（陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院，陜西 西安 710065）

燈盞花系菊科正蓬屬植物，具有解表散寒、活血化瘀、疏經(jīng)活絡(luò)、止痛消積等作用。燈盞花素提取自燈盞花，主要成分為燈盞乙素，燈盞花素注射液為燈盞花素的滅菌水溶液，功能主治為活血化瘀，通絡(luò)止痛，用于中風(fēng)后遺癥、冠心病、心絞痛，在心腦血管疾病中應(yīng)用廣泛[1-2]。燈盞花素注射液現(xiàn)執(zhí)行《中藥成方制劑》第20冊標(biāo)準(zhǔn)，采用紫外吸收系數(shù)法測定其含量[3]，耗費的儀器、人力、時間成本較大，且無法進行現(xiàn)場檢測。為解決這些問題，本文提出一種快速測定燈盞花素注射液含量的方法，以解決偏遠地區(qū)藥品檢測問題，應(yīng)對自然災(zāi)害、突發(fā)性公共衛(wèi)生事件現(xiàn)場的藥品快速檢測。

近紅外光譜分析技術(shù)在分類鑒別、含量確定、在線檢測等方面具有無可比擬的優(yōu)勢[4-6]。本文通過將近紅外透反射光譜分析技術(shù)和偏最小二乘算法（PLS）相結(jié)合，構(gòu)建了燈盞花素注射液快速定量分析模型，并對模型進行了優(yōu)化和驗證，以開拓中藥注射液在快速定量分析方面的應(yīng)用。

1 儀器及試藥

1.1 儀器

Matrix-F型近紅外光譜儀（德國布魯克公司），配備有1.5 m固體光纖探頭和1號（光程1 mm）液體測樣附件；銦鎵砷（In，Ga，As）檢測器；5.0版本OPUS分析軟件（德國布魯克公司）及定量2軟件包；BP211D電子分析天平（德國賽多利斯公司）；UV-2600紫外分光光度計（日本島津公司）。

1.2 樣品

2個廠家27批燈盞花素注射液，均為本單位抽驗樣品；同時，通過稀釋的方法在實驗室自制了54個不同濃度梯度的樣品。

2 方法

2.1 含量測定

根據(jù)《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第二十冊》標(biāo)準(zhǔn)，采用紫外吸收法測定燈盞花素注射液中燈盞花素（以燈盞花素乙素計）含量[3]。

2.2 測定近紅外光譜

近紅外光譜采集的波數(shù)范圍為12 000～4 000 cm-1，分辨率為8 cm-1，室溫。實驗采樣方式為透反射。借助固體光纖探頭及1號（光程1 mm）液體采樣附件, 通過將樣品滴加到采樣附件的方式測定樣品的近紅外光譜。每批樣品選用6瓶測定原始光譜，并求平均光譜作為建模光譜。

2.3 建立定量模型

建模選用的OPUS5.0分析軟件及附帶定量2軟件包的基本原理是PLS，用交叉驗證均方根誤差（RMSECV）評價建模準(zhǔn)確性，其具體數(shù)學(xué)表達如下。

其中，Nc、CVi和Yi分別表示校正集樣品數(shù)量、交叉驗證中樣品i的預(yù)測值和真實測定值。

2.4 模型驗證

2.4.1 準(zhǔn)確性 選取未參與建模的20批來自2個生產(chǎn)企業(yè)的燈盞花素注射液，驗證模型準(zhǔn)確性。通過比較近紅外光譜預(yù)測值與真值的偏差及將預(yù)測值與真值在95 %的置信區(qū)間內(nèi)進行配對t-檢驗，評價模型準(zhǔn)確性。

2.4.2 專屬性 偏最小二乘校正模型的溢出值用馬氏距離[7]衡量，并進行專屬性評價，其計算方法如下。

其中，MD、Xi和Xj、、S分別表示馬氏距離、原始數(shù)據(jù)、元素平均值和基于建模所選PLS矢量數(shù)的協(xié)方差。

燈盞花素注射液的定量模型限定值（Threshold）按下式計算，結(jié)果為0.17。

其中，Rank表示PLS矢量數(shù)，為7；M表示建模樣本數(shù)，為81；Factor為2。

實驗選擇10批燈盞花素注射液（S）及3批相同劑型的丹參酮注射液（T）進行模型專屬性測試，將測得的馬氏距離與模型限定值進行比較，評價模型的專屬性。

2.4.3 線性 將81批建模樣品的真值與近紅外預(yù)測值做線性回歸，評價方法的相關(guān)性。

2.4.4 精密度 通過重復(fù)性和中間精密度評價所建方法的精密度。同一操作者對同一樣品在同一天內(nèi)重復(fù)測定6次，通過置信區(qū)間和標(biāo)準(zhǔn)偏差評價重復(fù)性；兩個操作者對同一樣品在3 d內(nèi)各重復(fù)測定3次，通過置信區(qū)間及方差分析評價中間精密度。

3 結(jié)果與討論

3.1 校正集、驗證集樣品的選擇

內(nèi)部交叉驗證法適用于建模樣品數(shù)量小于100批時的建模[8-9]。本研究中樣本81批次，故將所有樣品作為校正集用于模型建立。81批次樣品的含量分布見圖1。

