軒中亞，薛竣仁，陳修報，姜濤，劉洪波，楊健,

（1.南京農(nóng)業(yè)大學無錫漁業(yè)學院，江蘇 無錫 214081;

2.中國水產(chǎn)科學研究院淡水漁業(yè)研究中心，長江中下游漁業(yè)生態(tài)環(huán)境評價與資源養(yǎng)護重點實驗室，江蘇 無錫 214081）

中華絨螯蟹Eriocheir sinensis 俗稱河蟹、大閘蟹，是我國經(jīng)濟價值極高的重要水產(chǎn)物種[1,2]。中華絨螯蟹在我國的分布范圍廣泛，東起鴨綠江口、西至湖北沙市、北起遼寧、南至福建的通海河流中幾乎均有自然分布[3,4]，其中，長江、黃河、遼河等流域是中華絨螯蟹的主要棲息地。長江種群生長速度快、體型大、肉質(zhì)細嫩、味道鮮美而廣受歡迎，價值較高,被廣泛引入其他流域養(yǎng)殖[5]。然而，由于過度捕撈、生態(tài)環(huán)境破壞等原因，長江水系天然蟹苗資源嚴重衰退，之后遼河流域的蟹苗資源也被大規(guī)模開發(fā)，資源情況堪憂。因此，保護不同水域中華絨螯蟹種質(zhì)資源十分必要，而研究不同水域中華絨螯蟹的遺傳結構是有效管理和保護中華絨螯蟹種質(zhì)資源的前提。

目前，對不同水域中華絨螯蟹種質(zhì)資源從多方面開展了大量研究，包括形態(tài)學[6-8]、生理生化指標[6,9-11]、分子生物學等都取得了一定的進展。其中，Sui 等[12]應用微衛(wèi)星標記（SSR）分析了遼河、海河、黃河、長江、甌江、南流江等水系的中華絨螯蟹的群體遺傳學，發(fā)現(xiàn)南流江的合浦絨螯蟹Eriocheir hepuensis 應當被視為遺傳上獨立的種群，而南流江之北的其他流域的絨螯蟹之間缺乏顯著的地理群體結構。Xu 等[13]運用擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）標記分析了包括遼河、長江等在內(nèi)的東亞地區(qū)14 個群體，結果遼河、長江的中華絨螯蟹被劃為同一個遺傳簇。葛家春等[14]、許志強等[15]分別利用線粒體COI 標記與微衛(wèi)星標記分析了遼河、長江、甌江、萊茵河等四流域的中華絨螯蟹，結果顯示中國三大流域的中華絨螯蟹群體間無顯著差異，沒有明顯的地理群體結構。高祥剛等[16]基于GBS（Genotyping-bysequencing）技術分析了遼河家系、遼河野生、長江群體、海南群體、黃河群體的遺傳特征，發(fā)現(xiàn)海南的中華絨螯蟹苗種可能來自長江流域。然而，之前對于長江流域中華絨螯蟹的研究大多集中在長江口或距離長江口較近的南京、鎮(zhèn)江等區(qū)域[13-15,17-19]，對距離長江口更遠的水域（如安徽無為江段等）野生中華絨螯蟹傳統(tǒng)重點捕獲區(qū)域尚缺乏研究。

為了進一步了解長江、黃河、遼河等主要分布區(qū)域的中華絨螯蟹野生以及養(yǎng)殖群體的種質(zhì)資源情況，仍需進行進一步遺傳分析。線粒體細胞色素氧化酶亞基I（COI）基因進化速度適中[20]，廣泛應用在中華絨螯蟹遺傳研究中，有利于與已有的研究結果進行對比[14,21-23]。因此，本研究利用COI 基因分析尚未研究的長江流域無為江段野生中華絨螯蟹群體，同時分析了黃河流域的野生群體，湖南大通湖與遼寧盤錦的養(yǎng)殖群體，并與已報道的遼河野生群體進行對比，以完善對中華絨螯蟹的種質(zhì)資源現(xiàn)狀的最新認識，為其相關的資源評價和保護提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 樣本采集及DNA 提取

