高鴻　馬啟林　吳孚桂　劉慧芳　聶佳俊

摘 ?要：利用鹽生植物的耐鹽基因改良作物耐鹽性是保障土壤鹽漬化地區(qū)糧食生產(chǎn)和改良鹽漬化土地的最經(jīng)濟(jì)最有效的途徑。本研究以生長于西北鹽蓋上的一種耐鹽野生蘆葦為材料，制備了Mb級(jí)耐鹽蘆葦基因組DNA，酶切后經(jīng)脈沖場(chǎng)凝膠電泳將其分離為不同大小的大片段DNA區(qū)段，并與酶切回收的BIBAC-S載體進(jìn)行連接，成功構(gòu)建了耐鹽蘆葦不同大小的大片段DNA-BIBAC載體，經(jīng)根癌農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)，成功地轉(zhuǎn)化了粳稻品種‘中花11成熟胚愈傷組織，獲得了轉(zhuǎn)基因水稻植株。研究表明，不同大小的大片段DNA-BIBAC載體在轉(zhuǎn)化同一受體材料時(shí)，其所獲得的愈傷轉(zhuǎn)化率、植株轉(zhuǎn)化率、轉(zhuǎn)基因植株的陽性率等存在差異，說明插入片段的大小與轉(zhuǎn)化效率之間存在關(guān)系。本研究為創(chuàng)制耐鹽水稻新種質(zhì)、克隆鹽生植物的耐鹽基因提供了理論和技術(shù)參考。

關(guān)鍵詞：水稻;蘆葦;耐鹽性;BIBAC;大片段DNA轉(zhuǎn)化

中圖分類號(hào)：S511 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Construction of Large Fragment DNA-BIBAC Vector of Salt Tolerant Reed and Its Genetic Transformation in Rice

GAO Hong， MA Qilin*， WU Fugui， LIU Huifang， NIE Jiajun

College of Tropical Crops， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract： Using the salt-tolerant genes of halophytes to improve crop salt tolerance will be the most economical and effective way to ensure food production in soil salinized areas and to improve salinized land. In this study， a salt-tolerant wild Phragmites australis grown in the saline-alkali soil of Northwestern China was used as the materials to prepare Mb class genomic DNA， which was digested by restriction enzyme， and was separated into different size of DNA segments by pulsed field gel electrophoresis， then connected with the BIBAC-S vector， and successfully constructed the salt tolerant reed large fragment DNA-BIBAC vector. The large fragment DNA-BIBAC vector was successfully transformed into the callus of the mature embryo of ‘Zhonghua 11 mediated by Agrobacterium tumefaciens EHA105， and 23 transgenic positive rice plants were obtained. The results showed that there were differences in callus transformation rate， plant transformation rate and transgenic plant positive rate among different sizes of the DNA-BIBAC vector， indicating that there was a relationship between the size of inserted fragments and transformation efficiency. This study would provide a theoretical and technical reference for creating new germplasm of salt tolerant rice and cloning salt tolerant genes of halophytes.

Keywords： Oryza sativa L.; Phragmites australis; salt tolerance; BIBAC; genetic transformation of large DNA fragments

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.03.006

隨著全球氣候變化和土地的不合理使用，世界上大約三分之一的耕地都不同程度地受到自然或次生鹽漬化的影響[1-2]，越來越嚴(yán)重的土壤鹽漬化現(xiàn)象導(dǎo)致可耕地面積下降。土壤鹽漬化是嚴(yán)重制約世界各地植物生長、造成作物減產(chǎn)的主要非生物脅迫因子之一[3-7]，阻礙著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展，威脅著全球糧食安全[8-9]。為了維持作物正常生長、保障糧食安全，加強(qiáng)鹽堿地資源的開發(fā)利用，改良和培育耐鹽作物新品種已成為重要的課題和研究的熱點(diǎn)。其中，選育和種植具有較高耐鹽性的作物新品種，已經(jīng)成為保障土壤鹽漬化地區(qū)糧食生產(chǎn)和改良鹽漬化土地的有效途徑之一[10-11]。

