程樂達(dá),程 鵬,楊雄飛,王 娟,朱保玉

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔頜面外科，鄭州 450000)

鱗狀細(xì)胞癌約占口腔和口咽部惡性腫瘤的90%?？谇击[癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤。近年來口腔鱗癌的發(fā)病率急劇上升[1-2]。外泌體是由多泡小體形成的大小在50～110 nm的膜小泡，與質(zhì)膜融合后由不同類型的細(xì)胞分泌[3]。外泌體在生理和各種病理?xiàng)l件下傳遞不同水平表達(dá)的信號(hào)分子。在生理狀態(tài)或病理?xiàng)l件下，外泌體的內(nèi)容物能準(zhǔn)確地反映供體細(xì)胞的功能[4]。例如，外泌體將功能性RNA釋放到細(xì)胞外間隙，這些核酸分子可以直接與靶細(xì)胞接觸[5]。microRNAs是一種22個(gè)核苷酸左右的小RNA，是mRNA轉(zhuǎn)錄和翻譯的重要調(diào)節(jié)因子。在先前的報(bào)道中，大量的microRNAs被證明與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展存在密切的關(guān)系[6]。MiR-126-5p在結(jié)直腸癌及肺癌中被報(bào)道作為一種關(guān)鍵的microRNA影響癌癥進(jìn)展[7-8]。但這種microRNA是否可以通過外泌體在細(xì)胞間進(jìn)行傳遞，目前尚無定論。

本研究探索了口腔鱗癌外泌體中miR-126-5p是否對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)功能產(chǎn)生影響。結(jié)果表明miR-126-5p主要集中在外泌體中，并確定了miR-126-5p下游影響的靶蛋白NLRC3，發(fā)現(xiàn)通過外泌體傳輸?shù)膍iR-126-5p可以抑制腫瘤細(xì)胞中NLRC3的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖、遷移及腫瘤生長(zhǎng)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系及主要試劑

HEK293T細(xì)胞，人口腔角質(zhì)細(xì)胞HOK及人口腔鱗癌細(xì)胞SCC4、SCC9均購(gòu)自美國(guó)ATCC菌種保藏庫(kù)。PCR 引物、miR-126-5p mimics和NLRC3 shRNA由金斯瑞生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成，SYBR?Green master mix及cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)TIANGEN公司，LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogeen 公司，雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司，Western blot抗體CD63、GM130購(gòu)自美國(guó)R&D公司，HSP70和NLRC3抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH),羊抗兔及羊抗鼠二抗購(gòu)自優(yōu)寧維生物科技有限公司，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自萬類生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

HEK293T細(xì)胞，人口腔角質(zhì)細(xì)胞HOK及人口腔鱗癌細(xì)胞SCC4、SCC9均培養(yǎng)在DMEM完全培養(yǎng)基中，額外添加10%胎牛血清，37 ℃，5% CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)SCC4細(xì)胞匯合度達(dá)到70%時(shí)，分別將control mimics(miR-126-5p mimics的對(duì)照載體)過表達(dá)載體，miR-126-5p mimics過表達(dá)載體，shRNA對(duì)照過表達(dá)載體，NLRC3 shRNA過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至SCC4細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6 h后更換為含DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 qPCR檢測(cè)miR-126-5p及NLRC3的表達(dá)

用TRIzol 將細(xì)胞裂解來提取總RNA，使用微量核酸儀測(cè)定RNA的純度及濃度；利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒來合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qPCR 檢測(cè)[9]。PCR 引物序列：miR-126-5p F為5′-GACGCCTGTGTGCAAGAT-3′,R為5′-TCCATGAGGTGAGG GTCTC-3′；NLRC3 F為5′-CCCATACATGGATTC TCCACAA-3′，R為5′-CCACTTCCAGATCCTACATCAAG-3′；GADPH F為5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′，R為5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′。反應(yīng)條件：94 ℃條件下預(yù)變性1 min，95 ℃變性5 s，之后在60 ℃復(fù)性30 s，72 ℃條件下延伸60 s，共35 個(gè)循環(huán)。檢查熔解曲線，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-126-5p和NLRC3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 雙熒光素酶報(bào)告基因法鑒定miR-126-5p 與NLRC3的靶向關(guān)系

首先將50 nmol/L的control mimics或miR-126-5p mimics及500 ng的3′UTR-WT或3′UTR-MUT的片段同時(shí)轉(zhuǎn)進(jìn)HEK293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后更換新鮮的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后用裂解緩沖液裂解細(xì)胞，使用雙熒光素酶報(bào)告分析試劑盒檢測(cè)螢火素和海腎熒光素酶活性，利用GloMax?20/20發(fā)光儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.5 Western blot實(shí)驗(yàn)

用含1%苯基甲烷磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解緩沖液提取細(xì)胞和組織樣品的總蛋白，用BCA分析試劑盒測(cè)定其濃度。將細(xì)胞或組織的蛋白質(zhì)與電泳緩沖液混合后，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。隨后，將所有的膜浸泡在5%的脫脂奶粉溶液中，在室溫下封閉1 h。然后，將條帶與相應(yīng)的一抗在4 ℃孵育過夜，然后在室溫下浸泡在適當(dāng)?shù)亩怪? h。最后，用電化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白質(zhì)。