樣本采自4 個不同的中華絨螯蟹群體，詳見表1。DNA 提取采用康為世紀生物科技有限公司的柱式基因提取試劑盒，按照說明書進行操作。提取后的DNA 溶液在1.0%的瓊脂糖凝膠上電泳，檢測其質(zhì)量。檢測合格后保存在-20℃下備用。

1.2 mtDNA 擴增及測序

參照Zhang 等[22]的研究，使用引物F：TAAACT TCAGGGTGACCAAAAAATCA 和R：GGTCAACAAA TCATAAAGATATTGG 用于擴增中華絨螯蟹COI 序列。PCR 擴增反應體系包括：100 ng DNA 模板，12.5 μL 2×Taq MasterMix（康為世紀生物科技有限公司），引物（10 mM）各0.5 μL，然后加雙蒸水至終體積25 μL。PCR 反應程序如下：95℃預變性5 min；94℃變性1 min，58.1℃退火45 s，72 ℃延伸90s，共30 個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR 擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后用上海生工生物工程技術有限公司的UNIQ-1 柱式PCR 產(chǎn)物純化試劑盒進行純化回收，用ABI3730XL 測序儀（天霖生物技術有限公司）進行雙向測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用BioEdit 軟件中的Clustal W 程序?qū)Ρ扰帕兴眯蛄?，并輔以手工校正。同時，從GenBank 上下載了Tang 等[24]、Xu 等[21]報道的遼河野生中華絨螯蟹COI 基因序列（單倍型登錄號為AF317335，F(xiàn)J750-306、FJ750307、AY640085、AY6400856 和AY6400-87），作為本研究中的一個同種對照群體，以便與黃河、長江野生群體進行比較分析。同時下載了兩個合浦絨螯蟹COI 基因序列為外群（登錄號為AF317-328 和AF317327）。用DnaSP 軟件[25]計算各種群樣本Cyt-b 序列的單倍型個數(shù)（N）、單倍型多樣性（Hd）和核苷酸多樣性（Pi）等。由DnaSP 軟件輸出單倍型文件，由POPART 軟件[26]構建median joining network（MJN）以分析單倍型之間的關系，構建本研究所得單倍型的網(wǎng)絡圖。

用ARLEQUIN 軟件[27]計算兩兩種群間的FST值，用以檢驗種群遺傳結構，通過10 000 次重抽樣檢驗兩兩種群間FST值的顯著性。用MEGA 軟件[28]分析核苷酸最佳替換模型。在MEGA 軟件中，以合浦絨螯蟹作為外群，基于核苷酸最佳替換模型采用最大似然法（ML）構建系統(tǒng)發(fā)育樹，并基于K2P 模型分別采用鄰接法（NJ）、UPGMA 法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，各分支的支持率均用1000 次自舉法檢驗。

