?nèi)鏢ERPINF1、P3H1、CRTAP、PPIB、BMP1、FKBP10、SP7、PLOD2、TMEM38B、PLOD2、P4HB、SPARC 和SEC24 等被認為與常染色體隱性OI 病例密切相關(guān)［3］。此外，研究表明WNT1突變影響成骨細胞活性，導致OI 患者骨量紊亂、脆性骨折和進行性骨異常［4］。WNT1是Wnt 蛋白家族的一員，在調(diào)節(jié)骨量和維持骨代謝的動態(tài)平衡方面起著重要作用。體外實驗表明，WNT1缺陷可導致骨形成顯著減少，而WNT1過度表達可促進骨形成［5］。在OI 中，研究表明WNT1的雙等位基因突變導致隱性OI，而WNT1雜合子突變與顯性遺傳家族中的早發(fā)性骨質(zhì)疏松癥相關(guān)［6］。目前為止，已超過27 種導致WNT1突變的疾?。?］。然而，大多數(shù)WNT1突變的生物學功能尚未闡明。典型的WNT1通路通過與細胞表面的frizzle 和LRP5 受體結(jié)合來啟動信號級聯(lián)，導致非磷酸化β-catenin在細胞中的積累，并作為轉(zhuǎn)錄因子來刺激WNT信號通路下游靶基因的轉(zhuǎn)錄［8］。因此，本研究構(gòu)建 了WNT1野 生 型、WNT1c.110T＞C、WNT1c.505G＞T 和WNT1c.884C＞A 突變質(zhì)粒（陽性對照），并將其轉(zhuǎn)染成骨細胞（MC3T3-E1），研究突變對MC3T3-E1 細胞中WNT1/β-catenin 通路激活的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

在添加10%胎牛血清的α-DMEM 中培養(yǎng)成骨前細胞（MC3T3-E1）。細胞在37℃的培養(yǎng)箱中在5%的二氧化碳和90%的濕度下生長。

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)染

利用通用生物系統(tǒng)公司（General Biosystems，Inc。）合成野生型WNT1、突變型WNT1c.110T＞C、WNT1c.505G＞T 和WNT1c.884C＞A 質(zhì)粒，以空質(zhì)粒（載體）為陰性對照，c.884C＞A 為陽性對照。為研究突變對MC3T3-E1 細胞的影響，在轉(zhuǎn)染前將細胞以5×105的密度接種到6孔板中并培養(yǎng)24小時。根據(jù)制造商的說明，使用lipofectin3000 將WNT1、c.110T＞c、c.505G＞T 和c.884C＞a轉(zhuǎn)染到每個孔中的細胞。

1.3 熒光定量PCR（qPCR）

用TRIzol 試劑（美國英杰）從MC3T3-E1 細胞中分離總RNA。用隨機引物，用M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶將總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。WNT1、BMP2和RANKL使用SYBR 實時PCR 主混合試劑盒（日本東洋紡）進行擴增，特異引物如下：WNT1正向：5′-CGATGGGGGTATTGGAAC-3′，WNT1反向：5′-CCGGATTTGGTATCAGAC-3′，BMP2正向：5′ -GGGACCCTGTTCTAGT-3′，BMP2反向：5′ -TCAATCAGATTCAGAC-3′，RANKL正向：5′-AGGCTGGGCCAAGATCTCTA-3′，RANKL反向：5′-GTCTGTAGGTACGCTTCCCG-3′。WNT1、BMP2和RANKL的相對表達用2-ΔΔct法計算。以GAPDH 為內(nèi)對照：GAPDH正向：5′-ATCAAGTGGGGTGATGCTGG-3′，反向：5′-CCTGCTTCACCACC TTCTTGA-3′。此外，進行了三個獨立的分析。

1.4 免疫印跡法

用添加蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液裂解細胞。蛋白質(zhì)濃度用蛋白定量試劑盒（美國皮爾斯）定量。蛋白質(zhì)（40 μg/樣品）在10%SDS-聚丙烯酰胺梯度凝膠上分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜。用5%牛血清白蛋白（BSA）封閉后，將原代WNT1、non-p-β-catenin、GSK-3β、p-GSK-3β、BMP2和RANKL 抗體和相應的HRP 二級抗體。用化學發(fā)光試劑（美國默克密理博）觀察印跡。用Image-Pro 軟件將蛋白質(zhì)的相對表達標準化為GADPH。

