張薇，羅肇河，高越，顧海峰*

(1.自然資源部第三海洋研究所，福建 廈門(mén) 361005； 2.廈門(mén)大學(xué)近海海洋環(huán)境科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén) 361005)

共生藻屬(Symbiodinium)主要指一類與無(wú)脊椎動(dòng)物或原生生物共生的甲藻，是熱帶和亞熱帶海洋生態(tài)系統(tǒng)常見(jiàn)物種[1-2]。其中最常見(jiàn)的是與珊瑚共生的種類，與珊瑚的共生關(guān)系是維持珊瑚存活和生長(zhǎng)的關(guān)鍵，因此得以被廣泛而深入的研究[3-4]。Freudenthal (1962)首次描述了共生藻屬，并且認(rèn)為所有共生的甲藻都是微小亞德里共生藻(Symbiodiniummicroadriaticum)[5]，但是后來(lái)的研究表明甲藻許多物種的生活史都涉及共生階段，例如：前溝藻屬(Amphidinium)、原甲藻屬(Prorocentrum)、梨甲藻屬(Pyrocystis)、斯克里普藻屬(Scrippsiella)、黏球藻屬(Gloeodinium)和單溝藻屬(Pelagodinium)的部分物種[6-9]。共生藻屬最早因?yàn)槠渖钍饭采A段的細(xì)胞呈球形被劃分到共生藻科[10]，后來(lái)Moestrup等(2009)依據(jù)其模式種微小亞德里共生藻和最近報(bào)道的自在共生藻(Symbiodiniumnatans)具有E型眼點(diǎn)(Type EsensuMoestrup & Daugbjerg, 2007：由一系列磚墻狀排列具有膜結(jié)構(gòu)的水晶泡組成且位于葉綠體體外部)和單線長(zhǎng)甲板型頂溝復(fù)合體(Elongate Apical Vesicle, EAV)建議將其劃歸到修斯藻科[11]。

由于大部分共生藻屬物種不易體外培養(yǎng)或者因?yàn)榕c無(wú)脊椎動(dòng)物或原生生物長(zhǎng)期共生使得其本身形態(tài)特征并不顯著或者容易變形，很難運(yùn)用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)來(lái)定義和描述它們[12-14]?；诤颂求w大亞基(Large Subunit Ribosomal DNA, LSU rDNA)和葉綠體核糖體(Chloroplast Ribosomal DNA, cp23S)序列的系統(tǒng)發(fā)育研究形成了普遍認(rèn)可的以系群(Clade)為階元的共生藻屬進(jìn)化遺傳學(xué)分類系統(tǒng)[12,15-16]。共生藻屬目前包含A-I共9個(gè)系群，每個(gè)系群基于轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal Transcribed Spacer, ITS)系統(tǒng)發(fā)育又可細(xì)分為多個(gè)亞系群[17]。LaJeunesse等(2012)基于綜合的進(jìn)化遺傳學(xué)證據(jù)定義了兩個(gè)新的共生藻：微小共生藻(Symbiodiniumminutum)和嗜冷共生藻(Symbiodiniumpsygmophilum)，并且建議推廣進(jìn)化遺傳學(xué)分類系統(tǒng)作為未來(lái)定義新共生藻屬物種的方法[13]。進(jìn)化遺傳學(xué)分類方法雖然解決了共生藻屬部分分類學(xué)問(wèn)題，但依然沒(méi)有形成一個(gè)公認(rèn)的物種命名系統(tǒng)。目前僅微小亞德里共生藻、自在共生藻和貪食共生藻具有形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)描述，而多毛共生藻(Symbiodiniumpilosum)、川口共生藻(Symbiodiniumkawagutii)、戈羅共生藻(Symbiodiniumgoreauii)和林奇共生藻(Symbiodiniumlinucheae)僅具有超微結(jié)構(gòu)描述，另外還有8個(gè)種(Symbiodiniumbermudense、Symbiodiniumcariborum、Symbiodiniumcorculorum、Symbiodiniummeandrinae、Symbiodiniummuscatinei、Symbiodiniumpulchrorum、Symbiodiniumglynnii和Symbiodiniumtrenchi)沒(méi)有形態(tài)學(xué)描述[8,18-20]。

