周 界，李 明,2，徐友陽，洪 彪，段書蕾，張慧曄，鄒江林

(1 廣東藥科大學 中藥學院，廣東 廣州 510006； 2 國家中醫(yī)藥管理局嶺南藥材生產與開發(fā)重點研究室，廣東 廣州 510006； 3 廣州白云山和記黃埔中藥有限公司，廣東 廣州 510515)

中藥穿心蓮為爵床科Acanthaceae植物穿心蓮Andrographispaniculata(Burm.f.) Nees的干燥地上部分，具有清熱解毒、涼血、消腫的功效，用于感冒發(fā)熱、咽喉腫痛、口舌生瘡、頓咳勞嗽、泄瀉痢疾、熱淋澀痛、癰腫瘡瘍、蛇蟲咬傷等[1]，素有“中藥抗生素”之稱?，F代藥理研究證明，穿心蓮具有抗菌、抗氧化、抗瘧、抗血管生成、抗炎、抗糖尿病等多種藥理作用，由于其顯著的臨床療效而被廣泛應用，需求量大幅度增加，但連作障礙問題使其質量和產量不穩(wěn)定[2]。很多栽培藥用植物都存在不同程度的連作障礙, 如人參[3]、西洋參[4]、三七[5]等，藥用植物產生連作障礙的原因有很多，主要包括：化感自毒作用、土壤物理性質惡化和養(yǎng)分失衡、土傳病害增加、根際土壤微生物群落變化[6-7]等。目前關于穿心蓮連作障礙成因的研究主要集中在化感自毒作用[8-12]，也有關于利用平板計數法、BIOLOG微平板法和T-RFLP技術研究連作穿心蓮根際土壤微生物的數量、結構和功能多樣性的報道[13]。高通量測序技術具有免培養(yǎng)、高通量的優(yōu)點，是獲取大量土壤微生物信息的良好工具[14]，本研究采用16S rRNA 基因高通量測序研究穿心蓮連作對土壤細菌多樣性及群落結構的影響，為揭示穿心蓮連作障礙的成因及作用機制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

土樣采集地點位于廣東省清遠市英德市大灣鎮(zhèn)，采集時間為2018年10月。五點取樣法采樣，利用抖根法收集穿心蓮根際土壤，所采土壤樣品分為2個處理組：連作組(連作5年穿心蓮的根際土壤)和對照組(連作5年穿心蓮周邊相同母質的未耕作自然土壤)，每組5次重復，所采土樣去除植物殘體和石礫等雜物后放入滅菌樣品袋，置冰盒中運回，在實驗室?80 ℃條件下保存，待用。

1.2 儀器與試劑

Daek reader (Clare Chemical Research)；Qubit?fluorometer (Invitrogen)；微型離心機 (Baygene)；渦旋混合器 (其林貝爾)；NanoDrop? One (Thermo Fisher Scientific)；電泳儀 (北京六一)；凝膠成像儀(Tanon)；PCR 儀 (BioRad)；冷凍離心機 (Eppendorf)。

MOBIO PowerSoil?DNA Isolation Kit(MOBIO)；PremixTaq(ExTaqVersion 2.0 plus dye)、DL15000 DNA Marker、100bp DNA Ladder和DL2000 DNA Marker (TaKaRa)；瓊脂糖 (浩瑪生物)；Primer和 Quant-iT? Broad-Range DNA Assay Kit (Invitrogen)；E.Z.N.A.?Gel Extraction Kit(Omega)；NEBNext?Ultra? DNA Library Prep Kit for Illumina?(New England Biolabs)。

1.3 細菌多樣性測定

DNA提取與PCR擴增：按照DNA 提取試劑盒說明書進行基因組DNA抽提后，利用NanoDrop One 檢測 DNA 的濃度和純度。PCR擴增采用的引物為細菌16S rRNA基因中的V4～V5區(qū)引物515 F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和 907R (5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)。PCR 反應體系為：PremixTaq25 μL，10 mmol/L 的上、下游引物各1 μL，DNA (20 ng/μl) 3 μL，Nuclease-free water 20 μL。PCR 反應條件為：94 ℃ 5 min；然后 94 ℃30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s進行 30 個循環(huán)；72 ℃10 min，4 ℃ 保存。PCR 反應結束后，用 10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR 產物的片段長度和濃度。利用 GeneTools Analysis Software (Version 4.03.05.0, SynGene)對 PCR 產物進行濃度對比后，按照等質量原則計算各樣品所需體積，將各 PCR 產物進行混合。使用 E.Z.N.A.?Gel Extraction Kit 凝膠回收試劑盒回收 PCR 混合產物，TE 緩沖液洗脫回收目標 DNA 片段。

