侯艷茹，蘇 琳，侯普馨，白艷蘋，孫 冰，趙麗華，黃凱飚，呂 科，靳 燁,

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.烏拉特中旗農(nóng)牧和科技局，內(nèi)蒙古 烏拉特中旗 015300；3.內(nèi)蒙古草原晶鑫食品有限責(zé)任公司，內(nèi)蒙古 巴彥淖爾 015000）

蘇尼特羊是內(nèi)蒙古地區(qū)優(yōu)良的肉羊品種，具有產(chǎn)肉量高、肉質(zhì)細(xì)嫩、膻味小、易消化、營養(yǎng)價(jià)值高等特點(diǎn)，受到廣大消費(fèi)者的喜愛[1]。隨著草場的嚴(yán)重退化，國家出臺(tái)了很多禁牧、限牧的政策，飼養(yǎng)方式由傳統(tǒng)放牧逐步轉(zhuǎn)為舍飼模式。因此，放牧和舍飼這兩種飼養(yǎng)方式下蘇尼特羊肉品質(zhì)的差異也成為廣大消費(fèi)者所關(guān)注的熱點(diǎn)問題。肌纖維是肌肉組織的基本組成單位，其數(shù)目在動(dòng)物出生時(shí)已基本固定，但其類型之間可以互相轉(zhuǎn)化，遵循I型→IIA型→IIX型→IIB型的順序，是決定肉品質(zhì)的一個(gè)重要因素。飼養(yǎng)方式也會(huì)對(duì)動(dòng)物肌肉中肌纖維的組成產(chǎn)生影響，研究表明，與舍內(nèi)飼養(yǎng)豬相比，散養(yǎng)豬的肌肉組織中IIA型肌纖維含量較多，而IIB和IIX型肌纖維含量較少[2]。閆林祥等研究發(fā)現(xiàn)，與工廠集約化飼養(yǎng)相比，放養(yǎng)的多浪羊背最長肌的肌原纖維密度較小、直徑較大[3]。可見，飼養(yǎng)方式對(duì)肌纖維類型的組成有重要影響，而肌纖維的組成會(huì)影響肉品品質(zhì)，因此，研究肌纖維類型及其轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)機(jī)制是改善肉品品質(zhì)的重要途徑。肌纖維類型的轉(zhuǎn)化受到多種功能基因或相關(guān)信號(hào)途徑的影響，如Ca2+信號(hào)途徑、一磷酸腺苷激活的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）信號(hào)途徑、miRNA/anti-senseRNA調(diào)控等[4]。其中AMPK是細(xì)胞能量調(diào)節(jié)器，可以磷酸化其下游靶分子受體共激活因子——過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助活化因子α（peroxisome proliferator-activated receptor γ co-activator-1 alpha，PGC-1α），促進(jìn)線粒體生物合成、有氧代謝以及氧化型肌纖維的生成[5]。

因此，本實(shí)驗(yàn)以不同飼養(yǎng)方式下（放牧和舍飼）6 月齡蘇尼特羊背最長肌為實(shí)驗(yàn)材料，分析其肉品質(zhì)指標(biāo)的差異性，并利用ATPase染色法和肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MyHC）的mRNA表達(dá)量對(duì)肌纖維類型進(jìn)行劃分，同時(shí)對(duì)肌纖維轉(zhuǎn)化相關(guān)調(diào)控基因AMPK、PGC-1α、細(xì)胞色素c氧化酶IV（cytochrome c oxidase IV，COX IV）的mRNA表達(dá)量以及相關(guān)代謝酶（蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase，MDH）、琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）、乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH））活力進(jìn)行分析，旨在為蘇尼特羊肉肌纖維類型及其轉(zhuǎn)化機(jī)制提供參考，為改善肉品品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

