劉淑杰 陶 新 鄧 波 門小明 徐子偉

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，杭州 2310021)

仔豬早期斷奶技術(shù)是現(xiàn)代規(guī)模化豬場普遍采用的關(guān)鍵技術(shù)，其重要性日益顯著。然而早期斷奶卻是仔豬必須經(jīng)歷的一個(gè)重大創(chuàng)傷性事件，首當(dāng)其沖是損害腸道健康。斷奶應(yīng)激極易造成仔豬腸道損傷，黏膜形態(tài)改變，消化酶活性降低，功能基因與蛋白表達(dá)異常，最終導(dǎo)致整個(gè)消化系統(tǒng)功能紊亂，嚴(yán)重阻礙了仔豬健康生長，給畜牧業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。腸道健康是決定仔豬整體健康和后期生產(chǎn)力水平的關(guān)鍵因素，對(duì)腸道進(jìn)行損傷修復(fù)一直是仔豬營養(yǎng)研究的重點(diǎn)。

表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)是一個(gè)含有53個(gè)氨基酸的單鏈多肽，分子質(zhì)量為6.05 ku，屬于促生長因子家族成員之一[4]。EGF是一種強(qiáng)有力的細(xì)胞有絲分裂原，可刺激細(xì)胞分裂、增殖，增加上皮組織的DNA與蛋白質(zhì)合成，其獨(dú)特作用是促進(jìn)胃腸組織生長和發(fā)育[5]。研究顯示，EGF可以刺激胃腸道上皮細(xì)胞增殖與分化，促進(jìn)腸道生長發(fā)育，誘導(dǎo)小腸黏膜刷狀緣消化酶表達(dá)，改善機(jī)體對(duì)養(yǎng)分的消化利用[6]。母乳是動(dòng)物哺乳時(shí)期腸道EGF的主要來源，早期斷奶使仔豬突然中斷乳源性豬表皮生長因子(porcine epidermal growth factor，pEGF)，此時(shí)通過外源補(bǔ)充pEGF極有可能是修復(fù)斷奶仔豬腸道損傷、維護(hù)正常腸道功能屏障的一個(gè)有效途徑。然而，關(guān)于pEGF對(duì)斷奶仔豬腸道作用方面的報(bào)道還比較缺乏，有限的來源、昂貴的價(jià)格是制約其在畜牧業(yè)領(lǐng)域研究及應(yīng)用的主要原因。

基因工程是獲得pEGF來源的好方法。乳酸乳球菌(Lactococcuslactis，L.lactis)是乳酸菌的一個(gè)典型模式菌株，存在于人和動(dòng)物的腸道中并發(fā)揮重要的生理功能，是公認(rèn)的安全級(jí)微生物(generally recognized as safe，GRAS)[7]。L.lactis具有不產(chǎn)生內(nèi)毒素、生長迅速和易于操作等優(yōu)點(diǎn)，成為表達(dá)外源蛋白的理想候選者；另外，L.lactis表達(dá)的外源蛋白可保持天然構(gòu)型，不需要進(jìn)一步純化可直接連同菌體一起服用[8]。目前，采用L.lactis載體系統(tǒng)已經(jīng)表達(dá)出了多種外源抗原(出血性敗血癥病毒G蛋白、Ⅲ型鴨乙型肝炎病毒VP1蛋白)[9-10]、酶類(β-1，4-葡聚糖內(nèi)切酶egl3、L-乳酸脫氫酶)[11-12]和活性肽(胰島素樣生長因子-Ⅰ、牛乳鐵蛋白肽)[13-14]等，并應(yīng)用于食品工業(yè)、生物制藥和疫苗等研究領(lǐng)域。pEGF的來源有限制約了其在斷奶仔豬上的研究及應(yīng)用，L.lactis表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)發(fā)展成熟，鑒于此，本研究采用L.lactis高效誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建表達(dá)pEGF的重組L.lactis，以葡聚糖硫酸鈉(dextra sulfate sodium，DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠為模型動(dòng)物，研究重組pEGF對(duì)腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)、通透性和細(xì)胞因子濃度的影響，評(píng)價(jià)其對(duì)損傷腸道的修復(fù)作用，為將表達(dá)pEGF重組L.lactis應(yīng)用于斷奶仔豬腸道保護(hù)提供重要的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