1.6 CCK-8實(shí)驗(yàn)

利用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。將不同組別的細(xì)胞按5×103個(gè)/孔接種到96孔板中，37 ℃孵育，分別在第1、2、3天時(shí)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。細(xì)胞在10 μL完全培養(yǎng)基中加入10 μL的CCK-8試劑，37 ℃孵育2 h，用微量滴度儀在450 nm處測(cè)量吸光度，該吸光度代表存活細(xì)胞的數(shù)量。

1.7 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)

取2×105個(gè)SCC4細(xì)胞加入24孔板至其形成單層鐵壁細(xì)胞后，用槍頭尖端進(jìn)行劃痕，之后加入含外泌體的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。用顯微鏡分別在0、24 h后拍攝圖像。測(cè)量?jī)蓚€(gè)時(shí)間點(diǎn)劃痕的間隙，計(jì)算遷移度[9]。

1.8 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

所有涉及動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)操作均經(jīng)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。BALB/c裸鼠(5～6周齡)購(gòu)自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，隨機(jī)分為PBS治療組(PBS組)、回輸正常細(xì)胞HOK來源的外泌體組(HOK-E組)、回輸腫瘤細(xì)胞SCC-4來源的外泌體組(SCC-4-E組)，每組5只。每只小鼠單側(cè)皮下注射3×106個(gè)細(xì)胞進(jìn)行成瘤實(shí)驗(yàn)。成瘤后每周通過尾靜脈回輸0.5 mg外泌體。用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤，應(yīng)用公式(L×W2)/2計(jì)算體積。第17天，安樂死動(dòng)物，切除腫瘤稱重。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

qPCR、劃痕愈合及Western blot等實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，所有數(shù)據(jù)采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。兩組比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，兩組以上數(shù)據(jù)采用單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-126-5p在口腔鱗癌中的表達(dá)情況

通過分析來自癌癥基因組圖譜(TCGA)的口腔鱗癌miRNA芯片數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)與正?？谇唤M織相比，口腔鱗癌組織中miR-126-5p的表達(dá)上調(diào)(圖1A)。qPCR檢測(cè)結(jié)果表明，miR-126-5p在口腔鱗癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁非腫瘤組織(圖1B)。Kaplan-Meier分析表明，miR-126-5p的高表達(dá)與較差的總體生存率呈正相關(guān)(圖1C，P=0.002)。此外，miR-126-5p在口腔鱗癌細(xì)胞系中的表達(dá)與正常口腔角質(zhì)細(xì)胞相比有顯著上調(diào)(圖1D,P<0.001,t=6.318)。

2.2 口腔鱗癌細(xì)胞外泌體中miR-126-5水平

電鏡觀察外泌體的狀態(tài)(圖2A)，粒度分析表明外泌體的粒徑在80～120 nm(圖2B)，Western blot檢測(cè)表明，外泌體特征蛋白CD63在外泌體中高表達(dá)，而特征蛋白GM130在外泌體中不表達(dá)(圖2C)。檢測(cè)外泌體中的miR-126-5p，結(jié)果表明，腫瘤細(xì)胞來源的外泌體較正常細(xì)胞miR-126-5p水平顯著升高(圖2D,P<0.0001,t=29.17)。

A：TCGA檢測(cè)口腔鱗癌患者腫瘤及正常口腔組織中miR-126-5p的表達(dá)水平；B：miR-126-5p在口腔鱗癌及癌旁組織中的表達(dá)；C：口腔鱗癌中miR-126-5p狀態(tài)與總生存曲線的關(guān)系；D：miR-126-5p在HOK、SCC-4、SCC-9中的表達(dá)。

A：外泌體的電子顯微照片；B:外泌體的顆粒直徑；C:Western blot檢測(cè)外泌體標(biāo)記物CD63和HSP70及細(xì)胞標(biāo)記物GM130；D：miR-126-5p在外泌體中的相對(duì)表達(dá)。

2.3 miR-126-5p下游調(diào)控分子的確定

雙熒光素酶報(bào)告基因法檢測(cè)表明，miR-126-5p的過表達(dá)顯著抑制了3′UTR-WT介導(dǎo)的熒光素酶活性(圖3A,P<0.01,t=6.632)，而miR-126-5p結(jié)合位點(diǎn)的突變消除了這種抑制作用。通過在SCC4細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-126-5p mimics，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中NLRC3表達(dá)降低(圖3B,P<0.01,t=9.127)。同時(shí)，將分離的腫瘤細(xì)胞來源的外泌體與SCC4細(xì)胞共孵育，細(xì)胞中NLRC3的表達(dá)量也降低(圖3C,P<0.01,t=13.23)。