選取來自內(nèi)蒙古巴彥淖爾市烏拉特中旗哈拉圖嘎查順?biāo)燹r(nóng)牧農(nóng)業(yè)合作社的體況良好、平均體質(zhì)量為（18.34±1.86）kg的3 月齡蘇尼特羊24 只，隨機(jī)分為兩組（放牧組和舍飼組），每組12 只，公母各半。放牧組以采食沙生針茅、堿韭、矮錦雞兒、芨芨草等新鮮牧草為主。舍飼組以飼喂玉米秸稈、葵花餅、發(fā)酵青貯以及育肥飼料為主。預(yù)實(shí)驗(yàn)期為7 d，正式實(shí)驗(yàn)期為90 d，實(shí)驗(yàn)期間羊自由飲水。羊屠宰后取背最長肌作為研究對(duì)象。

異戊烷（分析純） 阿法埃莎（天津）化學(xué)有限公司；硫化銨（分析純） 上海麥克林生化科技有限公司；腺苷-5’-三磷酸二鈉鹽（分析純） 北京酷來搏科技有限公司；三氯甲烷（分析純） 北京化工廠；異丙醇（分析純） 上海振興化工二廠有限公司；Tris-Base、醋酸鈉、氯化鈣、氯化鈷 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；RNAiso Plus RNA提取裂解液、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TB GreenTMPremix ExTaqTMII（Tli RNaseH Plus）實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒 大連寶生物工程有限公司；DNase/RNase-free無菌水 北京天根生物技術(shù)有限責(zé)任公司；MDH測定試劑盒、SDH測定試劑盒、LDH測定試劑盒、總蛋白定量測定試劑盒（BCA法） 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

MEV冰凍切片機(jī) 德國SLEE公司；5417R低溫臺(tái)式冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf生物公司；LightCycler96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司；BG-power 3500型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、水平電泳槽 北京百晶生物技術(shù)有限公司；Biometra PCR擴(kuò)增儀 北京北方華奧貿(mào)易有限責(zé)任公司；凝膠成像分析系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；pH-STAR型胴體pH值直測儀 德國Matthaus公司；TC-P2A全自動(dòng)測色色差計(jì)上海生物生化實(shí)驗(yàn)儀器公司；CLM-3型嫩度儀 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 肉品質(zhì)指標(biāo)的測定

1.3.1.1 pH值的測定

屠宰后45 min時(shí)，使用pH-STAR型胴體pH值直測儀測量背最長肌初始pH值，記為pH0；靜止排酸24 h后測背最長肌終pH值，記為pH24。

1.3.1.2 色澤的測定

使用TC-P2A全自動(dòng)測色色差計(jì)對(duì)背最長肌色澤進(jìn)行測定，L*值表示亮度，b*值表示黃藍(lán)度，a*值表示紅綠度。每個(gè)樣品選取3 個(gè)位置，重復(fù)測定后取平均值。

1.3.1.3 嫩度的測定

將4 ℃保存的背最長肌樣品密封后放在75 ℃的水浴中加熱45 min，然后取出冷卻，至室溫后沿著肌纖維的方向?qū)⑷鈮K切成3 cm×1 cm×1 cm的條狀，使用CLM-3型嫩度儀對(duì)剪切力進(jìn)行測定，每個(gè)肌肉樣本重復(fù)測定6 次后取平均值。

1.3.1.4 蒸煮損失率的測定

實(shí)驗(yàn)羊屠宰靜置排酸24 h后，稱取約30～50 g的肉塊，記為m1/g，利用密封袋密封后，以85 ℃的溫度在水浴鍋中煮40 min，取出。待肉塊冷卻后，濾紙吸干表面水分，再次稱量并記為m2/g。蒸煮損失率按下式計(jì)算。

1.3.2 肌纖維組織特性測定

實(shí)驗(yàn)羊屠宰45 min內(nèi)，將背最長肌沿著肌纖維的方向切成0.5 cm×0.5 cm×1 cm大小的肉塊，放入經(jīng)液氮預(yù)冷后的異戊烷中脫水干燥30 s，再放入液氮中速凍，用干冰保存并帶回實(shí)驗(yàn)室后置于-80 ℃的冰箱中保存，用于肌纖維組織特性測定。

