李 微，曾 飛，由 昆，傅金祥

(沈陽建筑大學(xué)市政與環(huán)境工程學(xué)院，遼寧 沈陽 110168)

大蒜易發(fā)霉變質(zhì)難以長時間儲存，為了改變這些缺點需要將大蒜進行深加工，近年來我國大蒜加工廠逐漸增多，隨著大蒜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，大蒜廢水問題隨之而來，有關(guān)大蒜廢水從2008年到2018年期間一直處于研究階段[1]，還沒有較為理想的處理工藝，大蒜廢水含有高質(zhì)量濃度的有機污染物、氮和磷等，因其含有具有殺菌作用的大蒜素使其更加難處理[2]，現(xiàn)有的處理方法包括物理方法，微電解的方法，活性污泥方法等[3-6]都有著一定的不足，活性污泥法一直是廢水處理研究的熱點，且該方法具有造價低，節(jié)省空間，耐沖擊負荷高等特點，目前，活性污泥法處理高質(zhì)量濃度大蒜加工廢水的研究尚未處于初級研究階段。傅源等[7]研究了活性污泥法處理1 000 mg/L COD質(zhì)量濃度的大蒜廢水，確定了活性污泥法處理大蒜廢水的最佳工藝參數(shù)和影響因素，給出了處理大蒜廢水時活性污泥法自然培菌和接種培菌的方案選擇，實現(xiàn)達標排放。馮露[5]確定了活性污泥法的最佳運行溫度，進水質(zhì)量濃度及污泥形態(tài)等的變化，提出了合理可行的預(yù)處理方案，主要的預(yù)處理方法是以加熱為主。在活性污泥的基礎(chǔ)上，鄭慶柱等[8]采用CABR+SBR的聯(lián)合工藝，縮短了啟動時間并且研究了該組合工藝對大蒜廢水各指標的去除效果。針對大蒜廢水的研究普遍有機負荷低，預(yù)處理費用高等問題，筆者研究了活性污泥法處理大蒜廢水的可行性，對比研究了自然培菌和接種培菌兩種培養(yǎng)方式對大蒜廢水的處理效果，結(jié)合高通量技術(shù)分析兩種不同馴化方式下污泥的菌群結(jié)構(gòu)，旨在為處理高質(zhì)量濃度大蒜加工廢水快速馴化方法，實現(xiàn)反應(yīng)器的快速啟動，推動處理高質(zhì)量濃度大蒜加工廢水技術(shù)實際應(yīng)用提供支持。

1 試 驗

1.1 試驗水質(zhì)

模擬廢水主要是通過模擬實際生產(chǎn)加工中切片清洗和離心分離產(chǎn)生的高質(zhì)量濃度大蒜加工廢水，將市場購來大蒜用榨汁機榨汁備用，配置模擬廢水水質(zhì)如表1所示。

表1 模擬大蒜加工廢水水質(zhì)Table 1 Simulated wastewater quality in garlic processing

1.2 分析項目與檢測方法

試驗檢測項目及其檢測方法如表2所示。

表2 主要分析項目及檢測方法Table 2 Main analytical items and methods of determination

高通量測序分析方法:使用Qubit 3.0 DNA檢測試劑盒精確定量基因組DNA，以確定PCR反應(yīng)應(yīng)加入的DNA量，采用引物對341F(CCTACGGGNGGCWGCAG)與805R(GACTACHVGGGTATCTAATCC)對16SrDNA基于V3-V4區(qū)序列進行擴增，第一輪擴增PCR體系為30 μL，包括2×Taqmaster Mix 15 μL,前后引物各1.0 μL，細菌組的DNA10-20 ng，最后以H2O補足至30 μL,配置好的PCR體系按照擴增條件為：94 ℃首次變性3 min，94 ℃、30 s，45 ℃、20 s,65 ℃、30 s進行5個循環(huán)；94 ℃、20 s，55 ℃、20 s，72 ℃、30 s進行20個循環(huán)；在72 ℃下延伸5 min直到10 ℃,隨后以Illumina橋式PCR作為引物，開始第二輪擴增，PCR體系和第一輪擴增相同為30 μL，同時也包括2×Taqmaster Mix 15 μL,前后引物各1.0 μL，第一次擴增得到產(chǎn)物20ng，最后以H2O補足至30 μL,配置好的PCR體系按照擴增條件為：95 ℃首次變性3 min，94 ℃、20 s，55 ℃、20 s,72 ℃、30 s進行5個循環(huán)；在72 ℃下延伸5 min至10 ℃后，將擴增的樣品進行瓊脂糖凝膠電泳，純化擴增產(chǎn)物，然后定量混合，最終的上機測得值為20 pmol，最后樣品通過Miseq測序技術(shù)進行高通量測序。

