石秀麗,何松林,賈文慶

（河南科技學(xué)院園藝園林學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003）

牡丹（Paeonia suffruticosaAndr.）為芍藥科芍藥屬,多年生落葉亞灌木,為我國所特有[1],主要位于我國的中部、西南部及西北部地區(qū)[2].

牡丹繁殖方式為有性繁殖和無性繁殖,主要以有性繁殖為主,用其種子進(jìn)行,但播種后代會出現(xiàn)分離變異,母本的優(yōu)良性狀不能很好地保存[3],且種子會存在二次休眠和生理后熟的現(xiàn)象,導(dǎo)致播種育苗的周期延長[4]；其無性繁殖主要為扦插、嫁接、分株等方式[5],但存在成苗周期長、繁殖系數(shù)低、出苗量少且質(zhì)量參差不齊等問題.與傳統(tǒng)的育苗技術(shù)相比較,組織培養(yǎng)技術(shù)更有利牡丹的育種和快速繁殖[6].目前,國內(nèi)外針對牡丹組織培養(yǎng)方面已有一定的研究成果[7].外植體種類繁多,主要有鱗芽、土芽、葉片、葉柄、花藥等,其中以牡丹鱗芽為外植體進(jìn)行培養(yǎng)的研究報道居多[8].

牡丹育種的主要困難是育種周期長和雜交敗育[9].而牡丹商業(yè)化繁殖的主要方式為嫁接和分株,但分株法的繁殖周期比較長,一般分株1次需要3～4年[10]，這嚴(yán)重地限制了牡丹育種和繁殖工作的開展.為更好地保存種質(zhì)資源,用組織培養(yǎng)的方法進(jìn)行研究非常必要.目前該方法主要集中于基本培養(yǎng)基的篩選以及植物生長調(diào)節(jié)劑的篩選,有關(guān)硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的研究還未見報道,本文在幾種基本培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加硝態(tài)氮和鈣元素,探究其之間的關(guān)系,以期為牡丹組織培養(yǎng)的繁殖和育種奠定基礎(chǔ),對組培技術(shù)方法的開發(fā)提供借鑒和參考.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

所用牡丹頂芽均由洛陽國家牡丹基因庫提供,以“大胡紅”為試驗材料.

1.2 試驗方法

1.2.1 材料處理 先用自來水沖洗外植體（頂芽）表面,再用毛刷蘸洗衣粉溶液刷洗每個頂芽,最后用流水沖洗2 h.在超凈工作臺上用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液消毒30 s,用無菌水沖洗一次,再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的升汞滅菌7～8 min.滅菌后用無菌水沖洗5～6次,每次大約2 min,在無菌條件下把牡丹頂芽放入帶濾紙的無菌培養(yǎng)皿中.

1.2.2 試驗方法 以1/2MS、Ca（NO3）2的MS、MS、WPM為四種基本培養(yǎng)基（培養(yǎng)基中分別添加質(zhì)量濃度為6～7 g/L的瓊脂和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的蔗糖,并加入活性炭作為吸附劑）.用濃度均為1 mol/L的NaOH和HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至5.8～6.4,高壓滅菌鍋123℃下滅菌30 min，加入不同濃度的細(xì)胞分裂素6-BA和生長素NAA,調(diào)整激素配比.將無菌外植體接種在培養(yǎng)基上進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo),每種基本培養(yǎng)基設(shè)4個處理,每個處理有5個重復(fù).共接種80瓶,每瓶接種3個外植體.

接種后先暗培養(yǎng)4～5 d.然后置于光下培養(yǎng),光照強(qiáng)度1 500～2 000 Lux,每天光照12 h,溫度25±1℃.培養(yǎng)時間為30 d.觀察不同基本培養(yǎng)基對頂芽愈傷組織的影響；培養(yǎng)條件同上,培養(yǎng)時間為40 d.觀察不同基本培養(yǎng)基對頂芽分化率及增殖系數(shù)的影響.

1.2.3 測試指標(biāo)

出愈率/%=誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體個數(shù)/總接種的外植體個數(shù)×100,

分化率/%=已分化的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100,

增殖系數(shù)=培養(yǎng)40 d后外植體的總數(shù)/接種時的外植體總數(shù).