水稻（Oryza sativa L.）是甜土植物，對(duì)鹽脅迫敏感。從現(xiàn)有水稻種質(zhì)資源中篩選耐鹽材料以及通過常規(guī)育種手段改良現(xiàn)有水稻品種的耐鹽性，雖取得了一定的進(jìn)展，但這些品種所表現(xiàn)出的耐鹽能力不強(qiáng)，滿足不了鹽堿地生產(chǎn)的要求。隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的快速發(fā)展，利用發(fā)現(xiàn)和克隆到的鹽生植物的耐鹽基因，培育耐鹽水稻新品種是提高水稻耐鹽性，維持鹽堿地農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要途徑之一[12-13]。盡管利用生物工程技術(shù)將特定外源基因?qū)胨竞螅欢ǔ潭壬咸嵘怂镜哪望}能力[14-16]，但因?yàn)槟望}性是受多數(shù)數(shù)量性狀基因控制的復(fù)雜性狀，轉(zhuǎn)移單個(gè)基因?qū)μ岣咚灸望}性的作用比較有限，仍然難以達(dá)到鹽堿地水稻生產(chǎn)的要求。因此，同時(shí)轉(zhuǎn)化多個(gè)耐鹽基因及其調(diào)控因子，是大幅提高作物耐鹽性的必要途徑。

雙元細(xì)菌人工染色體（bibary bacterial artificial chromosome，BIBAC）載體可以在大腸桿菌和根癌農(nóng)桿菌中復(fù)制，與一般載體相比，除了能構(gòu)建大片段文庫外，還能直接用于大片段DNA、多基因或基因簇的遺傳轉(zhuǎn)化，來促進(jìn)基因發(fā)現(xiàn)和功能研究[17-18]。利用BIBAC載體已成功構(gòu)建了番茄[19]、野生稻[20]、粳稻[21]、鹽芥[22]等基因文庫，為后續(xù)優(yōu)良基因的發(fā)掘與利用奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)，利用BIBAC載體將大片段成功轉(zhuǎn)入植株基因組中，如Hamilton等[23]和Frary等[24]利用BIBAC載體將150 kb外源片段通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入煙草和番茄基因組中，He等[20]將攜帶褐飛虱抗性基因的120 kb片段-BIBAC載體成功導(dǎo)入水稻基因組中。

一種生長于西北鹽蓋上的野生蘆葦，具有極強(qiáng)的耐鹽性，與水稻同屬禾本科，對(duì)提高水稻的耐鹽性具有極高的潛在價(jià)值。本研究以此耐鹽野生蘆葦為材料，構(gòu)建了耐鹽蘆葦大片段DNA- BIBAC載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織，并成功獲得了轉(zhuǎn)基因植株。耐鹽蘆葦大片段DNA轉(zhuǎn)化水稻技術(shù)為創(chuàng)制耐鹽水稻新種質(zhì)，以及后續(xù)克隆耐鹽蘆葦?shù)哪望}基因奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)于水稻耐鹽性的提高、鹽堿地的有效利用等具有潛在的重要價(jià)值。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

供體材料為一種生長于西北鹽蓋上的野生蘆葦。pHZAUBIBAC1載體由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)羅美中教授惠贈(zèng);大腸桿菌菌株DH10B，購自上海唯地生物科技有限公司;根癌農(nóng)桿菌EHA105，購自北京華越洋生物科技有限公司;CIP（小牛腸堿性磷酸酶）、T4 DNA連接酶、Lambda PFG ladder購自NEB公司;BamH I、λDNA、I-Sce I購自Thermo Scientific公司;質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司;用于轉(zhuǎn)化的材料粳稻‘中花11（Oryza satva L. subsp. japonica cv Zhonghua11）以及209轉(zhuǎn)基因‘中花11質(zhì)粒由海南波蓮水稻基因有限公司提供。