圖1 81批次樣品的含量分布

3.2 近紅外光譜校正模型

為了突出活性成分的信息，建立穩(wěn)健、準(zhǔn)確的近紅外光譜校正模型，我們選取了特定的譜段、適合的光譜預(yù)處理方法。

3.2.1 建模譜段的選擇 近紅外光譜中波數(shù)大于10 000 cm-1部分屬于末端吸收，其強度很弱且會形成噪音干擾，而波數(shù)小于4200 cm-1部分由于邊緣效應(yīng)和噪音的存在易形成干擾，通常建模時不選擇這兩個區(qū)域[10-11]。水的合頻吸收波數(shù)約在5155 cm-1處，其呈現(xiàn)出寬頻帶高峰值特點，建模時同樣不予考慮[12-13]。

以RMSECV、R2及Rank值為評價標(biāo)準(zhǔn)，進行近紅外光譜模型的譜段敏感性分析，并參考OPUS軟件的自動優(yōu)化結(jié)果，優(yōu)化確定的建模譜段為7502～5446 cm-1和4602～4247 cm-1，該譜段所建立的模型RMSECV最小，R2最大，Rank值在6～10之間。由表1可見，模型1對應(yīng)的譜段為最優(yōu)譜段。本研究中保留的建模譜段為7502～5446 cm-1和4602～4247 cm-1，見圖2。

圖2 建模所選擇的譜段范圍

表1 不同譜段建立模型結(jié)果對比

3.2.2 光譜預(yù)處理 一階導(dǎo)+矢量歸一化的預(yù)處理方法一方面可提高活性成分相關(guān)的光譜吸收信息，降低光譜平移的影響；另一方面，可提高分辨率和靈敏度，同時改善背景信息干擾，分辨重疊峰。而平滑處理可有效地消除光譜噪聲[14-15]。本研究中采用一階導(dǎo)+矢量歸一化+17點平滑的預(yù)處理方法，樣品的原始光譜見圖3，經(jīng)預(yù)處理后的光譜見圖4。由圖3、圖4可見，預(yù)處理降低了原始光譜的背景和噪聲干擾，增強了光譜特征，提高了信噪比。

圖3 建模樣品的原始光譜

圖4 預(yù)處理后的近紅外漫反射光譜

3.2.3 確定最優(yōu)模型 通過內(nèi)部交叉驗證、模型穩(wěn)健性理論及OPUS軟件自動優(yōu)化結(jié)果的比較，多次優(yōu)化所確定的最優(yōu)模型參數(shù)見表2。內(nèi)部交叉驗證相關(guān)性結(jié)果見圖5、圖6。

表2 多次優(yōu)化確定最優(yōu)模型參數(shù)

圖5 燈盞花素注射液近紅外定量模型內(nèi)部交叉驗證結(jié)果

圖6 燈盞花素注射液近紅外定量模型RMSECV和Rank相關(guān)性圖

3.3 模型驗證結(jié)果

3.3.1 準(zhǔn)確性 結(jié)果見表3。近紅外光譜預(yù)測值與真實值相比較，最小絕對偏差為0.01 mg/ml，最大絕對偏差為0.21 mg/ml，平均偏差為0.08 mg/ml；最小相對偏差為0.5 %，最大相對偏差4.7 %，平均相對偏差為2.3 %。通常，近紅外快檢方法的偏差上限要求為5 %，因此，本次所建立的模型對驗證集的預(yù)測誤差均滿足快檢要求。進一步，將驗證集的預(yù)測值與真實值在95 %的置信區(qū)間內(nèi)進行配對t-檢驗的結(jié)果顯示，在95 %的置信區(qū)間內(nèi)，P值為1.691，大于0.05，這說明表明本次建模的預(yù)測結(jié)果與法定方法沒有明顯差別。

表3 模型對樣品集的預(yù)測結(jié)果

3.3.2 專屬性 結(jié)果見表4。所有樣品的馬氏距離均小于0.17，全部通過測試。所有樣品的馬氏距離均大于模型限定值，全部未通過測試，詳見表4，說明本次所建立的燈盞花素注射液定量模型專屬性良好。

表4 模型專屬性

3.3.3 線性 本研究所建立方法的線性方程為：Y=0.9486X+0.31，r=0.994，r越接近1表明預(yù)測值越接近于真實值。近紅外二級方法，通常r大于0.95即可滿足近紅外快檢要求，故本方法的線性良好。

3.3.4 精密度 本文以重復(fù)性和中間精密度兩方面評價精密度。重復(fù)性試驗中，真實值為2.1126 mg/ml，6次測定的平均值為2.1071 mg/ml，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.17 mg/ml，置信區(qū)間1.9272～2.2781 mg/ml。中間精密度試驗中，真實值為2.1021 mg/ml，6次結(jié)果的平均值為2.1953 mg/ml，標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2 mg/ml，對測定結(jié)果進行方差分析，得P＞0.05。以上結(jié)果表明所建方法的精密度良好。

4 結(jié)論

本研究基于近紅外光譜分析技術(shù)結(jié)合PLS建立了快速測定燈盞花素注射液含量的方法。所建模型可對全國范圍內(nèi)不同生產(chǎn)企業(yè)的燈盞花素注射液進行定性和定量。中藥注射液含量較低，且建模樣本含量范圍較窄，通過實驗室自制補充了梯度濃度的樣品，最終所建模型的預(yù)測準(zhǔn)確性及耐用性均良好，適用于藥品快速篩查及一線藥品質(zhì)量控制，具有推廣應(yīng)用價值。同時為近紅外光譜分析技術(shù)在中藥注射液定量分析方面的應(yīng)用提供了參考。