蘭煒蘭，趙錦燕,2,3，彭 軍,2,3，黃 彬,2,3，林久茂,2,3*

(1. 福建中醫(yī)藥大學(xué) 中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；2. 福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350122 ；3. 中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)福建省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350122)

胃癌是在東亞地區(qū)發(fā)病率和死亡率最高的惡性消化道腫瘤之一[1-5]。近年來，隨著診療技術(shù)的進(jìn)步，胃癌的發(fā)病率有所下降，但胃癌患者的總體生存率仍然很低，5 年生存率為 5% ～ 20%，中位生存率為 10個(gè)月[4]。早期胃癌的首要治療方法是手術(shù)切除，對于晚期患者及術(shù)后復(fù)發(fā)患者，其主要的治療方式仍然是化療[5]。然而，由于化療產(chǎn)生的腫瘤多耐藥，使得化療藥物效果受限。因此，從中藥中篩選出具有高效、低毒的胃癌耐藥逆轉(zhuǎn)劑是目前抗胃癌研究面臨的新挑戰(zhàn)。

八寶丹（Babao Dan, BBD）源自1555 年宮廷秘方，至今已有 460 余年歷史。八寶丹的主要成分包括牛黃、三七、羚羊角、麝香、蛇膽、珍珠等，具有清熱解毒、祛濕退黃、活血止痛等功效，主要用于濕熱蘊(yùn)結(jié)所致的不適癥狀，肝膽疾病以及病毒性肝炎。臨床研究表明，八寶丹對胃癌的治療具有顯著療效，并且服用后可以減輕藥物治療后產(chǎn)生的毒副作用，延長胃癌患者的生存期等[6]。本課題組前期研究結(jié)果顯示，八寶丹能抑制 MGC803 和 AGS 胃癌細(xì)胞的生長及轉(zhuǎn)移，抑制血管新生并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7-9]。八寶丹對 SGC7901/DDP 胃癌耐藥細(xì)胞的研究報(bào)道較少，因此本實(shí)驗(yàn)旨在研究八寶丹對 SGC7901/DDP 生長及轉(zhuǎn)移的影響及其相關(guān)的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 藥物與試劑

八寶丹（國藥準(zhǔn)字：Z10940006，廈門中藥廠有限公司）規(guī)格：0.3 g/ 粒，批號(hào) ：180901。八寶丹溶液 ：取八寶丹粉末 250 mg，溶解于 10 mL PBS（磷酸鹽緩沖液）中，配制成 25 mg/mL 溶液， 超聲溶解，高壓滅菌后于 4℃貯存?zhèn)溆谩ｍ樸K（DDP）（100 mg,Cat. No. MKG2946）購于美國西格瑪公司；遷移侵襲板（Cat. No.9148012） 購于美國必第基底膜基質(zhì)公司；GAPDH （Cat. No.60004）、TGF-β （Cat. No.21898-1-AP）、Smad4 （Cat. No.51144-1-AP） 等購于美國沃森公 司；E-cadherin （Cat. No.14472）、N-cadherin （Cat.No.14215）、Vimentin （Cat. No.3390）、 MMP9 （Cat.No.13677）、p-Smad2/3（Cat. No. 8828）、MMP2 （Cat.No.87809）、Smad2/3（Cat. No. 8685）等抗體購于美國賽信通公司。

1.2 細(xì)胞株

SGC7901 細(xì)胞株和 SGC7901/DDP 細(xì)胞株購于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究所，保存在福建中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心液氮室。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

分別將 SGC7901 和 SGC7901/DDP 細(xì)胞置于 1%的 100 U/mL 青霉素和鏈霉素，過濾胎牛血清（10%的 FBS） 的 RPMI 1640 中，SGC7901/DDP 另 外 再加入 1 μg 的順鉑維持細(xì)胞耐藥性，培養(yǎng)在 37 ℃，含5% CO2的培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞生長至 75% ～ 85% 時(shí)，用胰酶消化，離心，按 1 ∶ 3 傳代培養(yǎng)（注 ：在細(xì)胞培養(yǎng)過程中及時(shí)凍存，便于保種；每次細(xì)胞傳至 7代時(shí)，重新復(fù)蘇細(xì)胞）。

2.2 胃癌 SGC7901/DDP 耐藥細(xì)胞 MDR 性驗(yàn)證

將 SGC7901、SGC7901/DDP 細(xì) 胞， 用 胰 酶消化離心后，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并用不含 DDP 的RPMI1640 完全培養(yǎng)基重懸，將 1.0 × 104個(gè)細(xì)胞接至96 孔板中過夜培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá) 60% 時(shí)，去掉原有培養(yǎng)基，根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆謩e加入不同濃度的 DDP 干預(yù) 48 h 后，去除原液，加入 0.05 mg/ 孔的MTT，37 ℃孵育 4 h 后，再加入 0.1 mL 的 DMSO，室溫放置 10 min 后，在 570 nm 處測吸光度值。對照組的細(xì)胞活力為 100%，計(jì)算不同濃度組細(xì)胞活力抑制率。并用 SPSS 計(jì)算 IC50，再通過 IC50計(jì)算耐藥指數(shù) RI。