將肌纖維樣品置于-25 ℃冰凍切片機(jī)中，將其橫截面切成10 μm厚薄片。用ATPase（pH 4.60～4.65）染色法進(jìn)行染色[6]。在10×10 倍的顯微鏡下進(jìn)行觀察，圖像用Qwin V3彩圖分析軟件分析肌纖維特性的各項(xiàng)指標(biāo)，肌纖維總數(shù)不少于1 000 根。

1.3.3 基因表達(dá)量的測定

1.3.3.1 樣品的采集

實(shí)驗(yàn)羊屠宰后45 min內(nèi)取背最長肌，剪成100 mg左右的小塊裝入無酶無菌的凍存管中，立即放入液氮中冷凍，帶回后實(shí)驗(yàn)室保存于-80 ℃冰箱中，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)用材料。

1.3.3.2 總RNA的提取及測定

利用RNAiso Plus RNA提取裂解液對(duì)肌肉中的總RNA進(jìn)行提取，使用核酸蛋白分析儀檢測提取的總RNA濃度（Conc值）和質(zhì)量（A260nm/A280nm），并用1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的總RNA完整性。

1.3.3.3 反轉(zhuǎn)錄

依據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA先進(jìn)行去基因組DNA處理，然后將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并將合成的cDNA質(zhì)量濃度稀釋至10 ng/μL后置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.4 引物序列來源及合成

AMPKα1、AMPKα2以及GAPDH基因引物序列參照馬曉冰[7]的方法設(shè)計(jì)，MyHC I、MyHC IIA、MyHC IIB和MyHC IIX基因引物序列參照尹麗卿[8]的方法設(shè)計(jì)，PGC-1α基因引物序列參照Khan等[9]的方法設(shè)計(jì)，COX IV基因引物序列利用NCBI網(wǎng)站和Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，全部基因的引物序列均由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for real-time polymerase chain reaction

1.3.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

本實(shí)驗(yàn)采用嵌合熒光法，以1.3.3.3節(jié)所合成的cDNA為模板，使用TB GreenTMPremix ExTaqTMII（Tli RNaseH Plus）實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，管家基因和目的基因分別做3 個(gè)平行，兩個(gè)陰性對(duì)照。反應(yīng)體系為：TB GreenTMPremix ExTaqTMII 12.5 μL；dH2O 8.5 μL；上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL；DNA模板（10 ng/μL）2.0 μL；共25.0 μL。實(shí)時(shí)熒光定量PCR條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物保存于4 ℃冰箱[8]。

本實(shí)驗(yàn)采用2-ΔΔCt計(jì)算法對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，相對(duì)表達(dá)量＝2-ΔΔCt；ΔΔCt＝（Ct目的基因-Ct）-（Ct-Ct）[10]。

內(nèi)參基因處理組目的基因內(nèi)參基因未處理組

1.3.4 相關(guān)代謝酶活力的測定

MDH、SDH和LDH活力分別按照相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行測定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 19.0數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析法進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05時(shí)表示差異顯著；P＜0.01時(shí)表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼養(yǎng)方式對(duì)肉品質(zhì)指標(biāo)的影響

表2 不同飼養(yǎng)方式下蘇尼特羊的肉品質(zhì)指標(biāo)（n＝12）Table 2 Meat traits of Sunit sheep under different feed regimens (n= 12)