建庫與測序：按照 NEBNext?Ultra? DNA Library Prep Kit for Illumina?標準流程進行建庫操作。使用 Illumina Hiseq 2500 平臺對構建的擴增子文庫進行 PE250 測序。(以上試驗均由廣東美格基因科技有限公司完成)。

1.4 數據處理與分析

對Illumina Hiseq 2500測序得到的雙端序列數據過濾，進行前期的質量控制，然后根據雙端序列之間的重疊關系進行拼接，同時對拼接序列進行質量過濾，得到有效的拼接序列，將具有97%一致性的序列聚類成為可操作分類單元(Operational taxonomic unit，OTU)。將每個 OTU 的代表序列與Silva數據庫比對，獲得代表性序列物種在各分類水平的注釋信息?；?OTU豐度表，使用 QIIME 軟件包中的make_rarefaction_plots.py 等腳本進行Observed species指數的稀釋曲線數據計算，并使用R 軟件繪制稀釋曲線?；诰换?OTU 豐度表，使用 QIIME 軟件包 (V1.9.1)中的 alpha_diversity.py腳本進行4種多樣性指數(Observed species、Chao1、Shannon、Simpson)的計算。基于 Unweighted Unifrac距離矩陣，使用 qiime2 和 ggplot2 軟件包進行主坐標分析 (Principal coordinates analysis，PCoA)并繪圖, 采用 PCoA 及分子方差分析 (Analysis of molecular variance，Amova)進行組間群落結構差異顯著性分析。使用R軟件繪制柱狀圖、熱圖等。使用Excel 2016和SPSS 24.0 軟件對試驗數據進行統計分析，對處理組間的差異采用獨立樣本t檢驗進行分析。

2 結果與分析

2.1 穿心蓮連作處理對土壤細菌α多樣性的影響

α多樣性分析結果(表1)顯示，連作組土壤中的豐富度指數包括Chao1指數和Observed species指數均顯著低于對照組(P<0.05)，表明穿心蓮連作使土壤細菌群落豐富度顯著降低；連作組土壤中的多樣性指數包括Shannon指數和Simpson指數均低于對照組，但差異并不顯著。整體結果表明穿心蓮連作使根際土壤細菌群落多樣性減少。

表 1 穿心蓮連作土壤與對照土壤細菌的α多樣性1)Table 1 α diversity of bacteria in soil with continuous cropping of Andrographis paniculata and control soil

2.2 穿心蓮連作處理對土壤細菌β多樣性的影響

β多樣性是對不同樣品間的微生物群落構成進行比較。PCoA分析中，樣品的空間距離越接近，表示樣品的物種組成結構越相似。對連作組與對照組土壤樣品進行PCoA分析(圖1)，PC1的貢獻率為33.63%，PC2的貢獻率為13.47%，2個主成分的累計貢獻率為47.10%，可以表征所有的變量特征。結果顯示，對照組的5個樣本能夠與連作組5個樣本明顯分開，說明2個處理組樣品的物種組成結構產生了明顯差異。Amova分析可用于組間群落結構差異顯著性分析，P值小于0.05 說明組間差異顯著。對連作組與對照組土壤樣品進行Amova分析，結果顯示Amova分析中P=0.011<0.05，說明兩者組間群落結構差異顯著。綜上所述，穿心蓮5年連作顯著改變了土壤細菌群落結構。

圖 1 穿心蓮連作土壤與對照土壤的PCoA (Unweighted Unifrac)分析Fig.1 PCoA (Unweighted Unifrac) analysis of soil of Andrographis paniculata continuous cropping and control

2.3 穿心蓮連作處理對土壤細菌群落組成及豐度的影響

基于Unweighted Unifrac距離矩陣，通過非加權組平均聚類分析 (Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)法對連作組與對照組土壤樣品進行門水平上的聚類與柱狀圖組合分析 (圖2)。結果顯示，連作組5個樣本與對照組土壤5個樣本在門水平上各自聚為一類，說明穿心蓮5年連作明顯改變了土壤細菌在門水平上的結構分布。從2個處理共檢測到2 769個OTU，分屬于47個門，其中變形菌門Proteobacteria (相對豐度為22.53%～27.48%)、酸桿菌門 Acidobacteria (相對豐度為19.62%～28.71%)、擬桿菌門 Bacteroidetes (相對豐度為12.14%～17.75%)、綠彎菌門Chloroflexi(相對豐度為10.96%～11.62%)、浮霉菌門Planctomycetes (相對豐度為5.43%～6.26%)、疣微菌門 Verrucomicrobia (相對豐度為4.24%～4.50%)、放線菌門 Actinobacteria (相對豐度為2.86%～3.18%)、芽單胞菌門Gemmatimonadetes (相對豐度為2.48%～3.53%)、藍藻細菌門 Cyanobacteria (相對豐度為0.10%～4.81%)、Patescibacteria (相對豐度為0.49%～1.58%)和硝化螺旋菌門Nitrospirae (相對豐度為0.89%～1.09%) 這11個細菌門是2個處理組的主要細菌類群，上述門類相對豐度累計在連作組和對照組土壤中分別占細菌總數的96.44%和95.81%。