貪食共生藻是一種既可以和珊瑚共生又可以自由生活的共生藻，在西北、西南和東北溫帶太平洋地區(qū)以及地中海均有報(bào)道[21-22]，但直到最近才被正式命名[23]。Jeong等(2014)收集了來(lái)自世界各地的共生和自由生活的系群E共生藻株系，基于形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法證明了它們屬于同一個(gè)種——貪食共生藻[23]。研究表明來(lái)自世界各地的貪食共生藻株系的核糖體基因(LSU rDNA，ITS和SSU rDNA)、cp23S和線粒體細(xì)胞色素b基因(Mitochondrial Cytochromeb,cob)序列高度一致[23]。這些來(lái)自細(xì)胞內(nèi)不同位置(細(xì)胞核、葉綠體和線粒體)的基因常被用于共生藻屬物種多樣性和生態(tài)學(xué)研究的標(biāo)記基因，它們的一致說(shuō)明不同地理種群的貪食共生藻之間存在不間斷的基因交流或者它們具有共同的起源直到近代才因?yàn)樽匀换蛘呷藶橐蛩胤稚⒌绞澜绺鞯?，但是目前還沒(méi)有直接的證據(jù)來(lái)證明這些推斷?；赟SU rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果，一株分離自膠州灣的Symbiodiniumsp. (株系G15)首次被鑒定為“自由生活”的共生藻[24]。后來(lái)的研究推測(cè)其也是貪食共生藻[23]，但是目前還沒(méi)有相應(yīng)的形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)證據(jù)。我們從中國(guó)沿海以及一艘?？吭趶B門(mén)港的貨輪壓艙水的底部沉積物中分離出了4株貪食共生藻，運(yùn)用光鏡、掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡對(duì)它們的形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了細(xì)致的研究，并且結(jié)合核糖體基因、cp23S和cob序列差異和(或)系統(tǒng)發(fā)育來(lái)討論世界各地貪食共生藻的遺傳進(jìn)化和人類活動(dòng)的輔助傳播。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和培養(yǎng)

株系SCXM82分離自廈門(mén)港表層海水。采集到的海水經(jīng)100 μm篩絹過(guò)濾并且收集濾過(guò)液(小于100 μm)。在奧林帕斯BX51顯微鏡(Olympus, Tokyo)下尋找并挑取單個(gè)甲藻細(xì)胞到預(yù)裝有f/2-Si海水培養(yǎng)基[25]的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。樣品在20 ℃、90 μmol/( m2· s)光照和12 h∶12 h光暗循環(huán)(標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件)下培養(yǎng)富集。株系GLN和株系SymND由廈門(mén)大學(xué)海洋微型生物保種中心(CCMA)提供，并且在f/2-Si培養(yǎng)基和標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)。株系XING分離自一艘?？吭趶B門(mén)港貨輪壓艙水的底部沉積物中的不動(dòng)細(xì)胞，并且在 f/2-Si培養(yǎng)基和標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)。樣品具體采集時(shí)間地點(diǎn)見(jiàn)表1。

表1 貪食共生藻株系、采集地點(diǎn)和時(shí)間Tab. 1 Strains of Symbiodinium voratum, sites and time of collection

1.2 光鏡觀察

利用裝備有微分干涉光源(DIC)和Axiocam HRc數(shù)碼相機(jī)的蔡司顯微鏡(Carl Zeiss, G?ttingen, Germany)觀察并拍攝貪食共生藻的不動(dòng)細(xì)胞、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的運(yùn)動(dòng)細(xì)胞和二分裂狀態(tài)的細(xì)胞(Doublet Cell)。運(yùn)用蔡司軟件系統(tǒng)(Axiovision Software V 4.8.2)在拍攝到的高分辨率圖上對(duì)細(xì)胞進(jìn)行大小測(cè)量，株系GLN和XING分別量取50個(gè)細(xì)胞。

1.3 掃描電子顯微鏡觀察

取1 mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞與無(wú)菌海水配制的鋨酸(2 %，體積占比，下同)等體積混合在20 ℃下避光隔夜固定。將自然沉降下來(lái)的細(xì)胞滴加到涂有左旋多聚賴氨酸(分子量70 000～150 000, Sigma)的蓋玻片上，靜置30 min以便細(xì)胞粘附在蓋玻片上。樣品先后經(jīng)過(guò)無(wú)菌海水、50 %無(wú)菌海水和Mill-Q水各浸泡10 min除去鹽分，然后乙醇梯度脫水(10%、30%、50%、70%、90%和3次100 %，每次10 min)。樣品經(jīng)過(guò)K850臨界點(diǎn)干燥儀(Quorum/Emitech, West Sussex)干燥、噴金，最后在LEO1 530掃描電子顯微鏡(Zeiss/LEO, Oberkochen)下觀察拍照。