細(xì)胞活力抑制率＝ [1－（實(shí)驗(yàn)組 A 值 / 對照組 A 值）] × 100%RI ＝ IC50（SGC7901/DDP）/IC50（SGC7901）

2.3 MTT 法檢測八寶丹對 SGC7901/DDP 細(xì)胞活力的影響

細(xì)胞加藥干預(yù)前處理同上（耐藥性驗(yàn)證），每孔加入 100 μL 濃度為（0、0.25、0.5、1.0 mg/mL）八寶丹的培養(yǎng)基，分別干預(yù) 48 h，干預(yù)后處理同上（耐藥性驗(yàn)證），在波長為 570 nm 處測得 A 值。

細(xì)胞活力＝（實(shí)驗(yàn)組 A 值／對照組 A 值）×100%

2.4 Transwell 分析細(xì)胞遷移和侵襲能力

將 SGC7901/DDP 細(xì) 胞 接 種 于 6 孔 板，2.5 ×105個(gè) / 孔，置 37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜，細(xì)胞匯合度達(dá)到 50% ～ 60% 時(shí)，分別用不同濃度八寶丹（0、0.25、0.5、1.0 mg/mL） 干 預(yù) 48 h。 重 新 消 化、 離心，調(diào)整活細(xì)胞濃度至 2.5 × 105個(gè) /mL，取 200 μL于含基質(zhì)膠（侵襲實(shí)驗(yàn)）或不含基質(zhì)膠 （遷移實(shí)驗(yàn)）的 Transwell 上室，同時(shí)在下室加入 0.75 mL 含 10%FBS 培養(yǎng)基孵育 24 h。鏡下觀察，有無細(xì)胞脫落。吸出小室里的液體，放入裝有 PBS 的孔中清洗，加入700 μL 和 200 μL 4% 多聚甲醛固定下室（小孔外層）和上室 10 min，輕輕吸去小室中的多聚甲醛，把小室放入含有 700 μL 結(jié)晶紫的孔中，上室加入200 μL結(jié)晶紫，染色 10 min，用 PBS 清洗上室，棉球擦干，待小室晾干后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞分布，并隨機(jī)選取 5 個(gè)視野以 200 × 拍照，通過觀察從Transwell上室迀移和侵襲到 Transwell 下室的細(xì)胞數(shù)目以評(píng)價(jià)細(xì)胞的迀移和侵襲能力。

2.5 粘附實(shí)驗(yàn)

采用粘附實(shí)驗(yàn)檢測八寶丹對胃癌耐藥細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的影響。細(xì)胞前處理同上（Transwell 實(shí)驗(yàn)），吸棄各孔溶液，各孔分別進(jìn)行消化，重懸，將 5 × 104個(gè) /mL，重新接于 6 孔板孵育 6 h 后，除去各孔溶液，用 PBS 洗兩遍 , 甲醛固定后，再用 1 mL 的 0.1% 結(jié)晶紫染色 15 min，清洗干凈后，最后在 200 × 的顯微鏡下拍照。

2.6 Western Blot 實(shí)驗(yàn)

胃癌耐藥細(xì)胞以 5×105個(gè)接種于 25 cm2培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞匯合度達(dá)到 60% ～ 70% 時(shí)，加 5 mL 含不同 濃 度 八 寶 丹（0、0.25、0.5、1.0 mg/mL） 完 全培養(yǎng)基干預(yù) 48 h 后，用顯微鏡拍照記錄細(xì)胞數(shù)量及狀態(tài)，細(xì)胞用事先預(yù)冷好的 PBS 清洗細(xì)胞 2 次后，吸干 PBS，根據(jù)需要配制裂解液，然后根據(jù)細(xì)胞匯合度及數(shù)量將適量裂解液加到培養(yǎng)瓶中。用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮到一角，將液體收集到 1.5 mL 小管中，隔5 min振蕩 1 次，共震蕩 3 次，使細(xì)胞完全裂解。然后，將液體置于低溫高速離心機(jī)中 4 ℃，14 000 r/min，離心 20 min。再把上清液收集至 200 μL EP 管中，蛋白提取過程全程置冰上。用 BCA 法測定蛋白濃度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算所需待測樣品蛋白的量以及變性緩沖液的量，取 30 μg 的待測蛋白及變性緩沖液充分震蕩后離心，在 100 ℃的金屬浴中 5 min，充分變性 ；變性后進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜（PVDF 膜）；然后將膜放入 TBS 中清洗兩次，每次 5 min，并做好標(biāo)記，用脫脂奶粉在常溫?fù)u床中封閉 1 h ；用 TBST 清洗三遍（每次 10 min），然后浸于實(shí)驗(yàn)所需的一抗溶液孵育（抗體濃度 1 ∶ 1 000），4 ℃搖床過夜。16 ～ 18 h后從一抗溶液中取出膜，用 TBST 漂洗濾膜 3 次，每次 10 min。然后將膜放入二抗溶液中（按說明書配制二抗），搖床上室溫?fù)u動(dòng) 1 h。然后從二抗溶液中取出膜，用 TBST 漂洗濾膜 3 次，每次 10 min ；取出膜，配制顯色液（ECL A 液∶ B 液為 1 ∶ 1），均勻地加在 PVDF 膜上（每條膜加 200 ～ 250 μL），避光反應(yīng)1 min 后，立即進(jìn)行顯影觀察 （美國伯樂公司）。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用 SPSS 21.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差 （±s） 表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，方差不齊，采用Games-Howell 檢驗(yàn)。以P ＜ 0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 SGC7901/DDP 細(xì)胞耐藥性驗(yàn)證