2 結果與分析

2.1 不同中華絨螯蟹種群的遺傳多樣性

共測得85 條序列，經(jīng)BLAST 比對，確定是目標序列。與下載的遼河野生群體（LH）共同分析，經(jīng)DnaSP 軟件檢測，共有36 個變異位點，其中簡約信息位點8 個。對各個群體的分析表明：下載的遼河野生群體（LH）內(nèi)部具有變異位點7 個，其中簡約信息位點3 個，群體內(nèi)單倍型數(shù)6 個；盤錦養(yǎng)殖群體（PJ）內(nèi)部具有變異位點5 個，其中簡約信息位點2個，群體內(nèi)單倍型數(shù)5 個；東營野生群體（DY）內(nèi)部具有變異位點8 個，其中簡約信息位點4 個，群體內(nèi)單倍型數(shù)9 個；無為野生群體（WW）內(nèi)部具有變異位點4 個，其中簡約信息位點3 個，群體內(nèi)單倍型數(shù)5 個；大通湖養(yǎng)殖群體（DTH）內(nèi)部具有的變異位點最多，達30 個，其中簡約信息位點4 個，群體內(nèi)單倍型數(shù)7 個。其中單倍型Hap15、16、17 為LH群體的獨有單倍型，單倍型Hap6、7、8、10 為DY 群體的獨有單倍型，單倍型Hap11 為PJ 群體獨有單倍型，單倍型Hap12、13、14 為DTH 群體獨有單倍型。在將DTH08 個體（該個體與合浦絨螯蟹更接近）從DTH 群體中剔除后，DTH 群體的內(nèi)部具有變異位點5 個，其中簡約信息位點3 個，群體內(nèi)單倍型數(shù)6 個。每個單倍型在各群體內(nèi)代表的不同個體的數(shù)量見表2。

表1 采樣時間、地點及樣本數(shù)Tab.1 Sampling time,site and sample size of Chinese mitten crab Eriocheir sinensis

表2 中華絨螯蟹COI 基因單倍型在不同群體中的分布Tab.2 Frequency of COI haplotypes in different populations of Chinese mitten crab Eriocheir sinensis

5 個群體的COI 序列的單倍型多樣性（Hd）、核苷酸多樣性（Pi）、平均核苷酸差異數(shù)如表3 所示。數(shù)據(jù)顯示，在本研究中LH 群體的單倍型多樣性（Hd）最高，而DTH 群體的核苷酸多樣性（Pi）最高；WW群體的單倍型多樣性與核苷酸多樣性都最低。在養(yǎng)殖群體中PJ 群體的單倍型多樣性（Hd）、核苷酸多樣性（Pi）都低于DTH 群體（表3）。

2.2 不同中華絨螯蟹種群的群體遺傳分化、遺傳距離與分子變異分析

中華絨螯蟹5 群體間基于的COI 序列的固定指數(shù)FST值為-0.034～0.089（表4），其中DY 群體與WW 群體之間、DTH 群體與WW 群體之間的FST值為負。在所有群體之間，僅有DY 群體與LH 群體之間具有顯著的FST值，同時這兩個群體間的FST值也最高，為0.089。在所有群體中，LH 群體與其他群體之間的FST值最高，除了與DTH 群體的FST值為0.012 外，與其他群體的FST值為0.074～0.089。DTH群體與其他群體的FST值最低,為-0.010～0.032,基因流與FST值的結果相似。

表3 不同群體中華絨螯蟹的遺傳多樣性參數(shù)Tab.3 Genetic diversity parameters among different populations of Chinese mitten crab Eriocheir sinensis

表4 五個不同中華絨螯蟹群體間的FST值與基因流Tab.4 The values of FSTand gene flow among five populations of Chinese mitten crab Eriocheir sinensis

分子變異分析（AMOVA）結果顯示，5 個群體總的遺傳分化指數(shù)為0.022，差異不顯著。其中大部分遺傳變異（97.84%）在中華絨螯蟹各群體內(nèi)部，群體間的遺傳變異極小，僅為2.16%（表5）。

2.3 不同中華絨螯蟹種群的系統(tǒng)發(fā)育分析和最小跨度網(wǎng)絡圖

經(jīng)檢驗，核苷酸最佳替換模型為Tamura-Nei+G（G=0.05）模型。使用MEGA 軟件按照最適模型以最大似然法（ML）構建的COI 單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1 所示。在ML 樹上，17 個單倍型構成了一個大的分支，而單倍型Hap12（對應絨螯蟹個體DTH08）則與外群合浦絨螯蟹聚在一起構成了另一個分支，顯示了該個體與合浦絨螯蟹具有更近的母系親緣關系。以最大似然法構建的系統(tǒng)關系圖顯示（圖1），本研究的中華絨螯蟹5 個群體混雜分布在系統(tǒng)發(fā)育樹上，地理位置與單倍型之間沒有明顯的對應關系。