1.4 透射電子顯微鏡觀察

取戊二醛(Ted Pella, Redding, CA)緩慢加入到20 mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期藻液中(終濃度2.5%)，20 ℃固定3 h。離心(4 000 r/min，10 min)收集細(xì)胞并用無(wú)菌海水洗滌3次，每次10 min，然后加入1%無(wú)菌海水配制的鋨酸在4 ℃避光隔夜固定。離心(4 000 r/min，3 min)收集細(xì)胞并且用無(wú)菌海水洗滌3次，每次10 min。樣品經(jīng)乙醇梯度脫水(10%、30%、50%、70%、90% 和 3次 100%，每次10 min)，然后用Spurr包埋劑包埋[26]。包埋塊經(jīng)EM UC7超薄切片機(jī)(Leica, Vienna)切片，然后乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，最后在JEOL JEM-1400透射電子顯微鏡(JEOL, Tokyo)下觀察拍照。

1.5 DNA提取、序列擴(kuò)增和測(cè)序

取大約20 mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期藻液室溫下離心(13 400 r/min， 10 min)收集細(xì)胞。用MiniBEST Universal DNA Extraction Kit (Takara, Tokyo)試劑盒按其說(shuō)明書(shū)步驟提取樣品總DNA。LSU rDNA (D1-D6區(qū))序列擴(kuò)增引物為D1R[27]和28-1483R[28]。SSU rDNA序列擴(kuò)增用真核生物通用引物Primer A和Primer B[29]。50 μL聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)體系：1×PCR緩沖液，4種脫氧核糖核酸各0.2 mmol/L，正反方向引物各0.2 μmol/L，10 ng模板DNA和1 U的ExTaq DNA聚合酶(Takara, Tokyo)。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性10 min；然后30個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，每個(gè)循環(huán)包括94 ℃變性1 min，45 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min；最后72 ℃延伸10 min。ITS (ITS1-5.8S-ITS2)序列擴(kuò)增引物為ITSA和ITSB[30]。除了退火溫度改為50 ℃外，PCR反應(yīng)體系和程序和前述LSU rDNA序列擴(kuò)增方案相同。cp23S和cob序列分別按照Santos等(2002)和Zhang等(2005)提供的引物和反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增[31-32]。以上PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)純化后送生工生物工程(上海)股份有限公司，利用ABI PRISM 3730XL測(cè)序儀(Applied Biosystems, Foster City, CA)雙向直接測(cè)序。

1.6 序列處理和系統(tǒng)發(fā)育分析

中國(guó)沿海貪食共生藻的LSU rDNA序列和基因庫(kù)(Genbank)上下載的其他共生藻的序列首先經(jīng)過(guò)MAFFT V7.110[33]在線系統(tǒng)在L-INS-I方案[34]下進(jìn)行比對(duì)，然后用BioEdit V7.0.5人工切除頭尾多余的序列[35]。對(duì)于貝葉斯(Bayesian Inference, BI)系統(tǒng)發(fā)育，我們首先采用jModelTest 2 V2.1.4[36]在Akaike信息準(zhǔn)則(AIC)下選擇最優(yōu)進(jìn)化模型，然后運(yùn)用MrBayes 3.2[37]和選出的最優(yōu)模型(TIM3+I+G)來(lái)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。4條馬爾可夫鏈蒙特卡爾分析(MCMC，3條熱鏈 1條冷鏈)同時(shí)運(yùn)行1×106代，每100代取樣一次。馬爾可夫鏈蒙特卡爾的收斂利用AWTY在線工具的累積函數(shù)來(lái)作圖形化的評(píng)估[38]，并且分析每個(gè)分支的后驗(yàn)概率(Posterior Probability,PP)值。最大似然法(Maximum Likelihood, ML)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)利用T-REX網(wǎng)站[39]上的RaxML V7.2.6[40]進(jìn)行構(gòu)建，并運(yùn)行1 000次自展分析來(lái)衡量分支的節(jié)點(diǎn)支持率。