1.3 試驗裝置

缺氧/好氧SBR反應(yīng)器如圖1所示。

1.電動攪拌機；2.攪拌槳；3.微孔曝氣盤；4.氣體流量計；5.空氣泵；6.時控開關(guān)；7.排水接樣口；8.排泥口；9.pH在線監(jiān)測儀；10.DO在線監(jiān)測儀；11.進水箱；12.電磁閥；13.水泵；14.進水口。

圖1 缺氧/好氧SBR反應(yīng)器
Fig.1 Anoxic/aerobic SBR reactor

試驗采用兩個有效容積分別為15 L的有機玻璃柱來模擬缺氧/好氧交替運行的SBR反應(yīng)器A和B。由于兩個反應(yīng)器在運行方式和外部結(jié)構(gòu)上完全相同，故取其中一個做以說明。反應(yīng)器頂部裝有時控開關(guān)和電動攪拌器,在反應(yīng)器外側(cè)每隔10 cm設(shè)有一個接樣口，底部設(shè)有連接空氣泵和時控開關(guān)的橡膠曝氣盤，同時還外接了氣體流量計用以控制水中溶解氧含量，在最底端設(shè)有兩個排泥口，同時還設(shè)有溶解氧在線監(jiān)測儀和pH在線監(jiān)測儀。

1.4 試驗運行方式

接種培菌方式主要是將取自城市污水處理廠的污泥去培養(yǎng)和馴化出最適合處理大蒜廢水的微生物以及菌群類型[6]，將質(zhì)量濃度為4 000 mg/L左右的種泥接種在A號SBR反應(yīng)器中，調(diào)節(jié)進水大蒜廢水pH在7.0左右，以瞬時進水10 min、厭氧3 h、好氧7 h、沉淀45 min、排水5 min的運行模式每天運行兩個個周期，連續(xù)培養(yǎng)了60 d。

自然培菌法與接種培菌法最主要的區(qū)別就是沒有外來種泥的介入，利用大蒜廢水中本身具有的少量微生物馴化出能夠適應(yīng)大蒜廢水的微生物和菌群類型[6]，起初將COD質(zhì)量濃度為5 000 mg/L左右的大蒜加工廢水注入B號SBR反應(yīng)器中，以厭氧3 h、好氧7 h、沉淀45 min的運行模式反復(fù)運行，經(jīng)過21 d的往復(fù)培養(yǎng)，在反應(yīng)器底部發(fā)現(xiàn)少量沉積物，然后以瞬時進水10 min、厭氧3 h、好氧7 h、沉淀45 min、排水5 min的運行模式每天運行兩個周期，進水大蒜廢水COD質(zhì)量濃度范圍控制在5 000～9 000 mg/L,連續(xù)運行了40 d。

2 結(jié)果分析

2.1 兩種培菌方式對大蒜廢水中COD的去除效果

兩種培菌方式對高質(zhì)量濃度大蒜廢水COD去除效果如圖2所示。從圖2(a)可以看出，接種培菌法初始進水COD質(zhì)量濃度為60 mg/L，運行前7 d進水COD質(zhì)量濃度每次遞增20 mg/L左右，到第7天時COD質(zhì)量濃度由142.76 mg/L降到了20.21 mg/L，COD去除率為85.84%，COD去除率逐漸提高，同時污泥由棕黑色逐漸變?yōu)辄S褐色，表明污泥逐漸適應(yīng)了大蒜廢水水質(zhì)，并且其降解能力也逐漸提高，污泥性狀穩(wěn)定且沉降性較好。大蒜加工廢水COD去除率穩(wěn)定在85%以上認定接種培菌法污泥馴化成功[ 8]。從第8天起，進水COD質(zhì)量濃度每天約增加100 mg/L，反應(yīng)進行第48天時，COD質(zhì)量濃度提高6 129.31 mg/L降到了98.29 mg/L，廢水COD去除率可達98.40%，進水COD廢水去除率不斷提高，最終穩(wěn)定在97%左右。導(dǎo)致COD去除率下降的原因是大蒜素含量隨著蒜汁比例的增加而增加，由于大蒜素的殺菌作用影響了生物活性使得COD去除率有所下降[9]。