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2010軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行整理,用DPS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理與分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基本培養(yǎng)基對愈傷組織的影響

誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基成分見表1,“大胡紅”培養(yǎng)30 d后調(diào)查出愈率情況見表2.

由表1和表2可以看出,以Ca（NO3）2的MS和WPM為基本培養(yǎng)基的頂芽愈傷組織誘導(dǎo)率最高.在培養(yǎng)一個月時,在處理B（2）、D（1）中,分別形成1 cm左右淺綠色的顆粒狀愈傷組織,植株長勢良好,叢生芽數(shù)量多,葉片全部展開且為正常綠色.隨著6-BA濃度的升高,愈傷組織誘導(dǎo)率下降,在Ca（NO3）2的MS中6-BA濃度為1.0 mol/L時,NAA濃度為0.1 mol/L時,出愈率相對較高.

表1 誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基成分Tab.1 The culture medium ingredients of the induction injuries mol/L

表2 “大胡紅”培養(yǎng)30 d后調(diào)查出愈率情況Tab.2 The recovery rate of Dahuhong after 30 days'cultivation

2.2 不同基本培養(yǎng)基對頂芽分化及增殖的影響

誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基成分見表3.

表3 誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基成分Tab.3 Induction differentiation culture medium ingredients mol/L

“大胡紅”培養(yǎng)40 d后調(diào)查分化率以及增殖系數(shù)情況見表4.

表4 大胡紅培養(yǎng)40 d后調(diào)查分化率以及增殖系數(shù)情況Tab.4 Investigation of differentiation rate and proliferation coefficient of Dahuhong after 40 days'culture

由表4可知,WPM培養(yǎng)基6-BA濃度為1.0 mol/L時,NAA濃度為0.3 mol/L時,其分化率和增殖系數(shù)最高.并且芽的長勢好,叢生芽數(shù)量多,且分化出直徑大約1 cm的綠色愈傷組織；Ca（NO3）2的MS培養(yǎng)基,用Ca2+加倍,NO3-代替Cl-和NH4+,發(fā)現(xiàn)增殖系數(shù)也較高,叢生芽多,長勢也較好,同時也有直徑大約為0.8 cm的綠色愈傷組織出現(xiàn),但分化率較低.這可能與培養(yǎng)基中Ca2+的含量有關(guān).1/2MS培養(yǎng)基增殖系數(shù)和分化率一般,有部分愈傷組織出現(xiàn),MS培養(yǎng)基里用1/3CaNO3代替Cl-和NH4+,發(fā)現(xiàn)增值系數(shù)和分化率較弱,無愈傷組織出現(xiàn),這可能與培養(yǎng)基中NO3-的含量有關(guān).四種培養(yǎng)基頂芽的生長情況見圖1.

圖1 四種培養(yǎng)基頂芽的生長情況Fig.1 Growth of terminal buds of four media

2.3 不同基本培養(yǎng)基對頂芽增殖系數(shù)的影響

“大胡紅”不同基本培養(yǎng)基種類對牡丹頂芽分化的影響見表5.

表5 “大胡紅”不同基本培養(yǎng)基種類對牡丹頂芽分化的影響Tab.5 Effect of different basic medium species of Dahuhong on multiplication coefficient of peony

四個牡丹品種的增殖系數(shù)方差分析結(jié)果見表6.

表6 方差分析表Tab.6 Variances analytical tables

從表6方差分析結(jié)果表明：四個牡丹品種的增殖系數(shù)在不同的培養(yǎng)基上差異顯著.不同培養(yǎng)基種類的多重比較結(jié)果見圖7.

從表7多重比較的結(jié)果可知,在培養(yǎng)基對增殖系數(shù)的影響中,B、D的效果極顯著,明顯優(yōu)于A、C；A和C之間差異不顯著.結(jié)合試驗過程中B和D培養(yǎng)基上頂芽的生長快、分化時間短、增殖系數(shù)高和較少發(fā)生污染以及褐化的現(xiàn)象,選擇B、D為本研究的最佳培養(yǎng)基.