圖 2 穿心蓮連作土壤與對照土壤細菌在門水平上的UPGMA聚類與柱狀圖組合分析Fig.2 UPGMA clustering and histogram combination analysis of bacteria in soil of Andrographis paniculata continuous cropping and control at the phylum level

對連作組與對照組土壤細菌主要細菌門的相對豐度采用獨立樣本t檢驗進行差異顯著性分析(表2)。結果顯示，擬桿菌門、芽單胞菌門、放線菌門、綠彎菌門、藍藻細菌門、硝化螺旋菌門、浮霉菌門、疣微菌門的相對豐度在2種處理土壤中差異不顯著，而變形菌門、酸桿菌門、Patescibacteria的相對豐度在不同處理土壤中差異顯著(P<0.05)，其中連作組土壤中變形菌門、酸桿菌門的相對豐度較對照組分別增加了 21.97%、46.33% (P<0.05)，而 Patescibacteria較對照組減少了68.99% (P<0.05)。

表 2 穿心蓮連作土壤與對照土壤主要細菌門的相對豐度比較1)Table 2 Comparison of relative abundance of major bacterial phylums in soil of Andrographis paniculata continuous cropping and control

在屬分類水平上，根據所有樣品在屬分類水平的物種注釋及豐度信息，選取穿心蓮連作土壤與對照土壤細菌豐度排名前30個物種及其在每個樣品中的豐度信息繪制熱圖，并從分類信息和樣品間差異2個層面進行聚類(圖3)。結果顯示，穿心蓮連作土壤5個樣本與對照土壤5個樣本豐度排名前30個屬的相對豐度各自聚為一類，說明穿心蓮5年連作明顯改變了土壤細菌在屬水平上的結構分布。2個處理組的主要細菌屬為黃桿菌屬Flavobacterium(相對豐度為1.84%～8.52%)、Bryobacter(相對豐度為1.57%～2.15%)、伯克氏菌屬Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia(相對豐度為0.24%～2.17%)、HSB_OF53-F07 (相對豐度為1.81%～1.94%)、Candidatus_Solibacter(相對豐度為1.03%～1.76%)、ADurb.Bin063-1 (相對豐度為1.16%～1.65%)、MND1 (相對豐度為0.37%～1.46%)、Acidibacter(相對豐度為0.28%～1.43%)、Mucilaginibacter(相對豐度為0.38～1.37%)、Ellin6067 (相對豐度為0.41%～1.19%)、芽單胞菌屬Gemmatimonas(相對豐度為0.57%～1.18%)、Haliangium(相對豐度為0.50%～1.10%)、硝化螺旋菌屬Nitrospira(相對豐度為0.88%～1.08%)、Candidatus_Udaeobacter(相對豐度為0.68%～1.07%)和 1921-2 (相對豐度為0.87%～1.00%)。

圖 3 穿心蓮連作土壤與對照土壤中相對豐度前30的細菌群落在屬水平的熱圖Fig.3 Heat map of bacterial communities with top 30 relative abundances in soil of Andrographis paniculata continuous cropping and control at the genus level

對穿心蓮連作土壤與對照土壤細菌主要細菌屬的相對豐度采用獨立樣本t檢驗進行差異顯著性分析 (表 3)。結果顯示，HSB_OF53-F07、ADurb.Bin063-1、硝化螺旋菌屬、1921-2、Candidatus_Udaeobacter的相對豐度在2種處理土壤中差異不顯著 (P>0.05)，而黃桿菌屬、Bryobacter、Candidatus_Solibacter、伯克氏菌屬、MND1、芽單胞菌屬、Mucilaginibacter、Acidibacter、Ellin6067、Haliangium的相對豐度在不同處理土壤中差異顯著(P<0.05)，其中連作組土壤中Bryobacter、Candidatus_Solibacter、Mucilaginibacter、Acidibacter、伯克氏菌屬的相對豐度較對照組分別增加了36.94%、70.87%、260.53%、410.71% 和 804.17% (P<0.05)，而黃桿菌屬、MND1、芽單胞菌屬、Ellin6067、Haliangium的相對豐度較對照組分別減少了78.40%、74.66%、51.69%、65.55% 和 54.55% (P<0.05)。