乳酸鏈球菌素(Nisin)誘導(dǎo)型細(xì)胞內(nèi)表達(dá)載體pNZ8148和宿主菌L.lactisNZ9000購自荷蘭NIZO研究所。

1.2 主要試劑

Nisin購自美國Sigma公司，限制性內(nèi)切酶NcoⅠ、HindⅢ和T4 DNA連接酶購自美國NEB公司，兔抗EGF單克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗均購自美國Abcam公司，DSS(相對(duì)分子質(zhì)量為36 00～50 000)購自上海MP公司，10%中性甲醛購自杭州長青化工有限公司。

1.3 pEGF基因設(shè)計(jì)與優(yōu)化

pEGF是一個(gè)由53個(gè)氨基酸組成的分子質(zhì)量為6.05 ku的小分子蛋白質(zhì)，為了增加表達(dá)量，根據(jù)GenBank中登錄的pEGF基因序列，設(shè)計(jì)將3個(gè)拷貝數(shù)的pEGF基因同向串聯(lián)，相鄰pEGF序列之間通過柔性Linker(氨基酸序列為GGGGSG)連接。然后，基于L.lactis對(duì)密碼子的偏好性進(jìn)一步優(yōu)化該序列，并在基因序列全長的5′端加入限制性內(nèi)切酶NcoⅠ，3′端加入終止密碼子(TAA)和限制性內(nèi)切酶HindⅢ?？偦蛐蛄虚L度542 bp，重組蛋分子質(zhì)量約19 ku。將設(shè)計(jì)好的基因序列送至上海生物工程有限公司合成。

1.4 重組L. lactis的構(gòu)建

將表達(dá)載體pNZ8148用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ、HindⅢ雙酶切，純化回收雙酶切載體片段。將合成好的3pEGF基因與表達(dá)載體連接，電轉(zhuǎn)化至感受態(tài)L.lactisNZ9000中，利用氯霉素(10 mg/mL)對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選，挑取白色菌落，培養(yǎng)重組菌，然后提取重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定與DNA序列測定(由上海英俊生物技術(shù)有限公司完成)。鑒定正確的質(zhì)粒命名為pNZ8148-3pEGF，重組菌命名為L.lactisNZ9000 (pNZ8148-3pEGF)。

1.5 重組pEGF的表達(dá)及Western blot檢測

將重組菌L.lactisNZ9000 (pNZ8148-3pEGF)接種于GM17液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)至光密度(OD)=0.4～0.5，加入終濃度為5 μg/L的誘導(dǎo)劑Nisin，繼續(xù)培養(yǎng)3 h；將培養(yǎng)物離心后收集菌體，向菌體中加入等體積的1倍上樣緩沖液，沸水浴10 min后離心，上清液經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，以羊抗EGF單克隆抗體為一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗兔為二抗，對(duì)目的蛋白進(jìn)行分析。

1.6 表達(dá)pEGF重組L. lactis對(duì)小鼠腸道損傷修復(fù)作用的研究

將32只8周齡雌性BALB/c小鼠(購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，體重為18～24 g)隨機(jī)分為4組，每組8只。采用4%的DSS建立小鼠結(jié)腸炎模型，各組小鼠具體處理如下：正常對(duì)照組，試驗(yàn)第1～12天飲用自來水；DSS模型對(duì)照組，試驗(yàn)第1～7天飲用4%的DSS水溶液，第8～12天飲用自來水；L.lactis組，飲水按照DSS模型對(duì)照組處理，同時(shí)每天08：00口服(灌胃)1×1012CFUL.lactisNZ9000 (pNZ8148)，連續(xù)口服12 d；重組L.lactis組，飲水按照DSS模型對(duì)照組處理，同時(shí)每天08：00口服(灌胃)1×1012CFU重組L.lactisNZ9000 (pNZ8148-3pEGF)，連續(xù)口服12 d。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為(24±1) ℃、相對(duì)濕度40%～70%，光照周期12 h明、12 h暗。

1.7 小鼠樣本采集及處理

試驗(yàn)第13天，于小鼠眶下靜脈采血，分離血清；頸椎脫臼法處死小鼠，沿腹中線打開腹腔，取出腸道組織，測定小鼠盲腸端至肛門的結(jié)腸長度；截取1 cm結(jié)腸組織放入10%中性甲醛溶液中，樣品經(jīng)石蠟包埋后切片，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosinstaining，HE)染色，顯微鏡下觀察小鼠結(jié)腸形態(tài)結(jié)構(gòu)，用于組織病理學(xué)分析。剩余的結(jié)腸放于-70 ℃冰箱保存待測其他指標(biāo)。