由表2可知，兩種飼養(yǎng)方式下蘇尼特羊活體質(zhì)量無顯著性差異（P＞0.05），而舍飼組的胴體質(zhì)量顯著高于放牧組（P＜0.05）。Priolo等對(duì)法蘭西島羊進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，飼喂精飼料圈養(yǎng)組的胴體質(zhì)量高于散養(yǎng)組[11]。這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，說明舍飼飼養(yǎng)對(duì)羊的生長性能能夠起到提高作用。放牧組L*值顯著小于舍飼組（P＜0.05），a*值和b*值無顯著性差異（P＞0.05）。肉色是消費(fèi)者判斷肉新鮮程度的第一感官體驗(yàn)，L*值越大表示肉的亮度越高，肉色發(fā)白。放牧組pH0值為6.58，略高于舍飼組（6.45）（P＞0.05），靜置排酸24 h后，放牧組pH24值極顯著低于舍飼組（P＜0.01），說明放牧組較舍飼組而言成熟的速度更慢。剪切力可以反映肉的嫩度，剪切力越小，嫩度越好。本實(shí)驗(yàn)中放牧組剪切力顯著低于舍飼組（P＜0.05），說明放牧組的嫩度更好。Bueso等研究表明牧草組的牛肉嫩度更好[12]，而Garmyn等卻認(rèn)為集約化養(yǎng)殖的牛肉嫩度更好[13]，也有研究表明兩種飼養(yǎng)方式養(yǎng)殖的牛肉之間嫩度沒有顯著差異[14]。這可能與兩種飼養(yǎng)的營養(yǎng)水平、動(dòng)物的品種以及月齡等因素有關(guān)。兩種飼養(yǎng)方式下羊肉蒸煮損失率無顯著性差異（P＞0.05）。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雖然舍飼組的生長性能優(yōu)于放牧組，但在肉色和嫩度等肉品質(zhì)方面不及放牧組。

肌纖維是肌肉組織的基本組成單位，其直徑的大小、數(shù)量的多少、類型的分布均與肉質(zhì)性狀密切相關(guān)[15-16]。因此，本實(shí)驗(yàn)又對(duì)肌纖維的組成進(jìn)行了測定，以期從肌纖維角度探尋兩種飼養(yǎng)方式下肉品質(zhì)差異性的原因。

2.2 飼養(yǎng)方式對(duì)蘇尼特羊肌纖維組成的影響

2.2.1 蘇尼特羊背最長肌ATPaes染色結(jié)果

圖1 放牧組和舍飼組蘇尼特羊背最長肌ATPase染色結(jié)果Fig.1 ATPase staining of Longissimus doris muscle of Sunit sheep in the pasture and confinement groups

如圖1所示，利用ATPase染色法可將肌纖維分為3 種不同的類型，其中I型（慢速氧化型）肌纖維顏色最深，呈黑色，IIA型（快速氧化-酵解型）肌纖維顏色最淺，呈白色，IIB型（快速酵解型）肌纖維介于二者之間，呈棕褐色。

2.2.2 飼養(yǎng)方式對(duì)肌纖維數(shù)量比例和面積比例的影響

圖2 飼養(yǎng)方式對(duì)蘇尼特羊肌纖維數(shù)量比例、面積比例的影響Fig.2 Effect of feed regimens on number proportion and area proportion of muscle fiber in Sunit sheep

由圖2可知，放牧組IIA型肌纖維的數(shù)量比例和面積比例明顯高于舍飼組，而IIB型肌纖維數(shù)量比例和面積比例明顯低于舍飼組。兩種飼養(yǎng)方式下I型肌纖維數(shù)量比例和面積比例均無明顯差異。放牧組氧化型（I型+IIA型）肌纖維的數(shù)量比例為53.22%，舍飼組氧化型肌纖維的數(shù)量比例為42.31%。以上結(jié)果說明，放牧飼養(yǎng)可以提高氧化型肌纖維的數(shù)量比例，降低酵解型肌纖維的數(shù)量比例。韓劍眾等對(duì)不同飼養(yǎng)方式下肉雞的肌纖維特性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)放養(yǎng)雞的紅?。ㄑ趸停├w維含量較圈養(yǎng)雞有所提高[17]，這與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致。

2.2.3 飼養(yǎng)方式對(duì)肌纖維直徑和橫截面積的影響

圖3 飼養(yǎng)方式對(duì)蘇尼特羊肌纖維直徑和橫截面積的影響Fig.3 Effect of feed regimens on diameter and cross-sectional area of muscle fiber in Sunit sheep