1.2 ?方法

1.2.1 ?BIBAC-S載體質(zhì)粒的制備 ?取?80 ℃凍存的pHZAUBIBAC1菌株于LB固體平板上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，再挑選單菌落于含有12.5 ?g/mL Amp和Kan的LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，待菌液處于對(duì)數(shù)生長期，利用OMEGA試劑盒進(jìn)行載體質(zhì)粒提取，微量分光光度計(jì)及凝膠電泳檢測(cè)提取的質(zhì)粒質(zhì)量;將提取的載體質(zhì)粒置于37 ℃下酶切2.5 h;酶切完成后，37 ℃下脫磷50 min，隨后進(jìn)行純化及自連反應(yīng);將上述已完成自連的載體DNA進(jìn)行1%脈沖場(chǎng)凝膠電泳分析，通過凝膠成像平行切割出含有目的載體BIBAC-S的凝膠塊，裝入無菌并含有100 μL 0.5×TBE透析袋中（8000～ 14000 D）進(jìn)行電洗脫回收，檢測(cè)回收液的質(zhì)量。脈沖場(chǎng)凝膠電泳條件：泵速70，6 v/cm，1～50 s，120°，0.5×TBE，14 ℃，14 h;電洗脫回收條件：4 ℃，125 V，2.5 h，電泳結(jié)束后180°顛倒透析袋，繼續(xù)電泳2 min。

1.2.2 ?蘆葦大片段DNA的制備 ?參照文獻(xiàn)[25]來制備蘆葦大片段DNA，并從脈沖場(chǎng)凝膠電泳后的凝膠中切割出含有50～300 kb大小的蘆葦DNA片段的凝膠塊，電洗脫回收凝膠中的DNA大片段，電洗脫條件同1.2.1。檢測(cè)回收DNA的濃度，確定目的DNA濃度大于1 ng/μL才能進(jìn)行后續(xù)連接實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 ?蘆葦大片段DNA-BIBAC載體構(gòu)建 ?將回收的BIBAC-S載體和不同大小的蘆葦大片段DNA通過T4連接酶16 ℃連接16 h;將連接產(chǎn)物吸入至脫鹽膠，靜置于冰中1.5 h，進(jìn)行脫鹽處理;脫鹽處理后的連接產(chǎn)物通過電擊轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH10B中;涂板培養(yǎng)，挑選陽性克隆搖菌，利用堿裂解法提取克隆質(zhì)粒;利用I-Sce I對(duì)BIBAC克隆質(zhì)粒進(jìn)行酶切，脈沖場(chǎng)凝膠電泳檢測(cè)，獲取插入不同大小的蘆葦大片段DNA陽性克隆。脈沖場(chǎng)電泳條件：泵速70，6 v/cm，5～15 s，120°，0.5× TBE，14 ℃，16 h。

1.2.4 ?BIBAC載體遺傳轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織 ?粳稻‘中花11種子去殼，用25%的NaClO消毒15～20 min，無菌水清洗7～8次后平鋪于無菌濾紙上風(fēng)干30 min，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基，33～34 ℃恒溫暗培養(yǎng)35～40 d，將種子胚周圍新生長出的愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng);從繼代培養(yǎng)基中挑選出顏色嫩黃、表面干燥、生長旺盛的愈傷組織轉(zhuǎn)移至預(yù)/共培養(yǎng)基（含100 μmol/L乙酰丁香酮）上，25 ℃暗培養(yǎng)4 d;用含有不同片段BIBAC載體的EHA105菌液（OD600值為0.4～0.6，含100 μmol/L乙酰丁香酮）侵染25 min，置于無菌濾紙風(fēng)干，轉(zhuǎn)移至預(yù)/共培養(yǎng)基中25 ℃暗培養(yǎng)3 d;用滅菌超純水將共培養(yǎng)愈傷組織上的農(nóng)桿菌沖洗干凈，再加入500 mg/L的頭孢水浸泡25～30 min，風(fēng)干愈傷后，轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基（含50 mg/L的Hyg和500 mg/L的頭孢）中，28 ℃暗培養(yǎng)20～50 d，期間更換一次培養(yǎng)基;將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基（含2 mg/L KT和2 mg/L NAA）中，置于25 ℃光照培養(yǎng)20～50 d;將分化出小苗的根清理干凈后，轉(zhuǎn)移至1/2 MS生根培養(yǎng)基中，25 ℃光照培養(yǎng)15 d;解開封口膜，加入2～3 cm的自來水后培養(yǎng)2～3 d進(jìn)行煉苗，移苗完成后移栽至水稻池中。誘導(dǎo)與繼代培養(yǎng)基成分：100 mL/L 10×N6大量、10 mL/L 100×N6微量+100× N6有機(jī)+100× N6鐵鹽、2，4-D（1 mg/mL）、0.5 g/L脯氨酸、0.6 g/L水解絡(luò)蛋白、30 g/L蔗糖、3 g/L植物凝膠，pH 5.9，116 ℃滅菌15 min，其中2，4-D（1 mg/mL）在誘導(dǎo)培養(yǎng)基與繼代培養(yǎng)基中的加入量分別為3 mL/L和2.4 mL/L。