SGC-7901/DDP 細(xì) 胞 對 DDP 的 IC50為（0.923 ±0.078）， 親 本 細(xì) 胞 SGC-7901的 IC50為 （0.476 ± 0.042），t 檢驗(yàn)結(jié)果顯示兩者具有顯著性差異 （P ＜ 0.01），耐藥指數(shù) RI 為 1.94 大于 1.50，說明胃癌耐藥細(xì)胞SGC7901/DDP 對 DDP 具有耐藥性，如圖1 所示。

圖1 SGC7901/DDP 細(xì)胞對 DDP 具有耐藥性（±s，n ＝ 4）Fig. 1 The resistant of SGC7901/DDP cell to DDP（±s，n ＝ 4）

3.2 八寶丹抑制 SGC7901/DDP 細(xì)胞的細(xì)胞活力

MTT 實(shí) 驗(yàn) 顯 示， 各 組 細(xì) 胞 活 力 分 別 是 （100 ±2.19）%、（87.50 ± 3.52）%、（80.15 ± 4.87）%和（57.21 ± 2.32）%。表明八寶丹對 SGC7901/DDP 細(xì)胞的活力具有明顯的抑制作用，而且其抑制率隨著濃度的升高而增強(qiáng)，具有劑量依賴作用。如圖 2 所示。

圖2 BBD 抑制 SGC7901/DDP 細(xì)胞活力（±s，n ＝ 4）Fig. 2 The cell viability of SGC7901/DDP cells inhibited by BBD（±s，n ＝ 4）

3.3 八寶丹抑制 SGC7901/DDP 細(xì)胞的遷移

遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度的八寶丹干預(yù)后，其遷移細(xì)胞數(shù)依次為（89.33 ± 4.04）、（58.33 ± 1.53）和（33.3 ± 1.53）, 與對照組（102.67 ± 3.05）比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.01）。表明八寶丹能顯著降低 SGC7901/DDP 細(xì)胞的遷移能力，具有劑量依賴作用。如圖 3 所示。

3.4 八寶丹抑制 SGC7901/DDP 細(xì)胞的侵襲

侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度的八寶丹干預(yù)后，其 侵 襲 細(xì) 胞 數(shù) 依 次 為（82.67 ± 3.05）、 （55 ± 3）和（15 ± 2），與對照組（100 ± 4）比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.01）。表明八寶丹能顯著降低 SGC7901/DDP 細(xì)胞的侵襲能力，具有劑量依賴作用。如圖 4 所示。

圖3 八寶丹抑制 SGC7901/DDP 細(xì)胞的遷移（±s，n ＝ 4）Fig. 3 The migration of SGC7901/DDP cells inhibited by BBD（±s，n ＝ 4）

圖4 八寶丹抑制 SGC7901/DDP 細(xì)胞的侵襲（±s，n ＝ 4）Fig. 4 The invasion of SGC7901/DDP cells inhibited by BBD（±s，n ＝ 4）

3.5 八寶丹抑制 SGC7901/DDP 細(xì)胞的粘附

細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，八寶丹各組細(xì)胞數(shù)分別為（32 ± 2）、（23 ± 1）和（3 ± 1）， 與 對 照 組 （56 ± 4）比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.01）。結(jié)果如圖 5所示。

3.6 八寶丹調(diào)控 TGF-β/Smad 通路及相關(guān)蛋白表達(dá)