由圖3可知，放牧組I型、IIA型、IIB型肌纖維直徑均極顯著小于舍飼組（P＜0.01）。放牧組I型肌纖維橫截面積顯著小于舍飼組（P＜0.05），IIA型和IIB型肌纖維橫截面積均極顯著小于舍飼組（P＜0.01）。兩種飼養(yǎng)方式下肌纖維直徑和橫截面積的變化規(guī)律一致。閆祥林等研究表明，與工廠集約化飼養(yǎng)相比，放養(yǎng)的多浪羊背最長肌的肌原纖維直徑較大[3]；朱夢婷等研究發(fā)現(xiàn)，籠養(yǎng)組黃羽肉雞胸肌和腿肌的肌纖維直徑均顯著小于散養(yǎng)組[18]，這與本研究結(jié)果相反，這可能是由于動(dòng)物的年齡、品種、體質(zhì)量、肌肉部位等因素均會(huì)對(duì)肌纖維的直徑與橫截面積有所影響。

2.3 飼養(yǎng)方式對(duì)蘇尼特羊肌纖維MyHC mRNA表達(dá)量的影響

圖4 飼養(yǎng)方式對(duì)蘇尼特羊肌纖維MyHC mRNA表達(dá)量的影響Fig.4 Effect of feed regimens on MyHC mRNA expression of muscle fiber in Sunit sheep

依據(jù)MyHC的多態(tài)性可以將肌纖維分為MyHC I（慢速氧化型）、MyHC IIA（快速氧化型）、MyHC IIX（中間型）和MyHC IIB（快速酵解型）4 種類型[19]。由圖4可知，放牧組MyHC I和MyHC IIXmRNA表達(dá)量均極顯著高于舍飼組（P＜0.01）。MyHC IIA和MyHC IIBmRNA表達(dá)量在兩種飼養(yǎng)方式間無顯著性差異（P＞0.05）。

根據(jù)ATPase染色法對(duì)蘇尼特羊背最長肌肌纖維類型進(jìn)行分析得出，放牧飼養(yǎng)提高了肌肉中氧化型肌纖維的比例，降低了酵解型肌纖維的比例。MyHCmRNA表達(dá)量分析結(jié)果與ATPase染色法結(jié)果相一致，放牧飼養(yǎng)提高了氧化型肌纖維的比例。研究表明，酵解型肌纖維中肌紅蛋白含量較少，所以酵解型肌纖維比例較高的肌肉中，肉色更加蒼白[20]。王莉?qū)﹃笈Ｈ饧±w維類型對(duì)宰后嫩度的影響進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，I型肌纖維比例與剪切力呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，即I型肌纖維比例越高，剪切力越低，嫩度越好[21]。肌肉的嫩度還與肌纖維的直徑有關(guān)，陳坤杰等研究分析了沃金黑牛的肌纖維特性以及肌纖維與嫩度之間的關(guān)系，結(jié)果表明嫩度隨肌纖維直徑的增大而下降[22]，這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。本實(shí)驗(yàn)中放牧組背最長肌的pH24值極顯著小于舍飼組，這可能是由于舍飼組的酵解型肌纖維比例較高，pH值下降速率和回升速率快，加快了肉的成熟速度[23]。

肌纖維的分析結(jié)果與肉品質(zhì)分析結(jié)果相吻合，因此，兩種飼養(yǎng)方式下肉品質(zhì)的差異可能是肌肉中肌纖維類型組成不同而造成的。

2.4 飼養(yǎng)方式對(duì)蘇尼特羊肌纖維MDH、SDH、LDH活力的影響

圖5 飼養(yǎng)方式對(duì)蘇尼特羊肌纖維MDH、SDH、LDH活力的影響Fig.5 Effect of feed regimens on MDH, SDH and LDH activity of muscle fiber in Sunit sheep