1.5 免疫熒光法

用WNT1c.110T＞C、c.505G＞T 和c.884C＞A 載體轉(zhuǎn)染細胞，轉(zhuǎn)染72 h 后，用4%多聚甲醛固定細胞，用0.5% Triton-100 滲透，用5% BSA 封閉。接下來，細胞用WNT1、β-catenin、non-p-β-catenin、GSK-3β 和p-GSK-3β 一級抗體和FITC 結(jié)合的二級抗體培養(yǎng)。熒光顯微鏡下觀察陽性信號。DNA用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚染色5 min。

1.6 3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧甲氧基苯基）-2-（4-磺苯基）-2H 四唑鹽（MTS）分析

轉(zhuǎn)染前，將細胞以1×104個細胞/孔的密度接種在96 孔板中24 小時。用WNT1c.110T＞C、c.505G＞T和c.884C＞A 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞。轉(zhuǎn)染后，細胞繼續(xù)在添加有20 μL CellTiter 96 水溶液試劑的α-DMEM（100 μL）中培養(yǎng)4 小時。在492 nm 處使用96 孔板閱讀器（美國伯樂）測定細胞活力。

1.7 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)；計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間兩比較采用Tukey 檢驗；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 WNT1 c.110T＞C 和c.505G＞T 突變影響MC3T3-E1 的增殖

MC3T3-E1 細胞轉(zhuǎn)染24 h 后，WNT1野生型細胞活性顯著高于空載組、c.505G＞T 及c.884C＞A 突變組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。轉(zhuǎn)染48 h 后，野生型細胞在490 nm 處檢測到的吸光度（OD）值為（0.512±0.029)，而c.110T＞C 和c.505G＞T 突變型細胞OD 值分別為（0.440±0.042）、（0.458±0.014），各組間OD 值比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=4.324，P＜0.05），且WNT1 野生型細胞活性顯著高于c.110T＞C 和c.505G＞T 突變型細胞，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 WNT1 c.110T＞C、c.505G＞T 和c.884C＞A 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MC3T3-E1 細胞24、48 h 的存活率Figure 1 Viability of MC3T3-E1 cells after transfection with Vector，WNT1 c.110T＞C，c.505G＞T，and c.884C＞A plasmids at 24 and 48 h

2.2 WNT1 c.110T＞C 和c.505G＞T 突變影響成骨細胞標志物的表達

BMP2mRNA 的表達水平在WNT1野生型細胞，c.110G＞T 突變細胞，c.505C＞A 突變細胞以及c.884C＞A 突變細胞的表達量與突變細胞株比較，BMP2在野生型細胞株中表達顯著升高差異有統(tǒng)計學意義（F=376.210，P＜0.05）；RANKLmRNA 的表達量在WNT1 野生型細胞，c.110G＞T 突變細胞，c.505C＞A 突變細胞以及c.884C＞A 突變細胞與突變細胞株比較，RANKLmRNA 在野生型細胞株中表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（F=25.940，P＜0.01，P＜0.05），見圖2A、2B。WB 結(jié)果在蛋白水平上證實，與突變細胞株相比，BMP2mRNA 在WNT1野生型細胞株中顯著高表達（F=480.532，P＜0.05），而RANKLmRNA 在WNT1 野生型細胞株中顯著低表達，差異有統(tǒng)計學意義（F=201.510，P＜0.05），見圖2C、圖2D、圖2E。