1.8 結(jié)腸通透性相關(guān)指標(biāo)及細(xì)胞因子濃度的測定

準(zhǔn)確稱取小鼠結(jié)腸重量，加入滅菌生理鹽水，機(jī)械勻漿后離心取上清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法測定結(jié)腸閉鎖蛋白(occludin)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)濃度，采用比色法測定小鼠血清二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO)活性和D-乳酸(D-lactate，D-LAC)濃度。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)及Duncan氏法多重比較，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01則為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 表達(dá)pEGF重組L. lactis的構(gòu)建

表達(dá)載體pNZ8148經(jīng)限制性內(nèi)切酶NcoⅠ、HindⅢ雙酶切后，與合成的3pEGF基因片段連接并轉(zhuǎn)化至L.lactisNZ9000中，重組質(zhì)粒經(jīng)NcoⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定，目的基因大小相符(圖1)，證明外源基因3pEGF插入表達(dá)載體中。測序結(jié)果表明目的片段序列正確，3pEGF基因插入位置和方向與預(yù)期結(jié)果完全一致。

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) DNA marker；1、2：NcoⅠ、HindⅢ雙酶切 NcoⅠ and HindⅢ double digestion；3pEGF：3個(gè)拷貝數(shù)的豬表皮生長因子 3 copies of porcine epidermal growth factor。

2.2 pEGF的表達(dá)及Western blot分析

L.lactisNZ9000 (pNZ8148-3pEGF)經(jīng)Nisin誘導(dǎo)表達(dá)后，菌體裂解液經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，采用Western blot方法檢測重組蛋白，與L.lactisNZ9000 (pNZ8148)相比，膜上重組菌的位置出現(xiàn)特異性條帶(圖2)，說明L.lactis能夠表達(dá)pEGF，且能與EGF單克隆抗體結(jié)合，初步證明重組pEGF具有生物活性。

1、3：L. lactis NZ9000 (pNZ8148-3pEGF)菌體蛋白 bacterial protein of L. lactis NZ9000 (pNZ8148-3pEGF)；2、4：L. lactis NZ9000 (pNZ8148)菌體蛋白 bacterial protein of L. lactis NZ9000 (pNZ8148)。

2.3 試驗(yàn)小鼠臨床表現(xiàn)

正常對(duì)照組小鼠采食、飲水、活動(dòng)及精神狀態(tài)均正常，皮毛順滑有光澤，無便血。DSS模型對(duì)照組小鼠飲用4% DSS水溶液后，采食和飲水逐漸減少，活動(dòng)遲緩，精神萎靡，皮毛蓬松無光澤，試驗(yàn)第6天全部出現(xiàn)直腸便血或水樣稀便。L.lactis組小鼠采食和飲水也相應(yīng)減少，皮毛蓬松，試驗(yàn)第6天直腸出現(xiàn)血便，個(gè)別出現(xiàn)稀便。重組L.lactis組小鼠皮毛順滑，活動(dòng)和精神狀況較為正常，個(gè)別小鼠出現(xiàn)稀便。

2.4 試驗(yàn)小鼠結(jié)腸長度及形態(tài)

與正常對(duì)照組相比，DSS模型對(duì)照組小鼠結(jié)腸長度顯著降低(P<0.05)，降低了34.77%(圖3)。與DSS模型對(duì)照組和L.lactis組相比，重組L.lactis組小鼠結(jié)腸長度顯著增加(P<0.05)，分別增加了34.32%和19.72%，并與正常對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)(圖3)。DSS模型對(duì)照組和L.lactis組間小鼠結(jié)腸長度差異不顯著(P>0.05)。上述結(jié)果說明口服表達(dá)pEGF的重組L.lactis抑制了小鼠結(jié)腸的縮短。

數(shù)據(jù)柱形標(biāo)注相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

HE染色結(jié)果(圖4)顯示，正常對(duì)照組小鼠結(jié)腸結(jié)構(gòu)清晰，黏膜層上皮細(xì)胞完整，未見脫落，未見炎癥細(xì)胞浸潤和潰瘍等；DSS模型對(duì)照組小鼠結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞大量脫落，可見潰瘍形成，較多的炎癥細(xì)胞浸潤，潰瘍周邊上皮細(xì)胞增生；L.lactis組小鼠結(jié)腸結(jié)構(gòu)尚存在，黏膜層上皮細(xì)胞不完整，部分脫落，可見潰瘍和少量炎癥細(xì)胞浸潤等；重組L.lactis組小鼠結(jié)腸黏膜上皮修復(fù)，未見糜爛和潰瘍，僅見黏膜層內(nèi)少量炎癥細(xì)胞浸潤。