氧化型肌纖維中存在大量的線粒體，通過線粒體氧化代謝產(chǎn)生能量；酵解型肌纖維中線粒體含量較少，主要通過糖酵解產(chǎn)生能量。MDH是合成蘋果酸的關(guān)鍵酶之一，廣泛存在于線粒體上，是三羧酸循環(huán)中的一種酶，其活力可以表征線粒體有氧代謝的程度。在三羧酸循環(huán)中SDH是唯一可以滲入線粒體內(nèi)膜的有氧代謝限速酶，其活力常用來評(píng)價(jià)肌肉氧化活性[24]。LDH是一種糖酵解酶，其活性能夠反映細(xì)胞內(nèi)無氧酵解的活躍程度[25]。由圖5可知，放牧組MDH和SDH活力極顯著高于舍飼組（P＜0.01），LDH活力極顯著低于舍飼組（P＜0.01）。這說明放牧飼養(yǎng)能夠提高肌肉的氧化酶活力，降低酵解酶活力，與放牧組中氧化型肌纖維比例高、酵解型肌纖維比例低這一結(jié)果相一致。

2.5 飼養(yǎng)方式對(duì)蘇尼特羊肌纖維AMPK、PGC-1α、COX IV mRNA表達(dá)量的影響

AMPK信號(hào)通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝中起著核心作用，被稱為細(xì)胞能量傳感器，能夠促進(jìn)線粒體生物合成和氧化型肌肉表型的代謝變化[26]。PGC-1α是骨骼肌中線粒體生物合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器，AMPK是其上游調(diào)控基因，活化的AMPK能夠直接磷酸化PGC-1α促進(jìn)線粒體生物合成和氧化代謝[27-28]。COX IV是一種氧化還原酶，位于線粒體內(nèi)膜上，被認(rèn)為是線粒體生物合成的標(biāo)志，其活性高低決定了線粒體生物合成水平的高低。并且PGC-1α在富含I型肌纖維的骨骼肌中優(yōu)先表達(dá)，被認(rèn)為是氧化型肌纖維形成的關(guān)鍵調(diào)控因子。Zhang Lin等在對(duì)豬和小鼠的骨骼肌特異性過度表達(dá)PGC-1α后，發(fā)現(xiàn)骨骼肌的線粒體功能增強(qiáng)，同時(shí)促進(jìn)了慢肌纖維也就是氧化型肌纖維的生成[29]。綜上所述，AMPK能夠直接磷酸化PGC-1α，進(jìn)而提高骨骼肌線粒體生物合成水平和氧化代謝能力，促進(jìn)氧化型肌纖維的形成。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)AMPK、PGC-1α、COX IVmRNA表達(dá)量進(jìn)行了測定，旨在探尋飼養(yǎng)方式對(duì)肌纖維組成的影響機(jī)制。

圖6 飼養(yǎng)方式對(duì)蘇尼特羊肌纖維AMPK、PGC-1α、COX IV mRNA表達(dá)量的影響Fig.6 Effect of feed regimens on the mRNA expression of AMPK,PGC-1α and COX IV of muscle fiber in Sunit sheep

由圖6可知，放牧組AMPKα2和COX IVmRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著高于舍飼組（P＜0.01），PGC-1αmRNA相對(duì)表達(dá)量在兩種飼養(yǎng)方式間差異不顯著（P＞0.05），但放牧組較高。趙雅娟研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)4 周給小鼠皮下注射AMPK激活劑后，PGC-1α基因表達(dá)量顯著升高，促使肌纖維類型由酵解型肌纖維向氧化型肌纖維轉(zhuǎn)化[30]。Suwa等研究發(fā)現(xiàn)，AMPK活性升高可以促使PGC-1α蛋白表達(dá)水平和氧化酶活力增加，并且降低了IIB型肌纖維的比例[31]。在本實(shí)驗(yàn)中，與舍飼組相比，放牧組蘇尼特羊背最長肌中氧化型肌纖維比例增加，酵解型肌纖維比例降低，同時(shí)AMPKα2和COX IVmRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著上調(diào)，這說明飼養(yǎng)方式對(duì)肌纖維組成的影響可能是由于放牧飼養(yǎng)增加了AMPKα2mRNA相對(duì)表達(dá)量，促進(jìn)機(jī)體線粒體的生物合成，提高了肌肉的氧化代謝能力，但PGC-1αmRNA基因的表達(dá)水平并沒有顯著升高，這可能是基因表達(dá)時(shí)轉(zhuǎn)錄和翻譯發(fā)生的時(shí)間和位點(diǎn)存在間隔所造成的。