2.3 WNT1 c.110T＞C 和c.505G＞T 突變影響WNT/β-catenin 信號通路

WNT1mRNA 的表達水平在空載組，c.110T＞C突變型組，c.505G＞T 突變型組和野生型組細胞中的表達量與空載組比較，WNT1在野生型組與突變型組細胞中表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）(圖3A)。WB 和IF 分析表明，WNT1的相對灰度值（integrated density value，IDV）在野生型組細胞，c.110T＞C 突變型組細胞與c.505G＞T 突變型組細胞與轉(zhuǎn)染空載組細胞相比，WNT1在野生型和突變型細胞中表達上升，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖3B、3C 和圖4。非磷酸化βcatenin（non-p-β-catenin）的IDV 在WNT1野生型細胞，c.110T＞C 突變細胞株，c.505G＞T 突變細胞株及c.884C＞A 突變細胞株與WNT1野生型細胞相比，轉(zhuǎn)染突變WNT1基因的細胞中non-p-β-catenin 的表達顯著下調(diào)差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；磷酸化GSK-3β（p-GSK-3β）的IDV 在WNT1野生型細胞，c.110T＞C 突變細胞株，c.505G＞T 突變細胞株及c.884C＞A突變細胞株與WNT1野生型細胞相比，轉(zhuǎn)染突變WNT1基因的細胞中p-GSK-3β 的表達顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖3D、3E 和圖4。

圖2 WNT1 突變對MC3T3-E1 細胞BMP2 和RANKL mRNA 及蛋白表達水平的影響Figure 2 Effects of WNT1 mutation on the mRNA and protein expression levels of BMP2 and RANKL in MC3T3-E1 cells

圖3 轉(zhuǎn)染W(wǎng)NT1 野生型和突變質(zhì)粒的細胞中WNT1 的mRNA 和蛋白表達水平及與WNT/β-catenin 信號通路Figure 3 The mRNA and protein expression levels of WNT1 and important factors related to the WNT/β-catenin signaling pathway in cells transfected with WNT1 wild-type and mutant plasmids

3 討論

以往研究表明，在四個獨立家譜的外周血樣本中發(fā)現(xiàn)4個新的WNT1 雜合突變（c.110T＞C、c.505G＞T、c.385G＞A 和c.506G＞A）與OI 相關(guān)［4］。其中，位于外顯子2 的錯義突變（WNT1c.110T＞C）可導致異亮氨酸轉(zhuǎn)化為蘇氨酸。此外，外顯子3 的錯義突變（c.505G＞T）導致半胱氨酸取代甘氨酸。目前，這些突變的生理意義尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，突變c.110GT＞C 和c.505G＞T 能夠抑制MC3T3-E1細胞活性。同時研究揭示了WNT1c.110T＞C 和c.505G＞T 突變對成骨細胞增殖和WNT1/β-catenin信號通路的影響。野生型WNT1 可誘導成骨細胞分化標志物BMP2 的表達，抑制破骨細胞分化標記物RANKL，激活WNT1/β-catenin 信號通路，但當WNT1c.110T＞C 和c.505GT＞突變時，這些效應明顯受抑制。此外，骨質(zhì)疏松癥是OI 患者的一個重要特征［9］。研究表明，BMP2 和RANKL 分別誘導成骨細胞和破骨細胞分化［10-11］，WNT1 缺陷小鼠的成骨細胞活力降低，并與骨折表型相關(guān)［12］。本研究結(jié)果說明WNT1的c.110T＞C 和c.505G＞T 突變導致成骨細胞發(fā)育不良，抑制骨形成，容易增加骨質(zhì)疏松和骨折的風險。

此外，研究還表明，WNT1 突變可通過使典型WNT 途徑失活而導致骨結(jié)構(gòu)的變化［13］。盡管一些突變形式誘導WNT1 信號通路的激活，但WNT 信號通路下游目標基因的表達失調(diào)，會導致成骨細胞礦化受損［6］。WNT 與Frizzled/LRP5/6 復合物共同激活WNT/β-catenin 信號通路，介導β-catenin 的激活，進而激活下游基因的表達。當存在WNT 信號時，GSK-3β 介導的β-catenin 水解被抑制，β-catenin 的下游靶基因可以被激活［14］。本研究結(jié)果顯示，與野生型WNT1 組相比，c.110T＞C 和c.505G＞T 突變降低了GSK-3β 和非β-catenin 水平，提示W(wǎng)NT1 的c.110T＞C 和c.505G＞T 突變可能與WNT 激活減少和典型WNT/β-catenin 信號通路的激活降低有關(guān)，然而確切的機制還需要進一步的研究。

綜上所述，WNT1基因c.110T＞C 和c.505G＞T突變對WNT 信號通路的影響可能是導致OI 的原因。WNT1c.110T＞C 和c.505G＞T 突變可作為OI 早期篩查的候選靶點參考。