袁南貴，羅雪平，胡玉萍，姚斌，黃偉玲

乳腺癌是女性最為常見的惡性腫瘤之一，具有較高的發(fā)病率和病死率。2019年全世界發(fā)現(xiàn)乳腺癌約210萬，嚴(yán)重威脅女性健康[1]。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展受多種因素、多種方式共同影響，基于美國國家生物信息中心的GEO數(shù)據(jù)庫中乳腺癌基因表達(dá)芯片顯示，與甘油酯類、活性氮類及輔酶類代謝過程相關(guān)基因的差異性表達(dá)可能與乳腺癌預(yù)后有關(guān)[2]。其中，喹啉酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(quinolinic acid phosphoribosyltransferase，QPRT)是喹啉酸鹽代謝中的關(guān)鍵酶，可能參與乳腺癌輔酶代謝過程，并且QPRT高表達(dá)提示乳腺癌患者較低生存率，與患者預(yù)后不良有關(guān)[2]。關(guān)于QPRT與乳腺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系研究國內(nèi)外鮮見報道。近年來，微小RNA(microRNA，miRNA)在惡性腫瘤中的作用越來越受到關(guān)注，通過靶向mRNA的3’非翻譯區(qū)而抑制其靶基因的表達(dá)，參與腫瘤的增殖、分化、侵襲過程[3-4]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-26b-5p通過孕激素受體A亞型(progesterone receptor A，PR-A)受黃體酮激素調(diào)控，其表達(dá)水平與PR-A呈正相關(guān)，獨立介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[5]。因此，本研究通過檢測乳腺癌組織中QPRT、miR-26b-5p表達(dá)水平，探究其與乳腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性，討論其潛在臨床價值，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年3月—2017年10月于廣州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院行乳腺癌改良根治術(shù)女性患者89例為觀察組，經(jīng)病理組織檢查均為乳腺浸潤性導(dǎo)管癌，年齡29～67歲，中位數(shù)49歲；絕經(jīng)55例；腫瘤直徑≥6 cm 52例，<6 cm 37例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期31例，Ⅲ～Ⅳ期58例；低分化程度62例，中、高分化程度27例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移55例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移34例。同時取癌旁正常乳腺組織為對照組。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)同意，患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前均未接受任何輔助化療或內(nèi)分泌治療；②病理組織石蠟標(biāo)本均保存完整；③臨床資料完整。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他腫瘤；②合并免疫缺陷、傳染性疾?。虎垡蚋鞣N原因拒絕參與本研究者。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 免疫組化法檢測QPRT表達(dá)水平：乳腺癌改良根治術(shù)后，將乳腺癌組織做成石蠟標(biāo)本，連續(xù)切片厚度4 μm，進行脫蠟處理，采用鏈霉親合素—生物素復(fù)合物(SP)法染色，方法步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。一抗采用兔anti-QPRT單克隆抗體試劑盒(購自上海愛必信生物科技有限公司)按照1∶50稀釋，組織切片與一抗在4℃過夜，隨后加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗兔IgG(1∶200，購自美國Abcam公司)孵育1 h，再加入SP孵育30 min，將每個切片在二氨基聯(lián)苯胺(DAB)工作液500 μl中室溫下浸泡3～10 min，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。用磷酸鹽緩沖液作為陰性對照。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：(1)按染色強度記分，無染色為0分，淺黃色為1分，黃色或黃棕色2分，棕褐色為3分；(2)按陽性細(xì)胞百分比記分，無陽性細(xì)胞記0分，陽性細(xì)胞<25%記1分，25%～50%記2分，51%～75%記3分，>75%記4分。取2種方法得分的乘積，乘積0分為陰性(-)，1分為弱陽性(+)，2～3分為陽性(++)，>3分為強陽性(+++)；同時定義>3分為高表達(dá)，≤3分為低表達(dá)。