1.2.5 ?PCR篩選遺傳轉(zhuǎn)化植株 ?CTAB法提取轉(zhuǎn)化植株的DNA，用潮霉素和水稻內(nèi)參基因Actin引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定轉(zhuǎn)基因植株。引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系均為：0.4 μL模板DNA、5 μL 2×Taq MasterMix（Dye）、0.25 μL 10 μmol/L Hn-F/R引物、（或0.4 μL 10 μmol/L LH-F/R引物），用滅菌雙蒸水補(bǔ)足10 μL。PCR反應(yīng)條件均為：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸25 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，確定轉(zhuǎn)基因陽性植株。2對(duì)引物的擴(kuò)增長度分別為664 bp和110 bp。

1.3 ?數(shù)據(jù)分析

記錄農(nóng)桿菌介導(dǎo)不同片段大小的BIBAC載體在轉(zhuǎn)化水稻過程中抗性愈傷數(shù)目、再生植株數(shù)目以及陽性植株數(shù)目，并計(jì)算出各自最終的遺傳轉(zhuǎn)化效率。愈傷轉(zhuǎn)化率=抗性愈傷數(shù)目/侵染的總愈傷數(shù)目×100%;植株轉(zhuǎn)化率=再生植株數(shù)目/接種的抗性愈傷總數(shù)目×100%;植株陽性率=陽性植株數(shù)目/檢測(cè)植株總數(shù)目×100%;終轉(zhuǎn)化效率=愈傷轉(zhuǎn)化率（%）×植株轉(zhuǎn)化率（%）×植株陽性率（%）× 100%。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?BIBAC-S載體質(zhì)粒與蘆葦大片段DNA的制備

經(jīng)搖菌培養(yǎng)后提取的pHZAUBIBAC1載體質(zhì)粒濃度約為400 ng/μL左右，并且DNA條帶清晰，純度較高。不同時(shí)間的酶切效果顯示，當(dāng)酶切至2.5 h時(shí)，載體質(zhì)粒酶切完全，其濃度約為25 ng/μL左右（圖1A）。依據(jù)此條件，對(duì)pHZAUBIBAC1載體質(zhì)粒酶切2.5 h，經(jīng)脫磷純化后進(jìn)行脈沖場(chǎng)電泳分離，從圖1B中可知BIBAC-S載體條帶亮度明顯，說明載體濃度較高，并且BIBAC-S與PGEM-4Z載體已經(jīng)完全分離;圖1B中黑色部分的凝膠在顯色前被平行切割出來，用于電洗脫回收BIBAC-S載體，該部分凝膠中含有與“V”列相同的BIBAC-S載體質(zhì)粒。電洗脫回收的BIBAC-S載體經(jīng)電泳檢測(cè)，回收的BIBAC-S載體質(zhì)粒純度高，濃度約為20 ng/μL，符合載體連接時(shí)的要求（圖1C）。同時(shí)，對(duì)提取的Mb級(jí)耐鹽蘆葦基因組DNA經(jīng)酶切、脈沖場(chǎng)電泳分離、凝膠切割、電洗脫回收，回收的載體濃度在2～4 ng/μL左右，滿足與載體連接時(shí)的要求（圖1D）。

2.2 ?蘆葦大片段DNA-BIBAC載體的構(gòu)建

在電洗脫回收的載體DNA與目的大片段DNA連接轉(zhuǎn)化后的篩選平板中，隨機(jī)挑選12個(gè)白斑單菌落搖菌，提取質(zhì)粒，I-Sce I單酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)脈沖場(chǎng)凝膠電泳檢測(cè)。從圖2可知，12個(gè)單克隆均為陽性克隆，均含有插入片段且不存在空載現(xiàn)象，插入片段大小介于50～150 kb之間，不存在雙克隆和多克隆的現(xiàn)象，總體來說蘆葦大片段DNA-BIBAC載體構(gòu)建非常成功。隨后，將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，用于水稻的遺傳轉(zhuǎn)化。