表5 中華絨螯蟹五個不同群體線粒體COI 序列分子變異分析Tab.5 AMOVA results of mtDNA COI sequences in five populations of Chinese mitten crab Eriocheir sinensis

圖1 基于中華絨螯蟹COI 單倍型構建的ML 系統(tǒng)樹Fig.1 ML molecular dendrogram based on the COI haplotypes of Chinese mitten crab Eriocheir sinensis

基于COI 序列構建的單倍型網(wǎng)絡圖（圖2）顯示，除了單倍型Hap12 外，本研究中5 個中華絨螯蟹群體的單倍型之間的變異步數(shù)較低，聚為一簇，而Hap12 與其他中華絨螯蟹單倍型之間變異步數(shù)極高，與合浦絨螯蟹之間變異步數(shù)較低。表明單倍型Hap12 與合浦絨螯蟹具有更近的母系親緣關系。單倍型Hap1 具有最高的單倍型頻率，且在單倍型網(wǎng)絡圖中處于中心的位置，推測這個單倍型可能較為原始?？傮w而言，本研究中5 個中華絨螯蟹群體間存在較為廣泛的共享單倍型，未表現(xiàn)出明顯的地理位置、生活形式與單倍型之間的對應關系。

3 討論

3.1 遺傳多樣性

遺傳多樣性是由種群內(nèi)個體基因突變、遷移、雜交、遺傳漂變和自然選擇等多種因素共同作用所決定，同時遺傳多樣性也是物種適應環(huán)境變化、保持進化潛力的基礎，對種群的延續(xù)具有重要意義[29]。因此，群體的遺傳多樣性研究具有重要的理論與實踐價值。

圖2 基于中華絨螯蟹COI 單倍型構建的網(wǎng)絡圖Fig.2 Network diagram of COI haplotypes in Chinese mitten crab Eriocheir sinensis

在分子遺傳學中，常用核苷酸多樣性（Pi）評價群體內(nèi)遺傳多樣性水平，Pi值越高表明遺傳多樣性越豐富。本研究的5 個中華絨螯蟹群體的總體核苷酸多樣性水平較低，顯示中華絨螯蟹群體的遺傳多樣性已面臨較大挑戰(zhàn)。其中，養(yǎng)殖的DTH 群體的核苷酸多樣性最高，達0.00713，與彭欣悅等[23]得到的長江口野生中華絨螯蟹群體的核苷酸多樣性指數(shù)接近，高于本研究中野生群體。然而，這實際上是DTH 群體中DTH08 個體的單倍型接近合浦絨螯蟹導致的（詳見3.3）。在包含DTH08 個體時，DTH 群體內(nèi)部具有的變異位點最多，達30 個，其中簡約信息位點4 個，群體內(nèi)單倍型數(shù)7 個（表2）；將DTH08個體從DTH 群體中剔除后，DTH 群體的內(nèi)部的變異位點僅有5 個，其中簡約信息位點3 個，群體內(nèi)單倍型數(shù)6 個，單倍型多樣性（Hd）為（0.708±0.010），核苷酸多樣性（Pi）為（0.00180±0.00038），與PJ、DY和WW 群體接近，低于LH 野生群體。這表明DTH群體相對其他群體豐富的核苷酸多樣性其實是由于DTH08 個體的COI 單倍型為合浦絨螯蟹單倍型，從而與其他中華絨螯蟹單倍型有較大差異造成的。這種單個差異巨大的個體對群體遺傳多樣性的評估帶來了巨大的影響，掩蓋了實際的群體遺傳多樣性，因此在遺傳多樣性分析中剔除該個體。