表 3 穿心蓮連作土壤與對照土壤細菌主要細菌屬相對豐度比較1)Table 3 Comparison of relative abundance of major bacterial genera in soil of Andrographis paniculata continuous cropping and control

3 討論與結論

土壤中的微生物群落對植物的生長發(fā)育具有重要作用[15]，其中細菌具有維持土壤肥力的作用[16]，連作通常會使土壤細菌數量降低，導致土壤肥力類型由高肥力的“細菌型” 向低肥力的“真菌型”轉化[17]。土壤細菌的豐富度和多樣性對于維持土壤生態(tài)健康發(fā)揮著關鍵作用[18]。本研究發(fā)現，5年連作處理使穿心蓮根際土壤細菌較對照豐富度顯著降低，多樣性減少，與譚勇等[19]對未種植三七土壤與3年生三七根際土壤細菌群落多樣性水平研究的結果類似。穿心蓮在其生長過程中會向土壤中釋放阿魏酸、對羥基苯甲酸等酚酸類化感自毒物質[20]。有研究指出，一定濃度的阿魏酸、對羥基苯甲酸及其混合酚酸會抑制土壤氨化細菌、硝化細菌和反硝化細菌的生長[21]。據此可以推測，在本研究中，經過5年連作處理后，穿心蓮根際土壤中可能積累了一定量的化感自毒物質而抑制了部分土壤細菌的生長，從而降低了細菌種群多樣性和豐富度水平。

本研究結果顯示，穿心蓮5年連作顯著改變了土壤細菌群落結構。從2個處理組土壤樣品中共檢測到2 769個OTU，分屬于47門885屬，穿心蓮5年連作明顯改變了土壤細菌在門和屬水平上的結構分布。在門水平上，連作穿心蓮根際土壤中優(yōu)勢細菌類群為變形菌門、酸桿菌門、擬桿菌門、綠彎菌門、浮霉菌門、疣微菌門、放線菌門和芽單胞菌門，與前人研究連作穿心蓮的優(yōu)勢細菌類群結果大致相同[13]。在2個處理組中豐度最高的是變形菌門和酸桿菌門，這2種菌門在2個處理組中合計占比均超過40%。變形菌門在土壤中的C、N和S循環(huán)中起著關鍵作用[22]，但同時也含有一些致病菌[23]，因此連作組土壤中變形菌門的相對豐度較對照組顯著增加，可能會增加一些不利于穿心蓮生長發(fā)育的致病菌。酸桿菌門是寡營養(yǎng)細菌[24]，可以作為較貧瘠土壤環(huán)境的指示[25]，而連作組土壤中酸桿菌門的相對豐度較對照組顯著增加，說明連作土壤的營養(yǎng)狀況出現惡化。門水平上變化顯著的還有Patescibacteria，但Patescibacteria沒有可培養(yǎng)細菌代表，目前對其功能還不了解[26]。在屬水平上，有10個優(yōu)勢菌屬的相對豐度變化顯著(P<0.05)，其中擬桿菌門下的黃桿菌屬、變形菌門下的伯克氏菌屬、Haliangium尤其值得關注。有報道指出黃桿菌屬具有植物促生作用[27]，部分菌群可產生較高活性的幾丁質酶抑制植物病原真菌的生長[28]。已有研究從Haliangium中分離出抗植物病原真菌物質，說明Haliangium具有潛在的生防作用[29]。連作組中黃桿菌屬和Haliangium相對豐度較對照組顯著減少，這2種有益生防細菌的相對豐度顯著下降可能導致土壤中植物病原真菌數量增加。伯克氏菌屬是一類重要的植物病原細菌，會引起植物腐爛、枯萎和嚴重壞死等病害癥狀[30]，因此連作組土壤中伯克氏菌屬相對豐度的顯著增加可能會對穿心蓮的生長發(fā)育產生負面影響。

綜上所述，穿心蓮5年連作降低了土壤細菌豐富度和多樣性水平，使土壤微生態(tài)系統穩(wěn)定性降低，同時有益菌相對豐度顯著降低，而病原菌相對豐度顯著增加造成細菌群落結構改變。土壤細菌豐富度和多樣性水平降低，細菌群落結構改變，打破了原有的土壤微生態(tài)平衡，可能是穿心蓮連作障礙的重要原因之一。合理輪作、間作及施加合適的土壤改良劑等措施可以增加土壤微生物多樣性和改善土壤微生物群落結構，對土壤微生態(tài)環(huán)境產生積極影響，是緩解連作障礙的有效措施[31-34]，目前有關穿心蓮連作障礙緩解措施的研究正在進行中。