2.3 ?蘆葦大片段DNA-BIBAC載體遺傳轉(zhuǎn)化水稻

水稻愈傷組織的誘導(dǎo)與繼代：水稻種子接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，33～34 ℃條件下暗培養(yǎng)40 d長出愈傷組織（圖3A）;愈傷組織繼代培養(yǎng)（圖3B）?？剐杂鷤M織的篩選：農(nóng)桿菌與愈傷組織在25 ℃條件下暗培養(yǎng)4 d后，轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基，一部分愈傷組織會(huì)褐化死亡，一部分會(huì)長出新的米黃色抗性愈傷組織（圖3C）?？剐杂鷤M織的分化：轉(zhuǎn)移抗性愈傷組織于分化培養(yǎng)基中分化，愈傷會(huì)慢慢分化變大，并逐漸轉(zhuǎn)綠，最后分化出幼苗（圖3D）?？剐赞D(zhuǎn)化苗的生根與移栽：將分化出的幼苗根部清理干凈，轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)（圖3E）;待幼苗復(fù)壯后煉苗3 d，移栽至室外水稻池中（圖3F）。

2.4 ?遺傳轉(zhuǎn)化苗的PCR鑒定

提取轉(zhuǎn)基因苗葉片DNA，用潮霉素（Hn664）基因和水稻內(nèi)參（Actin110）基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，部分?jǐn)U增結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，已轉(zhuǎn)化成功的水稻植株能擴(kuò)增出與陽性對(duì)照相同大小的條帶，證明農(nóng)桿菌介導(dǎo)的BIBAC載體已經(jīng)成轉(zhuǎn)入粳稻‘中花11中。

2.5 ?大片段DNA-BIBAC載體轉(zhuǎn)化效率

本試驗(yàn)轉(zhuǎn)化了3組不同大小的大片段DNA- BIBAC載體，其大小分別為50～75 kb、60～90 kb和90～120 kb，遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果如表2所示。由表2可知，獲得陽性植株總數(shù)為23株，3組不同大小的大片段DNA-BIBAC載體的最終轉(zhuǎn)化效率分別為7.71%、7.23%和2.99%，初步的轉(zhuǎn)化數(shù)據(jù)顯示，插入DNA片段越大轉(zhuǎn)化效率越低。

3 ?討論

利用大片段DNA轉(zhuǎn)化技術(shù)或原位的基因組導(dǎo)入技術(shù)向栽培作物中導(dǎo)入有益性狀進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化是作物改良中的有益實(shí)踐。許多研究已經(jīng)證實(shí)外源基因的大片段DNA能穩(wěn)定地導(dǎo)入植物基因組。通過對(duì)許多禾本科植物基因組的比較，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)含有功能基因的大片段DNA在遠(yuǎn)緣物種間是可以橫向傳遞的，并且被受體物種接受使用，擴(kuò)展了遺傳基礎(chǔ)，這可能是植物進(jìn)化的重要驅(qū)動(dòng)力[26]。

盡管存在爭(zhēng)議，但農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)由于其T-DNA的精確處理和低拷貝數(shù)轉(zhuǎn)基因的簡(jiǎn)單整合，已成為生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因水稻品種的較好選擇。大片段DNA轉(zhuǎn)化過程中的許多因素決定了轉(zhuǎn)化效率或者直接導(dǎo)致試驗(yàn)失敗。外植體鑒定、基因轉(zhuǎn)移技術(shù)、整合構(gòu)建、無遺傳損傷的轉(zhuǎn)基因表達(dá)和轉(zhuǎn)化子選擇是影響水稻轉(zhuǎn)化的技術(shù)難題，獲取大片段DNA轉(zhuǎn)化過程中的這些信息對(duì)于改良難馴化水稻品種的轉(zhuǎn)化體系是必要的[27]。本研究結(jié)果顯示，pHZAUBIBAC1的酶切對(duì)于后續(xù)實(shí)驗(yàn)極為重要，若酶切不完全，那么pHZAUBIBAC1載體會(huì)夾雜其中，降低線性BIBAC-S載體回收的純度，從而影響到后續(xù)BIBAC-S載體與大片段DNA的連接效率，在進(jìn)行DH10B轉(zhuǎn)化時(shí)，空載體會(huì)優(yōu)先于重組質(zhì)粒進(jìn)入大腸桿菌，產(chǎn)生大量藍(lán)斑，影響篩選。酶切之后的脫磷也對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)起著關(guān)鍵性作用，脫磷時(shí)間過長會(huì)降低連接效率，脫磷時(shí)間過短會(huì)讓載體產(chǎn)生自連，2種情況都會(huì)產(chǎn)生數(shù)目較多的藍(lán)斑，經(jīng)多次摸索試驗(yàn)，脫磷的最適時(shí)間在55～65 min之內(nèi)。脫磷后利用電洗脫的方法來進(jìn)行載體與蘆葦大片段的回收，與試劑盒回收比較起來，此方法回收的濃度會(huì)比試劑盒回收的載體濃度低，但是其回收純度高，能夠最小限度地對(duì)目的載體和大片段造成機(jī)械損傷，保證其完整性，可有效提高連接效率。