從圖2(b)可以看出，SBR啟動21 d后，反應(yīng)器底部出現(xiàn)少量沉積物，自然培菌法開始進水，最初進水COD質(zhì)量濃度為5 000 mg/L，試驗進水COD每天遞增100 mg/L左右，第24天時廢水COD質(zhì)量濃度由5180.96 mg/L降到672.186 mg/L，COD去除率為87.03%，COD去除率逐漸提高，且沉積物由白色變?yōu)榫G色在變?yōu)辄S褐色且沉降性較好，至此自然馴化培菌方式啟動成功。第30天時廢水COD質(zhì)量濃度由6 096.68 mg/L降到了106.18 mg/L，COD去除率為98.42%，隨著進水COD質(zhì)量濃度的不斷提高，COD去除率開始下降，并穩(wěn)定在88%左右。下降的原因可能是廢水中大蒜素含量增加導(dǎo)致。

圖2 兩種接種方式對COD的去除效果Fig.2 Removal effect of COD in the reactors with two vaccination methods

2.2 兩種培菌方法對廢水中TN的去除效果

圖3 兩種接種方法對TN的去除效果Fig.3 Removal effect of TN in the reactors with two vaccination methods

2.3 兩種培菌方法對廢水中TP的去除效果

生物除磷主要是由聚磷菌在厭氧條件自身的ATP水解為H3PO4和能量形成ADP，然后在好氧條件下由于聚磷菌在透膜酶的催化作用下利用厭氧過程產(chǎn)生能量從外部攝取厭氧過程產(chǎn)生H3PO4，在這個過程中一部分與ADP將結(jié)合形成ATP，另一部分將合成聚磷酸鹽儲存在細胞內(nèi)，實現(xiàn)吸磷的作用[12]。為了徹底將磷從系統(tǒng)內(nèi)排除，會不定期地通過預(yù)留排泥口將富余的污泥排除，以此達到除磷的目的。具體TP的處理效果如圖4所示。

圖4 兩種接種方法對TP的去除效果Fig.4 Removal effect of TP in the reactors with two vaccination methods

反應(yīng)器A、B均在厭氧好氧條件下交替運行，聚磷菌在好氧狀態(tài)下吸磷，停止曝氣后排出上清液，聚磷菌吸收的磷隨剩余污泥排放，又因為A、B反應(yīng)器中污泥質(zhì)量濃度較高，聚磷菌吸磷效果明顯，因此A、B反應(yīng)器對TP 的去除率都較高[13]。由圖4(a)可知，在A、B反應(yīng)器進水COD質(zhì)量濃度相同的情況下，進水TP的質(zhì)量濃度隨著大蒜汁比例增加而增加，TP的進水為8～14 mg/L，反應(yīng)器A在連續(xù)運行60 d后出水TP平均質(zhì)量濃度為0.27 mg/L，此時TP的平均去除率為94.98%。對比圖4(b)，反應(yīng)器B在連續(xù)運行60 d后，出水TP的平均質(zhì)量濃度為0.37 mg/L，TP的平均去除率為94.01%，和反應(yīng)器A的去除效果相近，都可以達到排放標準。

2.4 微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)分析

2.4.1 微生物多樣性

試驗分別對污水廠種泥(H1),接種培菌法馴化第60 d的污泥(H2),自然培菌法馴化成熟的污泥(H3)，進行了高通量測序，經(jīng)過降噪等過濾后共獲得了195 811條有效序列，其中H1、H2、H3樣品中有效序列分別為105 289、4 529、44 993條，各樣品的微生物多樣性指數(shù)如表3所示。覆蓋率反映測序結(jié)果是否代表樣本的實際情況，值越高則樣本中序列未被檢測到的概率越低[14]，3個樣品的覆蓋率都大于0.95，這說明所有樣品中測序所得序列能夠覆蓋絕大部分區(qū)域，測序結(jié)果可以反應(yīng)樣品的真實情況。在生態(tài)學(xué)中物種通常用ACE(豐度指數(shù))和Chao1(豐富度估計量)來反應(yīng)菌群豐度[15]，在相似度為97%的條件下，ACE指數(shù)H1>H3>H2,Chao1指數(shù)H1>H3>H2，實際獲得OTU(非靶區(qū)域序列數(shù)目)為H1>H2>H3，由于測序深度的原因，ACE指數(shù)與Chao1指數(shù)與實際獲得的OTU指數(shù)并不完全一致。由于每一個OTU通常被視為一個微生物物種，所以試驗以O(shè)TU指數(shù)為參比進行分析，從3個樣品的OTU指數(shù)可以發(fā)現(xiàn)，H3生物豐度最低，H1的OTU指數(shù)遠遠大于H2的OTU指數(shù)，這是因為大蒜廢水中含有的大蒜素對細菌具有滅活和抑制的作用，而H2的OTU指數(shù)要大于H3的OTU指數(shù)，這是因為從污水廠取來的接種污泥本身含有的細菌總數(shù)要大于高質(zhì)量濃度大蒜廢水中所含的細菌總數(shù)。