組Ⅰ：正常對(duì)照組 normal control group；組Ⅱ：DSS模型對(duì)照組DSS model control group；組Ⅲ：L. lactis組L.lactis group；組Ⅳ：重組L. lactis組recombinant L. lactis group。

2.5 試驗(yàn)小鼠腸道通透性相關(guān)指標(biāo)及細(xì)胞因子濃度

由表1可知，與正常對(duì)照組相比，DSS模型對(duì)照組小鼠結(jié)腸occludin濃度顯著降低(P<0.05)，降低了30.43%，D-LAC濃度顯著增加(P<0.05)，DAO活性極顯著升高(P<0.01)，分別升高了60.81%和56.48%。與DSS模型對(duì)照組相比，L.lactis組小鼠結(jié)腸DAO活性、D-LAC和occludin濃度均差異不顯著(P>0.05)；重組L.lacits組小鼠結(jié)腸occludin濃度顯著增加(P<0.05)，增加了40.63%，D-LAC濃度顯著降低(P<0.05)，DAO活性極顯著降低(P<0.01)，分別降低了36.13%和26.03%。重組L.lacits組小鼠結(jié)腸D-LAC濃度和DAO活性均顯著低于L.lacits組(P<0.05)，分別降低了29.62%和17.27%。

由表1可知，與正常對(duì)照組相比，DSS模型對(duì)照組小鼠結(jié)腸IL-10濃度極顯著降低(P<0.01)，IL-4濃度顯著降低(P<0.05)，分別降低了32.19%和21.94%，TNF-α濃度極顯著增加(P<0.01)，增加了29.37%。與DSS模型對(duì)照組相比，L.lacits組小鼠結(jié)腸IL-10濃度極顯著增加(P<0.01)，增加了36.21%，而IL-4和TNF-α濃度均差異不顯著(P>0.05)；重組L.lacits組小鼠結(jié)腸IL-10濃度極顯著增加(P<0.01)，IL-4濃度顯著增加(P<0.05)，分別增加了58.87%和27.86%，結(jié)腸TNF-α濃度有降低的趨勢。與正常對(duì)照組和L.lactis組相比，重組L.lacits組小鼠結(jié)腸TNF-α、IL-10和IL-4濃度均差異不顯著(P>0.05)。

表1 口服重組L. lactis對(duì)小鼠結(jié)腸通透性相關(guān)指標(biāo)及細(xì)胞因子濃度的影響

3 討 論

EGF是一種重要的細(xì)胞調(diào)控因子，可促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞增殖和分化，加速腸道創(chuàng)傷愈合，在消化道成熟、功能完善以及抵抗應(yīng)激方面發(fā)揮重要作用。EGF具有較高的穩(wěn)定性，對(duì)熱、酸具有耐受性，能抵抗胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶的消化，這對(duì)其在腸道發(fā)揮生物學(xué)作用具有重要意義[5]。然而，有限的來源是限制EGF在畜牧領(lǐng)域研究及應(yīng)用的主要原因，基因工程是獲得EGF的好方法。目前，已有報(bào)道采用大腸埃希菌(Escherichiacoli，E.coli)和畢赤酵母(Pichiapastoris，P.pastoris)系統(tǒng)表達(dá)pEGF。Lee等[15]采用P.pastoris成功表達(dá)pEGF，并將pEGF分泌于上清液中。賀超等[16]構(gòu)建了1、2和3個(gè)pEGF拷貝數(shù)的原核重組表達(dá)質(zhì)粒，不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli后均表達(dá)了pEGF。但是采用E.coli表達(dá)pEGF多以包涵體形式存在，需經(jīng)過提取、純化及復(fù)性等繁瑣處理，且內(nèi)毒素較難去除；而采用P.pastoris表達(dá)系統(tǒng)需要甲醇誘導(dǎo)，還需進(jìn)一步加工脫毒處理。L.lactis作為宿主菌的優(yōu)勢在于它屬于食品級(jí)微生物，表達(dá)的外源蛋白以可溶性形式存在，可保持天然構(gòu)型，連同菌體一起可直接口服，具有安全、方便和經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)。因此，本試驗(yàn)采用L.lactis高效誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，將3個(gè)拷貝數(shù)的pEGF基因序列串聯(lián)并優(yōu)化，成功構(gòu)建了表達(dá)pEGF的重組L.lactis，并且重組pEGF以可溶性形式存在，Western blot分析顯示重組蛋白能夠與特異性抗體結(jié)合，初步證明L.lactis表達(dá)的pEGF具有生物活性。