表7 不同培養(yǎng)基種類的多重比較結(jié)果Tab.7 The multiple comparative results of different types of culture medium

3 結(jié)論與討論

基本培養(yǎng)基是植物材料賴以生長和發(fā)育的基礎(chǔ),為植物生長和發(fā)育提供必需的礦質(zhì)營養(yǎng).張倩等[11]在試管苗生長的過程中使用的培養(yǎng)基多為MS或1/2 MS；安佰義[12]在研究不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)叢生芽的試驗中,發(fā)現(xiàn)外植體通過低溫處理后,可以產(chǎn)生叢生芽,WPM培養(yǎng)基誘導(dǎo)率最高,其次是MS培養(yǎng)基,B5培養(yǎng)基最低；王新等[13]用鳳丹鱗芽進(jìn)行組織培養(yǎng)時,也證實(shí)了WPM培養(yǎng)基誘導(dǎo)率最高.本試驗以1/2MS、Ca（NO3）2的MS、MS和WPM四種基本培養(yǎng)基為基礎(chǔ),結(jié)果表明Ca（NO3）2的MS和WPM的培養(yǎng)基誘導(dǎo)較好,與安佰義[12]、王新等[13]研究結(jié)果一致.

為優(yōu)化組織培養(yǎng)體系,在原有基礎(chǔ)上進(jìn)行組織培養(yǎng),能夠提高植物的再生效率[14].在植物不定芽的誘導(dǎo)增殖研究中,添加的生長調(diào)節(jié)劑主要為6-BA,濃度介于0.5～3 mol/L之間、NAA濃度介于0.2～3.5mol/L[15].本試驗采用加入不同濃度的6-BA和NAA的方法來研究牡丹試管苗的增殖情況,結(jié)果表明：在6-BA濃度為1.0 mol/L條件下,在培養(yǎng)基中加入NAA,愈傷組織的生長量最大,芽的增殖系數(shù)相對較高.培養(yǎng)基為Ca（NO3）2的MS+6-BA濃度為1.0 mol/L+NAA濃度為0.1 mol/L和WPM+6-BA濃度為1.0 mol/L+NAA濃度為0.3 mol/L時為最佳.這與張玉芳等[16]的觀點(diǎn)一致.

蛋白質(zhì)和核酸的重要組成部分是氮,也是植物需求量最大的礦質(zhì)元素,硝態(tài)氮和銨態(tài)氮（NO3--N,NH4+-N）是植物吸收的主要氮源[17].很多研究表明NH4+/NO3-的比值影響組培苗的生長,控制著不定芽的發(fā)生,減少NH4+的含量,提高NO3-的含量,降低Cl-的含量,還能夠減輕玻璃化的發(fā)生,提高組培快繁的有效增殖率.在牡丹組織培養(yǎng)中,Bouza等[18]研究認(rèn)為將MS基本培養(yǎng)基中Ca2+加倍,能減緩BAP與GA3長期配合使用帶來的不良后果,減輕組培苗的頂芽和葉尖壞死現(xiàn)象.本試驗以MS和WPM兩種基本培養(yǎng)基為基礎(chǔ),通過改變Ca源（用Ca（NO3）2替代或部分替代CaCl2）,結(jié)果表明添加Ca（NO3）2的MS和WPM的增殖系數(shù)和愈傷組織比較高,但分化率較低.這與前人研究的觀點(diǎn)一致.分化較低的原因可能是因為品種不同,不同生長時期取材對分化也有影響.

綜上所述，誘導(dǎo)叢生芽和愈傷組織,以Ca（NO3）2的MS+6-BA濃度為1.0mol/L+NAA濃度為0.1 mol/L和WPM+6-BA濃度為1.0 mol/L+NAA濃度為0.3 mol/L形成無根苗的培養(yǎng)基為最佳.但有關(guān)牡丹組織培養(yǎng)的報道,最早的是關(guān)于愈傷組織的報道.本試驗僅研究從牡丹頂芽的叢生芽誘導(dǎo)和愈傷組織誘導(dǎo)方面內(nèi)容,有關(guān)生根方面的試驗還有待進(jìn)一步研究.