LH、DY 野生群體的遺傳多樣性高于養(yǎng)殖群體，但WW 野生群體的核苷酸多樣性低于兩個養(yǎng)殖群體（排除DTH08 個體）。本研究中DY、WW 野生群體與Zhang 等[22]基于COI 序列與Cyt-b 序列得到的黃河野生群體、長江野生群體（上海崇明）的核苷酸多樣性水平接近，而下載的LH 野生群體（Xu 等[21]）的核苷酸多樣性（Pi=0.00404）高于Zhang 等[22]報道的遼河野生群體基于線粒體COI 基因的核苷酸多樣性（Pi=0.0019），也高于閆龍等[18]報道的遼河野生群體基于線粒體控制區(qū)的核苷酸多樣性（Pi=0.0019）。這可能顯示了近10 年遼河野生中華絨螯蟹種群內(nèi)遺傳多樣性下降，反映了種質(zhì)資源保護的迫切性。

同時，DY、WW 野生群體的遺傳多樣性也處于較低水平。DY 野生群體的遺傳多樣性較低可能與該群體所處的生活環(huán)境有關。黃河流域處于緯度較高的地區(qū)，流域面積小，水溫較低，河蟹種群規(guī)模較小，這可能就造成了黃河野生群體的遺傳多樣性水平較低。而WW 野生群體所處的長江流域水域面積廣，擁有大量與干流相通的河道與湖泊，適宜河蟹生長和育肥，但其核苷酸多樣性水平卻是三個野生群體中最低的，與Zhang 等[22]報道的遼河、黃河、長江三流域，閆龍等[18]報道的鴨綠江、遼河、黃河、長江四流域中長江種群核苷酸多樣性最低的情況類似，這說明過度捕撈后長江中華絨螯蟹種群遺傳多樣性遭到了破壞。

3.2 群體遺傳分化

在本研究中，所有群體間的遺傳分化水平都較低，僅有DY 群體與LH 群體之間有顯著的FST值。這兩個群體間的FST值也是所有群體之間最高的（0.089），其他群體之間的FST值統(tǒng)計上均不顯著。DY 野生群體與WW 野生群體之間、DTH 養(yǎng)殖群體與WW 野生群體之間的FST值為負，意味著基于COI 基因在兩群體之間沒有檢測到遺傳分化。DY野生群體與WW 野生群體之間、DTH 養(yǎng)殖群體與WW 野生群體之間的基因流無限大，表明這些群體間的基因交流非常頻繁。Sui 等[12]運用微衛(wèi)星標記、閆龍等[18]利用線粒體控制區(qū)對中華絨螯蟹群體遺傳研究的結果也顯示：遼河水系群體與黃河水系群體之間、遼河水系群體與長江水系群體之間具有顯著的遺傳差異，而黃河水系群體與長江水系群體間的遺傳差異不明顯。

中華絨螯蟹具有降海洄游生活史，其成體在生殖蛻殼前主要在淡水中生活，生殖蛻殼后則向河口附近洄游，在河口的半咸水中交配、產(chǎn)卵、孵化。孵化后在河口半咸水中發(fā)育為大眼幼體后開始溯河進入淡水中生長發(fā)育[30,31]。在此過程中，蚤狀幼體可隨海流沿岸被動遷移，這種不同河口來源的蚤狀幼體的擴散可能給不同河口群體帶來遺傳交流，降低不同河流群體的遺傳分化，這種幼體擴散帶來的基因流在降海洄游的多種生物中都有體現(xiàn)[32-34]。Xu等[13]也認為，這種幼體擴散導致了中國北方水系中華絨螯蟹群體間缺乏遺傳差異。但黃河口、長江口之間沿岸距離遙遠，洋流復雜[35,36]，黃河、長江水系間中華絨螯蟹能否形成極大的自然基因交流有待進一步的查證。另外，黃河、長江水系間中華絨螯蟹的基因交流更可能與中華絨螯蟹養(yǎng)殖活動中的跨區(qū)域引種和養(yǎng)殖逃逸造成的基因流有關，無序引種導致各地理種群之間遺傳結構混雜，遺傳分化降低。劉青等[19]通過微衛(wèi)星標記分析遼河、黃河、長江三大水系野生與養(yǎng)殖中華絨螯蟹群體也發(fā)現(xiàn)，所有群體間未能形成明顯的地理結構，呈現(xiàn)出種質(zhì)混雜的現(xiàn)象。