利用農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)粳稻中花11的轉(zhuǎn)化過程中，選擇生長旺盛的愈傷組織作為轉(zhuǎn)基因的受體能夠提高轉(zhuǎn)化效率[28];同時(shí)選擇合適的菌液濃度與侵染時(shí)間也至關(guān)重要[29]。有研究認(rèn)為，在BIBAC系統(tǒng)中，高濃度的農(nóng)桿菌細(xì)胞可提高轉(zhuǎn)化效率，若農(nóng)桿菌濃度過低且侵染時(shí)間過短會(huì)出現(xiàn)侵染不充分，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率變低且篩選時(shí)大量愈傷發(fā)生褐變死亡的情況[30]。本研究中，侵染粳稻‘中花11的菌液濃度OD600為0.4～0.6之間，侵染時(shí)間為25 min。若農(nóng)桿菌濃度過高且侵染時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致大量農(nóng)桿菌增殖，對(duì)植物細(xì)胞造成傷害且脫菌困難，降低愈傷組織的再生頻率且容易導(dǎo)致后續(xù)實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)農(nóng)桿菌污染的情況。此外，有研究表明水稻中可能缺少對(duì)農(nóng)桿菌Vir基因活化所需的酚類物質(zhì)，因此表現(xiàn)出對(duì)農(nóng)桿菌并不敏感，所以在懸浮液和預(yù)/共培養(yǎng)基中加入少量的乙酰丁香酮（AS）能夠有效提升轉(zhuǎn)化效率[31]，是轉(zhuǎn)化的必要條件。

本研究通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將耐鹽蘆葦不同大片段DNA-BIBAC載體對(duì)粳稻‘中花11進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，經(jīng)過PCR擴(kuò)增初步鑒定獲得陽性植株23株，實(shí)現(xiàn)了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大片段DNA在水稻中的遺傳轉(zhuǎn)化，為創(chuàng)制耐鹽水稻新種質(zhì)，以及后續(xù)挖掘和克隆蘆葦耐鹽相關(guān)基因奠定了基礎(chǔ)。但從最終的轉(zhuǎn)化效率來看，不同大小的大片段DNA載體在轉(zhuǎn)化同一受體材料時(shí)，因其所獲得的愈傷轉(zhuǎn)化率、植株轉(zhuǎn)化率、轉(zhuǎn)基因植株的陽性率等存在差異，說明插入DNA片段的大小與轉(zhuǎn)化效率之間有一定關(guān)系。今后在創(chuàng)制耐鹽水稻新種質(zhì)的時(shí)候，既要考慮一次轉(zhuǎn)入片段的大小，在導(dǎo)入更多基因的同時(shí)，也要考慮遺傳轉(zhuǎn)化的效率，從而獲得更多的突變體。

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責(zé)任編輯：崔麗虹

收稿日期 ?2020-06-12;修回日期 ?2020-07-17

基金項(xiàng)目 ?國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No. 31660381）;國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（No. 2015BAD01B02-1-1）。

作者簡(jiǎn)介 ?高 ?鴻（1994—），男，碩士，研究方向：植物生物技術(shù)與種質(zhì)創(chuàng)新。*通信作者（Corresponding author）：馬啟林（MA Qilin），E-mail：hbhnqlm@163.com。