1.3.2 原位雜交技術(shù)檢測miR-26b-5p表達(dá)水平：石蠟切片經(jīng)梯度脫蠟后利用3%雙氧水在室溫下浸泡10 min，蒸餾水清洗3遍，按照試劑盒說明書方法進行原位雜交，置于光學(xué)顯微鏡(德國徠卡公司，型號DM1000)觀察。 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：(1)按染色強度，無染色或淺黃色顆粒為1分，黃色或黃棕色顆粒為2分，棕褐色顆?；驁F片狀為3分；(2)按陽性細(xì)胞百分比記分：無陽性細(xì)胞記0分，陽性細(xì)胞<10%記1分，10%～50%記2分，>50%記3分。取2種方法得分的乘積，乘積0分為陰性(-)，1分為弱陽性(+)，2～3分為陽性(++)，>3分為強陽性(+++)；同時定義>3分為高表達(dá)，≤3分為低表達(dá)。

1.3.3 記錄隨訪情況：患者術(shù)后即進行規(guī)范的后續(xù)治療并進入隨訪觀察，每3個月進行一次電話或門診隨訪，觀察記錄患者3年內(nèi)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移情況。

2 結(jié) 果

2.1 乳腺癌組織與正常乳腺組織QPRT、miR-26b-5p表達(dá)比較 QPRT主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，miR-26b-5p主要定位于細(xì)胞質(zhì)，見圖1、2。乳腺癌組織中QPRT表達(dá)(-)16例(17.98%)，(+～++)34例(38.20%)，(+++)39例(43.82%)，其陽性表達(dá)率82.02%，明顯高于癌旁正常乳腺組織的26.97%(χ2=54.395，P=0.000)；乳腺癌組織中miR-26b-5p表達(dá)(-)43例(48.32%)，(+～++)29例(32.58%)，(+++)17例(19.10%)，其陽性表達(dá)率51.68%，明顯低于癌旁正常乳腺組織的85.39%(χ2=23.448，P=0.000)，見表1。

表1 QPRT、miR-26b-5p在乳腺癌組織與正常乳腺組織中的表達(dá)比較 [例(%)]

圖1 QPRT在乳腺癌組織中的表達(dá)情況(免疫組化染色，×400)

圖2 miR-26b-5p在乳腺癌組織中的表達(dá)情況(原位雜交技術(shù)， ×400)

2.2 QPRT、miR-26b-5p在乳腺癌組織中表達(dá)的關(guān)系 利用Spearman分析乳腺癌組織中QPRT、miR-26b-5p表達(dá)關(guān)系，結(jié)果顯示二者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.343，P=0.000)。

2.3 QPRT、miR-26b-5p在不同臨床/病理特征中表達(dá)水平比較 在乳腺癌組織中QPRT、miR-26b-5p高低表達(dá)水平在不同年齡、是否絕經(jīng)、腫瘤直徑中比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，在不同TNM分期、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況中比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 乳腺癌組織QPRT、miR-26b-5p在不同臨床/病理特征中表達(dá)水平比較 [例(%)]

2.4 QPRT、miR-26b-5p表達(dá)水平與乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系 QPRT高表達(dá)組乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率為65.38%(34/52)，明顯高于QPRT低表達(dá)組的29.73%(11/37)(χ2=13.260，P=0.000)；miR-26b-5p低表達(dá)組患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率為63.79%(37/58)，明顯高于miR-26b-5p高表達(dá)組的25.81%(8/31)(χ2=12.550，P=0.000)，見圖3。

圖3 QPRT、miR-26b-5p表達(dá)水平與乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

2.5 影響乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的COX多因素分析 分化程度低、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移、QPRT高表達(dá)、miR-26b-5p低表達(dá)是影響乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的危險因素(P<0.05)，見表3。

表3 影響乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的COX多因素分析

3 討 論

乳腺癌是女性最常見的癌癥，并逐漸成為影響女性健康的一個重要因素。近年來，全球乳腺癌的發(fā)病率和病死率持續(xù)上升，2019年美國約有26.8萬例乳腺癌新增病例和4.2萬死亡病例，其發(fā)病率和病死率分別排名第一、二位，占所有新發(fā)癌癥患者的30%和癌癥相關(guān)死亡人數(shù)的15%，中國和印度等發(fā)展中國家的乳腺癌發(fā)病率也呈逐年增長趨勢[6-9]，因此，早期診斷、及時治療對改善乳腺癌患者預(yù)后具有重要意義。