2.4 miR-126-5p通過靶向NLRC3抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移

腫瘤細(xì)胞增殖結(jié)果表明，與腫瘤來源的外泌體共孵育組中腫瘤細(xì)胞的增殖較對(duì)照載體顯著增強(qiáng)(圖4A,P<0.001)，與此同時(shí)，沉默NLRC3基因的腫瘤細(xì)胞較對(duì)照載體而言增殖能力也顯著增強(qiáng)(圖4B,P<0.000 1)。劃痕實(shí)驗(yàn)表明，與外泌體共孵育后，劃痕愈合能力較對(duì)照載體顯著增強(qiáng)(圖4C-D,P<0.000 1,t=35.62)，同時(shí)，NLRC3基因沉默的腫瘤細(xì)胞的劃痕愈合能力也比對(duì)照載體更強(qiáng)(圖4E-F,P<0.000 1,t=53.89)。

2.5 回輸腫瘤細(xì)胞來源的外泌體促進(jìn)小鼠腫瘤生長(zhǎng)

體內(nèi)結(jié)果表明，SCC4-E組小鼠較PBS組小鼠及HOK-E組小鼠而言，腫瘤生長(zhǎng)更快(圖5A,P<0.01)。瘤重結(jié)果也表明，SCC4-E組的小鼠腫瘤的質(zhì)量更大(圖5B,P<0.001,t=16.65)。對(duì)瘤組織進(jìn)行Western blot檢測(cè)，結(jié)果表明SCC4-E組的小鼠較PBS組及HOK-E組小鼠而言，NLRC3的表達(dá)水平顯著降低(圖5C-D,P<0.001,t=22.97)。

A：熒光素酶報(bào)告基因法確定NLRC3是miR-126-5p的靶標(biāo)；B：轉(zhuǎn)染miR-126-5p mimics后NLRC3的相對(duì)表達(dá)；C：外泌體孵育后NLRC3的相對(duì)表達(dá)。

A：腫瘤體積；B：腫瘤重量；C：腫瘤組織中NLRC3水平的Western blot結(jié)果；D：圖C的統(tǒng)計(jì)分析。

3 討 論

大多數(shù)早期和晚期的口腔鱗癌都是手術(shù)治療為主，Ⅲ期或Ⅳ期口腔鱗癌通常需要綜合治療，以手術(shù)為主要手段，輔助放療或放化療，然而晚期口腔鱗癌患者的5年生存率也只有50%[10-11]。因此需要盡可能多的開發(fā)新的療法，如靶向治療、基因療法等，來改變這一現(xiàn)狀。而更加明確的闡明口腔鱗癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制將會(huì)為開發(fā)特定的藥物提供理論支持。

miRNAs通常通過在轉(zhuǎn)錄后負(fù)性調(diào)節(jié)其靶標(biāo)來發(fā)揮其功能[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-126-5p在口腔鱗癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)。miR-126-5p的表達(dá)水平與口腔鱗癌患者的生存期相關(guān)，是口腔鱗癌患者臨床預(yù)后不良的重要指標(biāo)。miR-126-5p可以通過外泌體在腫瘤細(xì)胞之間傳遞，并且可以抑制NLRC3的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及遷移。MTDH、MMP-13和PTHrP已被確定為miR-126-5p的靶標(biāo)[13-15]。這些分子通過調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞骨架來調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和分化，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。同時(shí)，在本實(shí)驗(yàn)中通過下調(diào)NLRC3后，探討了其在口腔鱗癌中的生物學(xué)作用。

外泌體傳遞的手段被認(rèn)為是與細(xì)胞接觸依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和可溶性分子介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)同等重要的細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制[16]。在病理?xiàng)l件下，患病細(xì)胞來源的外泌體通常會(huì)攜帶并轉(zhuǎn)移miRNA，導(dǎo)致細(xì)胞病變和感染[17]。本研究證明，口腔鱗癌細(xì)胞來源的外泌體含有大量的miR-126-5p，因此推測(cè)外泌體通過攜帶miR-126-5p在腫瘤細(xì)胞間進(jìn)行轉(zhuǎn)移，從而影響腫瘤微環(huán)境中的各種細(xì)胞。NLRC3是Nod樣受體家族的成員，是已知的細(xì)胞增殖和凋亡的抑制劑，其特征是通過抑制mTOR來發(fā)揮其作用[18]。有研究表明，NLRC3的過表達(dá)抑制了mTOR信號(hào)通路的激活，抑制了大腸癌細(xì)胞的增殖，缺乏NLRC3的小鼠對(duì)結(jié)腸炎和結(jié)直腸腫瘤高度敏感[19]。通過生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)及雙熒光素酶報(bào)告基因法確定了NLRC3是miR-126-5p 的作用靶點(diǎn)。

miR-126-5p通過外泌體在腫瘤細(xì)胞間進(jìn)行傳遞可以抑制NLRC3的表達(dá)從而促進(jìn)口腔鱗癌的進(jìn)展。因此，深入了解miR-126-5p及NLRC3在口腔鱗癌發(fā)病機(jī)制中的具體作用，將有助于開發(fā)新的口腔鱗癌治療方法。