本研究采用DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎模型，并同時(shí)給小鼠口服重組L.lactis，以進(jìn)一步驗(yàn)證重組pEGF的生物活性及對(duì)損傷腸道的修復(fù)作用。DSS結(jié)腸炎模型是目前應(yīng)用最廣的一種腸炎模型，通過給小鼠飲用4～7 d的2%～5%DSS水溶液來造模，造模成功的結(jié)腸炎模型小鼠會(huì)出現(xiàn)腹瀉、便血、結(jié)腸縮短現(xiàn)象，病理檢測顯示結(jié)腸多灶性潰瘍，黏膜炎癥明顯[17]。在本研究中，飲用4%DSS溶液7 d后小鼠全部出現(xiàn)腹瀉及便血現(xiàn)象，結(jié)腸明顯縮短，組織病理檢測發(fā)現(xiàn)結(jié)腸嚴(yán)重潰瘍，黏膜上皮細(xì)胞大量脫落，較多炎癥細(xì)胞浸潤，說明結(jié)腸炎模型構(gòu)建成功。而口服表達(dá)pEGF重組L.lacits小鼠個(gè)別出現(xiàn)水樣稀便，結(jié)腸長度顯著增加，HE染色發(fā)現(xiàn)小鼠結(jié)腸黏膜上皮修復(fù)，未見糜爛和潰瘍，僅見黏膜層內(nèi)少量炎癥細(xì)胞浸潤。EGF是一類對(duì)腸道黏膜有營養(yǎng)、成熟和治療性作用的縮氨酸，具有促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增殖和分化，加速腸道創(chuàng)傷愈合的重要作用[18-19]。本課題組前期研究結(jié)果顯示，皮下注射EGF可改善DSS結(jié)腸炎模型小鼠結(jié)腸組織形態(tài)，降低結(jié)腸損傷程度評(píng)分[20]。林軍等[21]研究顯示，給結(jié)腸炎模型大鼠注射EGF并聯(lián)合飼喂谷氨酰胺，可增加組織營養(yǎng)和能量供給，抑制炎癥反應(yīng)，對(duì)結(jié)腸黏膜具有保護(hù)作用。在本研究中，小鼠口服表達(dá)pEGF的重組L.lacits抑制了小鼠結(jié)腸的縮短，修復(fù)了腸道黏膜損傷，維持了結(jié)腸上皮結(jié)構(gòu)的相對(duì)完整性。

腸道不僅是營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的場所，也是阻止腸腔內(nèi)細(xì)菌、毒素等有害物質(zhì)入侵體內(nèi)的重要屏障，屏障功能的完整性是維持腸道正常功能和動(dòng)物健康的關(guān)鍵因素。occludin是腸道細(xì)胞間緊密連接(tight junction，TJ)的主要結(jié)構(gòu)蛋白，與TJ的組裝、穩(wěn)定性和腸道屏障功能密切相關(guān)，其濃度降低會(huì)導(dǎo)致腸道通透性增加、腸道屏障功能障礙等[22]。EGF具有保護(hù)腸道屏障功能完整性的作用。研究顯示，給壞死性腸炎大鼠補(bǔ)充EGF，EGF可通過促進(jìn)杯狀細(xì)胞的成熟和黏液的產(chǎn)生來維持腸道損傷部位的完整性，調(diào)節(jié)腸道TJ蛋白的表達(dá)水平，改善腸道屏障功能[23]。把腸上皮細(xì)胞Caco-2暴露在甲醛溶液中，可增加Caco-2對(duì)菊糖和脂多糖的細(xì)胞旁通透性，降低occludin濃度，而補(bǔ)充EGF可阻止甲醛對(duì)TJ與黏合連接的破壞，提高occludin濃度[24]。在本研究中，小鼠飲用4%的DSS水溶液顯著降低了結(jié)腸occludin濃度，而口服表達(dá)pEGF的重組L.lacits顯著增加了小鼠結(jié)腸occludin濃度，并與正常對(duì)照組相比差異不顯著，說明DSS增加了結(jié)腸的通透性，破壞了腸道的屏障功能，給小鼠口服表達(dá)pEGF的重組L.lacits可降低結(jié)腸的通透性，緩解DSS對(duì)腸道屏障功能的破壞，這個(gè)結(jié)果與HE染色結(jié)果相一致。

