王鸞鸞，孫曉霞，王國偉，孫令驍，車國喜，劉香東，劉成虎

（山東省醫(yī)療器械產(chǎn)品質(zhì)量檢驗中心，國家藥品監(jiān)督管理局生物材料器械安全性評價重點實驗室，國家藥品監(jiān)督管理局藥品包裝材料質(zhì)量控制重點實驗室，山東省醫(yī)療器械生物學(xué)評價重點實驗室，山東 濟(jì)南 250101）

遺傳毒性試驗主要通過檢測兩類主要遺傳損傷：基因突變（點突變）和染色體損傷（結(jié)構(gòu)畸變等），來確定醫(yī)療器械（材料）或其浸提液等物理、化學(xué)和生物因素產(chǎn)生遺傳物質(zhì)損傷并導(dǎo)致遺傳性狀改變的能力。體外微核試驗以微核作為遺傳毒性檢測終點，可用于染色體斷裂劑和非整倍體誘導(dǎo)劑的檢測，檢測終點明確，且方法簡便、易于開展，在食品、醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)等領(lǐng)域遺傳損傷的早期評價中得到廣泛應(yīng)用。本文根據(jù)GB/T 16886.12-2017中樣品制備方法，采用雙介質(zhì)制備一次性使用結(jié)扎夾的供試品溶液，同時采用細(xì)胞分裂阻滯法和流式細(xì)胞術(shù)法評價一次性使用結(jié)扎夾的遺傳毒性，對流式細(xì)胞術(shù)法和細(xì)胞分裂阻滯法的結(jié)果進(jìn)行比較，為流式細(xì)胞術(shù)在遺傳毒性體外微核檢測標(biāo)準(zhǔn)化的建立，提供可靠的依據(jù)。

1 儀器和材料

1.1 儀器

BSA822電子天平（Sartorius）；ZQZYCF振蕩培養(yǎng)箱（上海知楚）；DP73正置顯微鏡（Olympus）；3-18KS臺式高速分冷凍離心機(jī)（Sigma）；CytoFLEX流式細(xì)胞儀（Beckman）。

1.2 材料

某公司生產(chǎn)的一次性結(jié)扎夾（批號1810020）；In Vitro MicroFlow Plus Kit（BD公司）；RPMI培養(yǎng)基（Hyclone）；新生牛血清（浙江天杭）；胰酶（Hyclone）；雙抗（Hyclone）；環(huán)磷酰胺（CP，Sigma）；絲裂霉素C（MMC，Sigma）；胞漿阻斷劑（CytoB，Sigma）；甲醇（分析純，國藥集團(tuán)）；冰醋酸（分析純，國藥集團(tuán)）；姬姆薩染液（Sigma）。

1.3 細(xì)胞

中國倉鼠肺（CHL）細(xì)胞，購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會昆明細(xì)胞庫。培養(yǎng)于含10 %新生牛血清的RPMI培養(yǎng)基，5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。試驗用細(xì)胞均處于對數(shù)生長期。

1.4 代謝活化系統(tǒng)

哺乳動物微粒體酶（S9）購自Moltox分子毒理學(xué)股份有限公司，與輔助因子混合后使用，S9的終濃度為10 %，臨用前配制。

2 方法

2.1 供試品溶液制備[1]

按GB/T16886.12-2017的規(guī)定，按4 g/20 ml的比例，將一次性使用結(jié)扎夾分別置于0.9 %氯化鈉注射液（SC）和含血清細(xì)胞培養(yǎng)基中，于（37±1） ℃、60 r/min振蕩浸提（72±2）h，制備供試品溶液。介質(zhì)對照為不含供試品的SC和含血清細(xì)胞培養(yǎng)基，同法制備。陽性對照為0.6 μg/ml MMC（無活化代謝系統(tǒng)短期接觸，-S9/6 h）、0.4 μg/ml MMC（無活化代謝系統(tǒng)長期接觸，-S9/24 h）及60 μg/ml CP（活化代謝系統(tǒng)短期接觸，+S9/6 h）。

2.2 供試品溶液處理細(xì)胞[2]

取對數(shù)生長期的CHL細(xì)胞，胰酶消化后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個/ml，接種至6孔板，培養(yǎng)過夜后，棄去培養(yǎng)基，分為-S9/6 h組、-S9/24 h組和+S9/6 h組。共孵育24 h后收獲細(xì)胞并進(jìn)行微核檢測。

2.3 細(xì)胞分裂阻滯法檢測

采用體外雙核試驗，人工閱片檢驗。在細(xì)胞分裂期前加入Cyto B（終濃度為5 μg/ml）以阻滯細(xì)胞質(zhì)分裂，形成雙核細(xì)胞，從而可在完成一次細(xì)胞分裂的細(xì)胞中進(jìn)行微核的識別及微核發(fā)生率的選擇性分析。閱片前用5 %姬姆薩染色。每組至少分析500個細(xì)胞，用復(fù)制指數(shù)（replication index，RI）評價供試品溶液的細(xì)胞毒性，試驗用供試品溶液濃度為與陰性對照相比RI降低（45±5）%的濃度，試驗組和對照組各分析2000個完整的雙核細(xì)胞。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測

根據(jù)In Vitro MicroFlow Plus Kit試劑盒操作步驟進(jìn)行。采用疊氮溴化乙錠（EMA）和死細(xì)胞核酸染料（SYTOX Green）雙染料染色的方法區(qū)分凋亡、壞死和正常細(xì)胞，排除凋亡或壞死細(xì)胞對試驗結(jié)果的影響。為保證需要的細(xì)胞都在邏輯門內(nèi)，在檢測前先用介質(zhì)對照調(diào)試模板，每組至少分析20 000個細(xì)胞。