養(yǎng)殖的DTH 群體與其他群體的FST值為-0.010～0.032，與WW 野生群體的遺傳分化最低，基因流與FST值的結果相似。這表明DTH 群體在遺傳上仍主要來源于長江野生群體，但其與其他群體之間的FST值也是群體間較低的水平，表明該養(yǎng)殖群體也與其他群體發(fā)生了混雜。相對而言，在本研究中盤錦養(yǎng)殖群體與其他群體間具有一定的遺傳分化，這與劉青等[19]基于微衛(wèi)星的研究結果相似。

分子變異分析結果顯示，大部分遺傳變異（97.84%）存在于中華絨螯蟹各群體內(nèi)部，群體間的遺傳變異極小，僅為2.16%。這與劉青等[19]基于微衛(wèi)星對長江、黃河、遼河水系中華絨螯蟹野生和養(yǎng)殖群體的研究一致，表明本研究的5 個群體遺傳變異多發(fā)生在群體內(nèi)個體之間，群體間差異極小。

3.3 遺傳結構

基于COI 構建的系統(tǒng)發(fā)育樹及單倍型網(wǎng)絡圖顯示，本研究的5 個中華絨螯蟹群體的17 個單倍型構成了一個大分支，而來自DTH 群體的單倍型Hap12（對應絨螯蟹個體DTH08）則與外群合浦絨螯蟹聚在一起構成了另一個分支，這顯示了該個體與合浦絨螯蟹具有更近的母系親緣關系。孫紅英等[37]的研究顯示，在長江銅陵江段及遼河都發(fā)現(xiàn)過具有合浦絨螯蟹Cyt-b 基因單倍型的絨螯蟹，表明合浦絨螯蟹單元型在北方水系也存在。Xu 等[21]基于線粒體COI 和Cyt-b 基因的研究也表明，長江流域中存在合浦絨螯蟹單倍型。盡管不能確定這種具有合浦絨螯蟹單倍型的個體是基因漸滲、共享祖先單倍型，還是人為活動導致的基因交流的結果[37]，但可以確定的是，合浦絨螯蟹的線粒體基因單倍型存在于長江流域的中華絨螯蟹中。因此，個別具有合浦絨螯蟹單倍型的野生中華絨螯蟹被作為養(yǎng)殖親本，從而導致在養(yǎng)殖群體中發(fā)現(xiàn)合浦絨螯蟹單倍型，是極有可能的。

系統(tǒng)發(fā)育樹顯示：本研究的中華絨螯蟹5 個群體混雜分布在系統(tǒng)發(fā)育樹上，地理位置與單倍型之間沒有形成明顯的對應關系，單倍型網(wǎng)絡圖也顯示各群體共享單倍型為主，較少有獨有單倍型，這與葛家春等[14]、閆龍等[18]、Zhang 等[22]基于線粒體分析中華絨螯蟹種質(zhì)資源的結果相似，都顯示不同種群之間基因交流較為頻繁，沒有明顯的遺傳結構。

綜上所述，目前野生中華絨螯蟹遺傳多樣性較低，尤其是在長江水系，反映了過度捕撈對種質(zhì)資源的極大破壞。隨著2019 年開始禁止對中華絨螯蟹等的商業(yè)捕撈以及從2020 年開始長江流域10年全面禁漁等措施的實施，將會對中華絨螯蟹野生種質(zhì)資源的恢復和保護起到重要作用。同時，不同水系間的遺傳混雜現(xiàn)象也應引起重視，在人工移植和增殖放流時必須做到科學管理，避免人為因素進一步破壞該經(jīng)濟物種的自然遺傳結構。