Western blot 結(jié)果表明，八寶丹能下調(diào) TGF-β、Smad4 的 表 達(dá) 以 及 p-Smad2/3 與 Smad2/3 的比 值。也可以上調(diào) E-cadherin 蛋白的表達(dá) , 下調(diào)Vimentin、MMP2、N-cadherin、MMP9 等相關(guān)蛋白的表達(dá)。如圖 6 所示。

圖5 八寶丹抑制 SGC7901/DDP 細(xì)胞的粘附（±s，n ＝ 4）Fig. 5 BBD inhibited cell adhesion of SGC7901/DDP cells （±s，n ＝ 4）

4 討論

研究表明腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮 - 間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是其發(fā)生轉(zhuǎn)移的始動(dòng)因素[10]。EMT 的特點(diǎn)之一是上皮細(xì)胞完整性或極性丟失，上皮鈣黏素下調(diào)，經(jīng)過骨架重構(gòu)轉(zhuǎn)變成運(yùn)動(dòng)能力更強(qiáng)并具有間質(zhì)特性細(xì)胞的過程。通過 EMT，腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)變分化成喪失極性上皮細(xì)胞并獲得間質(zhì)特性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥、侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)[11]。此外，研究表明，EMT可以重建腫瘤微環(huán)境，從而誘導(dǎo)免疫治療的耐藥性，其與胃癌在內(nèi)的多種腫瘤的癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移特性、耐藥和較差的臨床結(jié)果之間存在密切關(guān)系，因此 EMT 過程并不是一個(gè)單一的，而是由一系列廣泛的過渡狀態(tài)組成，在這些過渡狀態(tài)中，從信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑到表觀遺傳變化、microRNA 以及生長和轉(zhuǎn)錄因子等多種分子機(jī)制之間的相互作用發(fā)揮了關(guān)鍵的調(diào)節(jié)功能[12]。

圖6 八寶丹調(diào)控 TGF-β/Smad 信號(hào)通路及蛋白的表達(dá)（±s，n ＝ 4）Fig. 6 BBD regulates the expression of TGF-β/Smad signaling pathway and proteins（±s，n ＝ 4）

EMT 受 多 種 信 號(hào) 通 路 調(diào) 控，TGF-β 激 活的TGF-β/Smad 通 路 高 度 參 與 了 EMT 誘 導(dǎo) 過 程，TGF-β 可 以 通 過 Smad 信 號(hào) 通 路 發(fā) 生 腫 瘤 轉(zhuǎn) 移，Smads 是 TGF-β 信號(hào)通路從細(xì)胞表面輸送到細(xì)胞核的關(guān)鍵因子，Smads 的羧基端被活化受體磷酸化后導(dǎo)致其與常見的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子 Smad4 結(jié)合并轉(zhuǎn)入胞核，激活的 Smads 可以通過與轉(zhuǎn)導(dǎo)因子的結(jié)合，調(diào)節(jié)各種不同的生物學(xué)效應(yīng)。目前參與 EMT 過程的細(xì)胞外信號(hào)和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)之間的交互作用集中于細(xì)胞的深度修飾，如典型的上皮標(biāo)志物 E-cadherin 的下調(diào)，N-cadherin 和其它間質(zhì)蛋白的上調(diào)以及波形蛋白Vimentin 的上調(diào)等與細(xì)胞的高度遷移侵襲密切相關(guān)。此外，PERERA M等[13]研究表明，TGF-β/Smad 信號(hào)通路在高侵襲性乳腺癌細(xì)胞中的作用 , 通過激活細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），顯著促進(jìn)了轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)。LIU J X 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，八寶丹能夠通過 TGF-β/Smad 信號(hào)通路促進(jìn) E-cadherin 蛋白的上調(diào)，抑制 N-cadherin、Vimentin、MMP2、MMP9 蛋 白 在AGS 和 MGC803 細(xì)胞中表達(dá)，從而抑制胃癌細(xì)胞的 EMT。本研究結(jié)果證實(shí)八寶丹對胃癌耐藥細(xì)胞亦可下調(diào) TGF-β 通路中重要因子 TGF-β 和 Smad4 表達(dá)，下調(diào) p-Smad2/3 與 Smad2/3 的比值，同時(shí)下調(diào)N-cadherrin、Vimentin、MMP2、MMP9， 上 調(diào)E-cadherin 等轉(zhuǎn)移的相關(guān)蛋白表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮其抑制胃癌耐藥細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用。

5 結(jié)論

八 寶 丹 能 夠 抑 制 胃 癌 耐 藥 細(xì) 胞SGC7901/DDP 細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移，機(jī)制可能與其調(diào)控TGF-β/Smad 通路及其下游相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)，提示了八寶丹可能是治療腫瘤多藥耐藥的一種潛在藥物。然而，所有的實(shí)驗(yàn)都是在體外進(jìn)行的，因此還需要更多的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步的研究。