Shannon(多樣性指數(shù))和Simpson(辛普森多樣性指數(shù))反映樣品微生物多樣性的常用指標,Shannon值越大，微生物多樣性越高，反之Simpson指數(shù)值越小大，微生物多樣性越低[15],從表3可以看出Shannon指數(shù)H1>H2>H3,而Simpson指數(shù)H1

表3 樣品多樣性指數(shù)表Table 3 Sample diversity index table

2.4.2 微生物群落結(jié)構(gòu)

表4為經(jīng)過Miseq高通量測序，經(jīng)過分析后得到的樣品H1、H2、H3中細菌門的分類情況?？梢钥闯?，3個樣品中的細菌微生物豐度較大，但主要菌門有所差異但也比較相似，在H1中，Proteobacteria所占比例最高，達到了48.53%，其次是Bacteroidetes和Planctomycetes，這3個菌門占了總數(shù)的73.15%。而在H2中，Proteobacteria所占比例依然是最高，達到了45.49%，其次是CandidatusSaccharibacteria和Bacteroidetes這3個菌門占了總數(shù)的81.07%。在H3中，Proteobacteria所占比例依然是最高，達到了52.81%，其次是Bacteroidetes和Actinobacteria，這3個菌門占了總數(shù)的91.95%，其中Proteobacteria是活性污泥中比較常見的細菌[16-17]，金浩等[18]研究了污水處理廠活性污泥的微生物多樣性，結(jié)果表明活性污泥中Proteobacteria菌門比例為91.9%。由于接種活性污泥是從污水廠取回后閑置了一段時間，低能供應(yīng)和缺氧/厭氧環(huán)境在一定程度上改變了污泥中微生物群落結(jié)構(gòu)?？梢钥闯鲈囼炘诜磻?yīng)器運行過程中Planctomycetes、CandidatusSaccharibacteria以及Actinobacteria逐漸成為系統(tǒng)內(nèi)的主要菌門，對污染物去除發(fā)揮各自的作用。此外，對比H1與H2，CandidatusSaccharibacteria菌門所占比列逐漸提高，從0.66%逐漸增長到24.05%，原有的Proteobacteria，Bacteroidetes和Planctomycetes菌門比列都有所下降，這說明高質(zhì)量濃度大蒜加工廢水有利于CandidatusSaccharibacteria菌門的生長，相反對Proteobacteria，Bacteroidetes和Planctomycetes菌門的生長都有一定的影響。從表4可以看出H2和H3活性污泥的微生物群落結(jié)構(gòu)，在H3中Proteobacteria，Bacteroidetes和Actinobacteria菌門所占數(shù)均大于H2中數(shù)量，其中Actinobacteria菌門最為顯著，前者為1.72%，后者為18.04%，說明自然培養(yǎng)法更有利Actinobacteria菌門的生長。而CandidatusSaccharibacteria菌門在接種污泥系統(tǒng)中比例明顯高于自然培養(yǎng)系統(tǒng)，說明自然培菌法所馴化的活性污泥不利于CandidatusSaccharibacteria菌門的生長，反映了兩種培菌馴化方式在微生物結(jié)構(gòu)上的差異[19-21]。

表4 門水平微生物群落結(jié)構(gòu)Table 4 In phylum level microbial community structure

3 結(jié) 論

(1)接種培菌法啟動只需7 d，而自然培菌法啟動要24 d才能完成。

(2)接種培菌法和自然培菌法處理模擬大蒜廢水對TN和TP的去除效能相近，對COD去除效果存在差異，接種培菌法處理模擬大蒜廢水COD最高閾值為6 129.31 mg/L，出水可以達到國家二級排放標準要求，自然培菌水則達不到要求。

(3)在“門”和“綱”級別上接種培菌法的污泥樣品分別以Proteobacteria和CandidatusSaccharibacteria兩個菌門和Alphaproteobacteria、unclassifie以及Planctomyceti 3個菌綱占主導(dǎo)而自然培菌法的污泥樣品分別以Proteobacteria、Bacteroidetes和Actinobacteria3個菌門和Alphaproteobacteria、Actinobacteria、Flavobacteriia 3個菌綱占主導(dǎo)。