ITS和基因庫(kù)(Genbank)上下載的其他地區(qū)的貪食共生藻序列同樣經(jīng)過(guò)MAFFT V7.110[33]在線系統(tǒng)比對(duì)，然后運(yùn)用PAUP*4b10軟件[41]來(lái)計(jì)算不同地理株系間的遺傳距離(未校正P距離)。SSU rDNA、 cp23S和cob序列和基因庫(kù)上下載的其他地區(qū)貪食共生藻的對(duì)應(yīng)序列用DNAman (Version 6.0, Lynnon Biosoft)進(jìn)行比對(duì)并且計(jì)算相似度。

2 結(jié)果與討論

2.1 形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)

貪食共生藻SymbiodiniumvoratumJeong, Lee, Kang & LaJeunesse的形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖 1～4。

3株貪食共生藻(SCXM82，GLN，GymND)分離自中國(guó)沿海水體，1株(XING)采集自一艘?？吭趶B門(mén)港的貨輪壓艙水的底部沉積物(表1)。株系XING的運(yùn)動(dòng)細(xì)胞長(zhǎng)9.7±1.3 μm，寬8.7±0.9 μm (n=50)；球形不動(dòng)細(xì)胞直徑11.4±0.3 μm；近球形二分裂細(xì)胞直徑12.2±0.6 μm。運(yùn)動(dòng)細(xì)胞上鞘略大于下鞘，鞭毛長(zhǎng)大約是細(xì)胞長(zhǎng)的1.5倍[圖1(a)]。細(xì)胞核大且呈球形位于上鞘，有一個(gè)淀粉核位于細(xì)胞核下方[圖1(b)、(c)]。眼點(diǎn)位于腹面縱溝位置[圖1(c)]。細(xì)胞常在一個(gè)很小范圍內(nèi)旋轉(zhuǎn)，幾個(gè)月甚至半年不更新培養(yǎng)基都可存活。在培養(yǎng)液底部常見(jiàn)許多不動(dòng)細(xì)胞[圖1(d)]和二分裂細(xì)胞[圖1(e)]，且它們都有一個(gè)明亮的紅色體，培養(yǎng)條件下未見(jiàn)四分裂和八分裂細(xì)胞。

在掃描電子顯微鏡下對(duì)株系XING、GLN和GymND進(jìn)行觀察和拍照，它們均顯示出相似的甲板排列。運(yùn)動(dòng)細(xì)胞上鞘呈球形，下鞘從背腹面看略微不對(duì)稱[圖2(a)、(b)]。一個(gè)單線長(zhǎng)甲板型頂溝復(fù)合體位于細(xì)胞頂部[圖2(c)至(g)]，頂溝復(fù)合體中心有大約13個(gè)球形突起(Knob)[圖2(c)、(d)]。一塊方形的小板(X板)位于頂溝復(fù)合體的腹面[圖2(c)至(g)]。運(yùn)動(dòng)細(xì)胞具有5塊頂板(Apical Plate)，一些細(xì)胞(大約16%)的甲板2′和3′可能融合成一塊[圖2(f)、(g)]。細(xì)胞具有9塊溝前板(Precingular Plate)和6塊前間插板(Anterior Intercalary Plate)[圖2(a)、(b)、(c)、(g)]。甲板3a、4a和5a 可變，極少量細(xì)胞(大約1 %)的甲板4a和5a合并成一塊，而3a則可能分裂成兩塊(未列出)。橫溝(Cingulum)和縱溝都很寬[圖2(a)]。橫溝位于細(xì)胞中部，由兩排五邊形甲板組成，下旋大約一個(gè)橫溝寬度[圖2(a)、(i)]。鞭毛孔位于縱溝位置，鞭毛孔之間有一個(gè)捕食莖(Peduncle)[圖2(h)]。下鞘由6塊溝后板(Postcingular Plate)和2塊底板(Antapical Plate)組成[圖2(j)至(l)]。2塊縱溝板(sp和s)清晰可見(jiàn)，另外還有一塊(s？)僅露出了一部分[圖2(l)]。圖3畫(huà)出了中國(guó)沿海貪食共生藻典型的甲板排列示意圖。

圖1 貪食共生藻(株系XING)光鏡圖片F(xiàn)ig. 1 Light micrographs of Symbiodinium voratum (strain XING)(a)：運(yùn)動(dòng)細(xì)胞腹面觀，示縱溝鞭毛(箭頭)；(b)：運(yùn)動(dòng)細(xì)胞背面觀，示橢圓形細(xì)胞核(N)和單莖的淀粉核(Py)；(c)：細(xì)胞側(cè)面觀，示眼點(diǎn)(箭頭)和淀粉核(Py)；(d)：不動(dòng)細(xì)胞，示紅色體(箭頭)；(e)：二分裂細(xì)胞，示紅色體(箭頭)。