血清DAO活性和D-LAC濃度被認(rèn)為是反映腸道機(jī)械屏障完整性和受損傷程度的重要指標(biāo)[25]。DAO是腸道絨毛中具有高度活性的細(xì)胞內(nèi)酶，在組胺及多胺代謝中起作用；D-LAC是腸道細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。正常情況下DAO和D-LAC主要存在腸道內(nèi)，當(dāng)腸道屏障功能受到損傷，黏膜通透性增加，腸道內(nèi)的DAO和D-LAC則通過受損的黏膜釋放到血液中，導(dǎo)致血清中DAO活性和D-LAC濃度升高。研究顯示，DSS能夠增加腸道通透性，誘導(dǎo)大鼠或小鼠血漿DAO活性和D-LAC濃度顯著升高[26-27]。在本研究中，DSS模型對(duì)照組小鼠血清DAO活性極顯著高于正常對(duì)照組，血清D-LAC濃度顯著高于正常對(duì)照組，說明了小鼠飲用4%的DSS水溶液導(dǎo)致腸道黏膜損傷，腸道黏膜通透性增加，而口服重組L.lacits則顯著降低了血清D-LAC濃度，極顯著降低了血清DAO活性，進(jìn)一步提示表達(dá)pEGF的重組L.lacits改善了腸道的通透性，對(duì)腸道屏障具有保護(hù)作用。

細(xì)胞因子在調(diào)節(jié)腸道免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，促炎性細(xì)胞因子與抗炎性細(xì)胞因子間的平衡失調(diào)是導(dǎo)致腸道免疫機(jī)能障礙的主要原因。研究顯示，小鼠自由飲用3%的DSS水溶液10 d，結(jié)腸白細(xì)胞介素-8(IL-8)濃度顯著升高，IL-10濃度顯著降低[28]；大鼠口服3%的DSS水溶液8 d，結(jié)腸IL-4濃度顯著降低，TNF-α濃度顯著升高[29]。目前關(guān)于DSS結(jié)腸炎的具體致病機(jī)制仍不清楚，可能與巨噬細(xì)胞的功能失調(diào)、細(xì)胞因子濃度改變，以及DSS對(duì)結(jié)腸上皮的毒性作用等多種因素有關(guān)。研究顯示，IL-10具有很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用，可調(diào)節(jié)Th1和Th2細(xì)胞因子的平衡，有效抑制白細(xì)胞介素-1(IL-1)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-12(IL-12)和TNF-α等促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生[30]。腸上皮細(xì)胞缺失IL-10，可導(dǎo)致腸道黏膜屏障損傷[31]。IL-4是由肥大細(xì)胞或活化的Th2細(xì)胞產(chǎn)生，可抑制細(xì)胞因子IL-6、IL-8、IL-1和TNF-α等的產(chǎn)生，隨著IL-4濃度升高，炎癥抑制的效果更顯著[32]。TNF-α是結(jié)腸炎致病的關(guān)鍵細(xì)胞因子，通過表達(dá)黏附分子、凝血因子等啟動(dòng)細(xì)胞毒性、凋亡和急性期反應(yīng)等發(fā)揮作用。在結(jié)腸炎早期抑制TNF-α產(chǎn)生，可減輕或阻止結(jié)腸炎的發(fā)生[33]。在本研究中，與正常對(duì)照組相比，DSS模型對(duì)照組小鼠結(jié)腸TNF-α濃度極顯著升高，IL-10濃度極顯著降低，IL-4濃度顯著降低；口服表達(dá)pEGF的重組L.lactis改善了結(jié)腸中細(xì)胞因子濃度，極顯著提高了IL-10濃度，顯著提高了IL-4濃度，并有降低TNF-α濃度的趨勢，并且上述細(xì)胞因子濃度與正常對(duì)照組比較差異不顯著。這些結(jié)果說明L.lactis表達(dá)的pEGF具有良好的生物活性，可以調(diào)節(jié)TNF-α、IL-10和IL-4濃度達(dá)到正常水平，顯著抑制了腸道炎癥反應(yīng)，對(duì)損傷的腸道具有修護(hù)作用。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)成功構(gòu)建了表達(dá)pEGF的重組L.lactis，重組pEGF具有良好生物活性；結(jié)腸炎模型小鼠口服表達(dá)pEGF的重組L.lactis，可抑制結(jié)腸的縮短，改善結(jié)腸的形態(tài)結(jié)構(gòu)和通透性，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子濃度達(dá)到正常水平，維護(hù)腸道屏障功能的相對(duì)完整性，對(duì)損傷腸道具有修復(fù)作用。