2.5 結(jié)果分析與評價

采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，微核率比較使用Fisher精確概率法、四格表卡方檢驗，以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞分裂阻滯法體外微核試驗結(jié)果

含微核的雙核細(xì)胞實例見圖1。在有和無S9代謝活化系統(tǒng)的情況下，所有試驗組的RI均大于55 %，兩種介質(zhì)的雙核細(xì)胞微核率與介質(zhì)對照相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），陽性對照組結(jié)果均顯著高于介質(zhì)對照組（見表1），表明該供試品溶液無致誘變性。

表1 細(xì)胞分裂阻滯法體外微核試驗結(jié)果

圖 1 含不同數(shù)目微核的雙核細(xì)胞實例

3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果

在有和無S9代謝活化系統(tǒng)的情況下，SC供試品溶液（圖b1～3）和含血清培養(yǎng)基供試品溶液（圖b4～6）的細(xì)胞微核率與介質(zhì)對照（圖a1～6）相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），陽性對照（圖c1～3）與介質(zhì)對照相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明該供試品溶液無致誘變性。各組微核率的數(shù)值見表2。

表 2 流式細(xì)胞術(shù)體外微核結(jié)果

4 討論

體外微核試驗是檢測醫(yī)療器械是否有遺傳毒性的重要方法之一[3]。目前流式細(xì)胞術(shù)檢測體外微核的CHO細(xì)胞試驗數(shù)據(jù)相對較多[4-6]，但CHL細(xì)胞的相關(guān)數(shù)據(jù)很少。本實驗室已根據(jù)YY/T 0870.6-2019，采用CHL細(xì)胞分裂阻滯法檢測微核，并在本研究中首次將流式細(xì)胞術(shù)體外微核檢測應(yīng)用于醫(yī)療器械的遺傳毒性檢測，獲得CHL細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)體外微核試驗數(shù)據(jù)，填補(bǔ)了該方法在醫(yī)療器械檢測應(yīng)用中的空白。

根據(jù)GB/T 16886.12-2017的規(guī)定，一次性使用結(jié)扎夾屬于不規(guī)則固體產(chǎn)品，選擇0.2 g/ml的浸提比例，選用（37±1）℃，（72±2）h，60 r/min條件下浸提，用于遺傳毒性試驗。結(jié)果顯示，每組的RI值顯示此一次性結(jié)扎夾沒有細(xì)胞毒性，故只對100 %濃度供試品溶液進(jìn)行分析。細(xì)胞分裂阻滯法結(jié)果顯示，無S9陽性對照（MMC作為陽性對照物）的微核率是陰性對照的3倍左右，有S9時陽性對照（CP作為陽性對照物）的微核率約為陰性對照的4倍，表明該方法體系的合理性。每組微核率與介質(zhì)對照相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。流式細(xì)胞儀術(shù)結(jié)果顯示，無S9陽性對照（MMC作為陽性對照物）的微核率是陰性對照的4倍左右，有S9時陽性對照（CP作為陽性對照物）的微核率約為陰性對照的5倍，體系成立。在有和無S9的情況下，兩種供試品溶液的微核率與對照相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，且微核率與細(xì)胞分裂阻滯法檢測結(jié)果一致，即此供試品溶液在本試驗條件下對CHL細(xì)胞無誘變性。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果

本研究根據(jù)GB/T16886.3-2019中遺傳毒性檢測方法進(jìn)行，細(xì)胞分裂阻滯法和流式細(xì)胞術(shù)兩種體外微核檢測方法在有和無活化代謝系統(tǒng)條件下，一次性使用結(jié)扎夾的試驗結(jié)果一致，與介質(zhì)對照相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，陽性組的微核率為介質(zhì)對照的3～5倍，表明兩種方法均可應(yīng)用于醫(yī)療器械遺傳毒性的檢測。細(xì)胞分裂阻滯法人工閱片首先要識別雙核細(xì)胞，然后判斷微核[7]。雙核細(xì)胞中無論有一個微核還是多個微核（圖1），在計數(shù)發(fā)生畸變的細(xì)胞時都按一個細(xì)胞進(jìn)行計算統(tǒng)計。人工讀片容易受閱片人的專業(yè)知識、日常積累的經(jīng)驗及主觀因素的影響。相比于細(xì)胞分裂阻滯法，流式細(xì)胞術(shù)通過雙熒光法檢測，先用EMA染色凋亡或壞死的細(xì)胞，然后經(jīng)RNA酶及細(xì)胞膜裂解液處理后，標(biāo)記SYTOX Green，該方法更具有客觀性，采用EMA和SYTOX Green雙染料染色的方法以區(qū)分凋亡、壞死和正常細(xì)胞，達(dá)到排除凋亡或壞死細(xì)胞對試驗結(jié)果的影響，從而減少產(chǎn)生假陽性結(jié)果的幾率，提高檢測的準(zhǔn)確性和靈敏性，能獲得更全面、可靠的遺傳毒性評價結(jié)果[8]；操作更簡便；可減少人工閱片的誤差；檢測細(xì)胞數(shù)量多，速度快，效率高；統(tǒng)計的樣本量大幅增加，評價結(jié)果更客觀；檢測結(jié)果更直觀，能提供多種細(xì)胞參數(shù)，可檢測細(xì)胞毒性，分辨出非整倍體畸變劑和誘變劑，分析細(xì)胞周期信息，遺傳毒性的作用方式[5]等。

隨著醫(yī)療器械使用范圍和應(yīng)用風(fēng)險的增加，迫切需要更加客觀、科學(xué)的檢測手段來如實、準(zhǔn)確、快速地評價醫(yī)療器械遺傳毒性等生物安全性。本研究能為相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)制定提供可靠依據(jù)，具有重要的參考價值。