圖2 貪食共生藻(株系XING)運(yùn)動(dòng)細(xì)胞掃描電子顯微鏡圖片F(xiàn)ig. 2 Scanning electron micrographs of Symbiodinium voratum motile cells (strain XING)(a)：腹面觀；(b)：背面觀；(c)：頂面觀，示EAV型頂溝(箭頭)；(d)至(f)：頂面觀，示EAV型頂溝和其周圍的板塊；(g)：頂面觀，示X板、頂板和間插板；(h)：腹面觀，示捕食莖(箭頭)；(i)：背面觀，示橫溝板；(j)、(k)：底面觀，示底板和溝后板；(l)：底面觀，示縱溝板。

在透射電子顯微鏡下對(duì)株系XING和GLN進(jìn)行觀察和拍照，它們均顯示出相似的超微結(jié)構(gòu)。橫切面和縱切面顯示有許多形狀不規(guī)則的葉綠體分布在細(xì)胞周圍[圖4(a)至(c)]。細(xì)胞核位于細(xì)胞上鞘，內(nèi)含許多染色體；油滴和線粒體隨機(jī)散落于細(xì)胞內(nèi)部[圖4(a)、(b)]。1個(gè)外包淀粉鞘的單莖大淀粉核(Pyrenoid)位于細(xì)胞中上部[圖4(a)、(c)]。周質(zhì)膜由一層外膜和內(nèi)部的一系列甲板組成；位于細(xì)胞頂端的球形突起清晰可見(jiàn)[圖4(d)]。眼點(diǎn)在葉綠體外部位于縱溝，由一系列磚墻狀排列具有膜結(jié)構(gòu)的水晶泡組成[圖4(e)]。高爾基體由許多平行排列扁平的囊泡組成，兩側(cè)有許多運(yùn)輸囊泡[圖4(f)]。葉綠體內(nèi)含平行排列的3層膜組成的類囊體 [圖4(g)]。

2.2 分子特征和系統(tǒng)發(fā)育

本研究分離到的4株貪食共生藻的核糖體基因(SSU rDNA、 ITS和LSU rDNA)、 cp23S和cob序列完全一致。對(duì)于LSU rDNA，它們和膠州灣(株系G15, AY160123部分序列)、地中海(株系RCC1521, KF364606)的貪食共生藻序列相同，但和韓國(guó)(株系SvFL 1, HF568830)、英國(guó)(株系CCMP421, AY684264)以及美國(guó)(株系rt-383, KF364605)的貪食共生藻序列分別有1 bp、1 bp以及2 bp的差異?；贚SU rDNA序列由最大似然法和貝葉斯方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示出相似的分支結(jié)構(gòu)(圖5)。中國(guó)沿海和世界其他地方的貪食共生藻很好的聚類在一起組成系群E，自展分析支持率和后驗(yàn)概率值都達(dá)到了最大值(分別為100 %和1.00)。但是該種和其他類群的距離較遠(yuǎn)，表明該種為一個(gè)完全分化的物種。對(duì)于ITS(580 bp)，它們和膠州灣(株系G15，AY160123)、韓國(guó)(株系SvFL 1，HF568830)、英國(guó)(株系CCMP421，EU074907)、日本(株系RIKEN，AB546599)以及美國(guó)(株系rt-383，AF334659)的貪食共生藻分別有1 bp(相似度99.82 %)、3 bp(相似度99.47 %)、3 bp(相似度99.47 %)、4 bp(相似度99.29 %)以及5 bp(相似度99.12 %) 的差異。世界各地貪食共生藻株系間基于ITS序列的遺傳距離(未校正P距離)為0.001 7～0.008 7(表2)。對(duì)于SSU rDNA(序列長(zhǎng)度1 752 bp)，它們和膠州灣(株系G15，AY160123)、韓國(guó)(株系SvFL 1，HF568830)、英國(guó)(株系CCMP421，AF274279)以及美國(guó)(株系rt-383，AF225965)的貪食共生藻都有2 bp(相似度99.89%)的差異，而對(duì)于cp23S和cob，它們和世界各地的貪食共生藻序列完全相同。中國(guó)株系和其他地方貪食共生藻的遺傳分化很小，顯示它們之間有頻繁的基因交流。