3 討 論

通過對(duì)放牧和舍飼兩種飼養(yǎng)方式下蘇尼特羊背最長肌肉品質(zhì)指標(biāo)以及肌纖維組成進(jìn)行測定及分析，可以發(fā)現(xiàn)舍飼組的胴體質(zhì)量顯著高于放牧組，這說明舍飼飼養(yǎng)對(duì)改善蘇尼特羊的生長性能有積極作用。并且放牧組L*值、剪切力和pH24值均顯著低于舍飼組，說明放牧飼養(yǎng)降低了肉的亮度，提高了肉的嫩度，降低了pH值回升速度，延長了肉的成熟時(shí)間。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)放牧組IIA型肌纖維的數(shù)量比例和面積比例顯著提高，IIB型肌纖維數(shù)量比例和面積比例顯著降低，I型、IIA型和IIB型肌纖維直徑和橫截面積顯著減小，且放牧組MyHC I和MyHC IIXmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著增加。這說明，放牧飼養(yǎng)能夠提高氧化型肌纖維的比例，降低酵解型肌纖維的比例，提示肌纖維類型由酵解型向氧化型轉(zhuǎn)化，同時(shí)肌纖維直徑和橫截面積減小。本研究還發(fā)現(xiàn)放牧飼養(yǎng)增強(qiáng)了氧化代謝酶MDH和SDH活力，降低了酵解代謝酶LDH活力，這與放牧組中氧化型肌纖維比例高、酵解型肌纖維比例低這一結(jié)果相一致。AMPK信號(hào)通路在肌纖維類型的轉(zhuǎn)化中起著重要作用，本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)放牧組AMPKα2和COX IVmRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著升高，表明放牧飼養(yǎng)提高了AMPKα2的mRNA相對(duì)表達(dá)量，進(jìn)而激活位于線粒體內(nèi)膜上的氧化還原酶COXIV，增強(qiáng)肌肉的線粒體生物合成水平。綜上所述，放牧飼養(yǎng)能夠通過提高AMPKα2的mRNA相對(duì)表達(dá)量，增強(qiáng)機(jī)體線粒體生物合成水平和氧化代謝能力，促使肌纖維類型由酵解型向氧化型肌纖維轉(zhuǎn)化，降低肉的亮度，提高肉的嫩度，延長肉的成熟時(shí)間。

本研究結(jié)果顯示，雖然舍飼組的生長性能優(yōu)于放牧組，但在肉色和嫩度等肉品質(zhì)方面不及放牧組。并且與舍飼相比，放牧飼養(yǎng)提高了氧化型肌纖維的比例，同時(shí)提高了MDH和SDH活力以及AMPKα2和COX IVmRNA相對(duì)表達(dá)量，降低了酵解型肌纖維的比例和LDH活力。這說明放牧飼養(yǎng)能夠提高肌肉的線粒體生物合成水平，同時(shí)增強(qiáng)肌肉的氧化代謝能力，使肌纖維類型由酵解型向氧化型轉(zhuǎn)化，進(jìn)而改善肉品品質(zhì)。因此，未來可通過AMPK信號(hào)通路調(diào)控肌纖維類型的轉(zhuǎn)化，從而使肉品品質(zhì)得以提高。