乳腺癌是一種高度異質(zhì)性疾病，具有明顯的分子特征和基因表達(dá)特征[10-11]。隨著臨床治療的不斷優(yōu)化，乳腺癌的病死率明顯下降，但其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)在臨床上仍是一個巨大的挑戰(zhàn)。Xu等[12]利用4個基因表達(dá)數(shù)據(jù)集(GEO)和癌癥基因組圖譜(TCGA)對乳腺癌和正常組織的差異表達(dá)基因(DEGs)進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)547個DEGs(302個上調(diào)，245個下調(diào))，最終確定了7個重要的預(yù)后候選基因，QPRT為其中之一。QPRT是一種新生煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)合成途徑中的關(guān)鍵酶，以往研究發(fā)現(xiàn)QPRT與Wilms腫瘤基因1(WT1)關(guān)系密切，是白血病及其他惡性腫瘤的致癌基因[13-14]。QPRT在乳腺癌中的作用越來越受到重視。本結(jié)果顯示，QPRT在乳腺癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于正常乳腺組織，表明QPRT在乳腺癌中可能發(fā)揮癌基因作用。乳腺癌組織中QPRT表達(dá)水平在不同TNM分期、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移中比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表明QPRT可能參與乳腺癌的增殖分化、轉(zhuǎn)移侵襲過程。有研究發(fā)現(xiàn)，與正常乳腺組織相比，QPRT在乳腺癌組織中過表達(dá)，且與患者進展不良有關(guān)；體外實驗發(fā)現(xiàn)，唐氏綜合征細(xì)胞黏附分子反義RNA1(DSCAM-AS1)通過競爭性結(jié)合miR-150-5p和miR-2467-3p增加QPRT表達(dá)，可促進乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，且抑制細(xì)胞凋亡[15]。提示QPRT可能與其靶基因結(jié)合而表達(dá)上調(diào)，參與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展進程。本研究還發(fā)現(xiàn)，QPRT高表達(dá)患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率明顯高于QPRT低表達(dá)患者，且QPRT高表達(dá)是影響乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的危險因素，表明QPRT高表達(dá)與患者預(yù)后不良有關(guān)，但具體作用機制尚不明了。

miRNA是一類進化高度保守的單鏈RNA，結(jié)合于靶基因的3’-非翻譯區(qū)，通過阻止翻譯或直接降解mRNA來抑制基因表達(dá)[16-18]。本研究結(jié)果顯示，miR-26b-5p在乳腺癌組織中陽性表達(dá)率顯著低于癌旁正常乳腺組織，并且其表達(dá)水平與患者TNM分期、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)，miR-26b-5p低表達(dá)是影響乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的危險因素，表明miR-26b-5p可能參與乳腺癌患者腫瘤細(xì)胞分化、侵襲及轉(zhuǎn)移等病理過程。田連芳等[19]研究發(fā)現(xiàn)，miR-26b-3p在乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-453中表達(dá)最低，細(xì)胞實驗證實miR-26b-3p可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，通過與其下游靶基因E盒鋅指結(jié)合蛋白1(ZEB1)結(jié)合參與腫瘤的發(fā)展過程。另有研究認(rèn)為[20]，miR-26b作為miR-26家族一員，其在炎性乳腺癌中的表達(dá)水平低于非炎性局部晚期乳腺癌，且均低于正常乳腺組織，這種表達(dá)下降可能與炎性表型、三陰性狀態(tài)及治療后腫瘤殘留有關(guān)；進一步研究發(fā)現(xiàn)，敲除miR-26b可靶向上調(diào)Zeste基因增強子同源物2(EZH2)蛋白表達(dá)，可能作為炎性乳腺癌和非炎性局部晚期乳腺癌的潛在治療靶點。本研究Spearman分析顯示，乳腺癌組織中QPRT和miR-26b-5p表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，推測低表達(dá)的miR-26b-5p可能靶向上調(diào)QPRT表達(dá)參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，具體作用機制有待進一步細(xì)胞實驗證實。

綜上所述，乳腺癌組織中QPRT表達(dá)上調(diào)，miR-26b-5p表達(dá)下調(diào)，二者可能存在靶向關(guān)系；其水平差異性表達(dá)與患者不良預(yù)后有關(guān)，可能作為治療乳腺癌的潛在靶點，具體機制值得進一步研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

袁南貴：設(shè)計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；羅雪平：提出研究思路，分析試驗數(shù)據(jù)，論文審核；胡玉萍：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改；姚斌：進行統(tǒng)計學(xué)分析；黃偉玲：課題設(shè)計，論文撰寫