圖3 貪食共生藻典型的甲板排列示意圖Fig. 3 Line drawing of the most common pattern thecal plates of Symbiodinium voratum

圖4 貪食共生藻(株系XING)運(yùn)動(dòng)細(xì)胞透射電子顯微鏡圖片F(xiàn)ig. 4 Transmission electron micrographs of Symbiodinium voratum motile cells (strain XING)(a)：縱切面，示細(xì)胞核(N)、葉綠體(chl)、淀粉核(Py)、線粒體(mt)和油滴(L)；(b)：橫切面，示細(xì)胞核(N)和環(huán)繞的葉綠體(chl)；(c)：橫切面，示單莖的淀粉核(Py)；(d)：縱切面，示甲板(t)、甲板間隙(s)、外膜(om)和頂部的球形突起(k)；(e)：E型眼點(diǎn)；(f)：高爾基體和兩側(cè)的運(yùn)輸囊泡(箭頭)；(g)：葉綠體及其三層膜組成的類囊體(箭頭)。

圖5 基于核糖體大亞基(LSU rRNA， D1-D2區(qū))序列由最大似然法構(gòu)建的共生藻屬系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 5 Phylogeny of Symbiodinium inferred from LSU rDNA (D1-D2 region) sequence based on maximum likelihood (ML)單溝藻 (Pelagodinium béii)選為外源類群；節(jié)點(diǎn)的數(shù)字是最大似然法的自展分析支持度(左)和貝葉斯的后驗(yàn)概率(右)；自展分析支持度小于50或者后驗(yàn)概率小于0.5的以“-”代替。

表2 基于轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列(580 bp)的貪食共生藻不同地理株系間的遺傳距離(未校正P距離)Tab. 2 Estimated uncorrected genetic distances (P values) between different geographic Symbiodinium voratum strainson the basis of ITS region sequences (580 bp)

2.3 討論

2.3.1 形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)特征 目前只有微小亞德里共生藻、自在共生藻和貪食共生藻的甲板結(jié)構(gòu)被描述[23,42-43]。中國(guó)沿海采集到的共生藻株系的甲板方程為： x, EAV, 4′-5′, 5a-6a, 9′′, ?s, ?c, 6′′′, 2′′′′，基本符合貪食共生藻的最初描述。然而Jeong等(2014)報(bào)道稱英國(guó)的貪食共生藻(株系CCMP 421)頂板為5～7塊、溝前板為8塊[23]，而中國(guó)沿海株系的頂板為4～5塊，溝前板為9塊，這可能是不同地理株系的貪食共生藻甲板具有可變性。實(shí)際上不僅上鞘，韓國(guó)貪食共生藻(株系SvFL 1)下鞘的溝后板是6塊或7塊，而底板也在2塊和3塊之間變化[23]。甲板可變的情況也同樣出現(xiàn)在微小亞德里共生藻和自在共生藻[42-43]，說(shuō)明共生藻屬物種甲板結(jié)構(gòu)在一定的范圍內(nèi)具有可變的通性，這給共生藻屬的分類學(xué)研究增加了困難。

超微結(jié)構(gòu)顯示英國(guó) (株系CCMP 421)和韓國(guó)貪食共生藻(株系SvFL 1)的淀粉核都具有2個(gè)莖[23]，而中國(guó)沿海株系的淀粉核都只有1個(gè)莖。目前除了戈羅共生藻的淀粉核具有3個(gè)莖外，其他已報(bào)到的共生藻屬物種(微小亞德里共生藻、自在共生藻、林奇共生藻、川口共生藻和多毛共生藻)的淀粉核都是2個(gè)莖[2,42-44]。淀粉核的莖數(shù)目變化是由于地理種群間的差異，還是存在亞種水平的差別，需要更多的株系和實(shí)驗(yàn)來(lái)闡明。以往的研究很少涉及共生藻屬物種的高爾基體形態(tài)，僅Blank(1987)通過(guò)冷凍電鏡三維重構(gòu)技術(shù)展示了一株分離自疣表孔珊瑚(Montiporaverrucosa)的共生藻不動(dòng)細(xì)胞的高爾基體[45]，我們首次報(bào)道了貪食共生藻運(yùn)動(dòng)細(xì)胞中由許多平行排列扁平囊泡組成的高爾基體形態(tài)。貪食共生藻運(yùn)動(dòng)細(xì)胞中高爾基體兩側(cè)的運(yùn)輸小泡比前者多[45]，說(shuō)明貪食共生藻運(yùn)動(dòng)細(xì)胞的高爾基體代謝活動(dòng)顯著高于疣表孔珊瑚共生藻的不動(dòng)細(xì)胞。

2.3.2 兼性營(yíng)養(yǎng)特性 研究表明許多共生藻屬物種具有捕食莖[2,23,42-43]，共生藻物種的兼性營(yíng)養(yǎng)能力極大的增強(qiáng)了它們?cè)跁r(shí)常處于低營(yíng)養(yǎng)鹽的珊瑚礁環(huán)境下存活和繁殖的能力[46]。室內(nèi)培養(yǎng)條件下顯示中國(guó)沿海貪食共生藻株系生命力頑強(qiáng)，幾個(gè)月甚至半年不更新培養(yǎng)基都可良好存活，兼性營(yíng)養(yǎng)能力可能是重要的原因。Jeong等(2012)通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了貪食共生藻能夠通過(guò)捕食莖攝食細(xì)菌、藍(lán)藻和小型藻類，并且觀察記錄到了它能夠攝食掉珊瑚礁地區(qū)很大一部分的聚球藻(Synechococcus)[46]。另外，Shao等(2004)從珠江口附近的一次赤潮水體中分離出了貪食共生藻[47]，說(shuō)明其可能在某些物種赤潮的消亡過(guò)程中扮演非常重要的角色。

2.3.3 分子特征與傳播的關(guān)系 自15世紀(jì)大航海時(shí)代以來(lái)，船運(yùn)極大地促進(jìn)了世界經(jīng)濟(jì)、科技、文化的交流，縮短了世界各地的時(shí)空距離。日益發(fā)達(dá)的船運(yùn)線路使得包括甲藻在內(nèi)的許多生物通過(guò)水產(chǎn)進(jìn)出口或者壓艙水被帶往世界各地，極大的拓展了它們的地理分布[48-50]?；贚SU rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育顯示世界各地貪食共生藻很好的聚類在一起，而且它們ITS序列遺傳距離也顯著的低于甲藻種間遺傳距離的統(tǒng)計(jì)值(0.01～0.04)[51]。Jeong等的研究[23]和本研究表明，西北、西南和東北溫帶太平洋地區(qū)以及地中海分離出的貪食共生藻的核糖體基因、cp23S和cob基因序列高度一致。這些來(lái)自細(xì)胞核、葉綠體和線粒體等細(xì)胞內(nèi)不同位置的基因常常被用于共生藻屬物種多樣性和生態(tài)學(xué)研究的標(biāo)記基因[12,31-32]。綜合的形態(tài)和進(jìn)化遺傳證據(jù)表明世界各地貪食共生藻具有極其相近的親緣關(guān)系。我們從一艘?？吭趶B門(mén)港的貨輪壓艙水底部沉積物中分離出貪食共生藻不動(dòng)細(xì)胞并且成功的培養(yǎng)成株系，表明其可以在船舶壓艙水中長(zhǎng)期存活，暗示世界各地的貪食共生藻可能具有共同的起源直到近代才因?yàn)槿祟惢顒?dòng)擴(kuò)散到世界各地。

3 結(jié)論

我們從中國(guó)沿海及一艘?？吭趶B門(mén)港的貨輪壓艙水中分離出了4株貪食共生藻，它們的核糖體基因、cp23S和cob序列完全一致。中國(guó)沿海和世界其他地方的貪食共生藻很好的聚類在一起組成系群E。中國(guó)株系和其他地方貪食共生藻的遺傳分化很小，顯示它們之間有頻繁的基因交流。室內(nèi)培養(yǎng)條件下貪食共生藻生命力頑強(qiáng)，兼性營(yíng)養(yǎng)能力可能是它們能夠在壓艙水中存活的重要原因。形態(tài)和遺傳證據(jù)表明世界各地貪食共生藻具有極其相近的親緣關(guān)系，采樣記錄也表明其不動(dòng)細(xì)胞可以在船舶壓艙水中長(zhǎng)期存活，暗示世界各地的貪食共生藻可能具有共同的起源并且直到近代才因?yàn)槿祟惢顒?dòng)擴(kuò)散到世界各地。