張志強(qiáng)，王苗，杜萬(wàn)年，劉勃興，康元環(huán)，單曉楓，吳同壘，朱國(guó)強(qiáng)，史秋梅

（1.河北科技師范學(xué)院河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 秦皇島 066000；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130000；3.揚(yáng)州大學(xué)，江蘇 揚(yáng)州 225009）

哈維氏弧菌Vibrio harveyi（又稱哈氏弧菌）廣泛引起多種海洋魚(yú)類(lèi)、甲殼類(lèi)動(dòng)物感染發(fā)病，造成重大經(jīng)濟(jì)損失[1]，是重要的漁業(yè)致病菌。目前，多用抗生素和化學(xué)藥物處理哈維氏弧菌感染發(fā)病的動(dòng)物，治療效果并不顯著，且導(dǎo)致水體污染和菌株耐藥現(xiàn)象極其普遍[2]。目前針對(duì)哈維氏弧菌疫苗的開(kāi)發(fā)工作已經(jīng)開(kāi)展，發(fā)現(xiàn)哈維氏弧菌菌蛻成分作為免疫成分能較好地預(yù)防哈維氏弧菌感染；亞單位疫苗研究證實(shí)，細(xì)菌的外膜蛋白OmpK、OmpU 和OmpW具有較好的免疫保護(hù)效果[3-5]；有一部分在其他病原上免疫效果優(yōu)異的蛋白，如硫氧還蛋白也可作為哈維氏弧菌的優(yōu)良候選疫苗[6]。這些研究為哈維氏弧菌疫苗的開(kāi)發(fā)提供了重要參考。

Bfr 是細(xì)菌外膜表面編碼的儲(chǔ)鐵蛋白。致病菌通過(guò)Bfr 蛋白將攝取的鐵儲(chǔ)存起來(lái)，用于應(yīng)對(duì)宿主體內(nèi)鐵貧瘠的環(huán)境[7]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌Bfr 蛋白是一種T 細(xì)胞抗原，能刺激機(jī)體IFN-γ 產(chǎn)生以及淋巴細(xì)胞增殖[8-10]，設(shè)計(jì)表達(dá)Bfr 蛋白的核酸疫苗能誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的抗體[10]。揭示了Bfr 作為疫苗的潛在價(jià)值。目前有關(guān)哈維氏弧菌Bfr 蛋白的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以Bfr 蛋白為研究對(duì)象，利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)哈維氏弧菌Bfr 蛋白，以探索其免疫特性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、載體與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

哈維氏弧菌菌株VHCL-1 分離自患病的半滑舌鰨Cynoglossus semilaevis，保存于河北科技師范學(xué)院動(dòng)物傳染病研究室。原核表達(dá)載體pET-32a 由本實(shí)驗(yàn)室保存。SPF 級(jí)6～8 周齡昆明小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)用斑馬魚(yú)Danio rerio 體長(zhǎng)約3～5 cm，購(gòu)自秦皇島某花鳥(niǎo)市場(chǎng)，實(shí)驗(yàn)適應(yīng)飼養(yǎng)2 周。

1.1.2 主要試劑

Ex Taq DNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；小鼠抗His標(biāo)簽單克隆抗體（His-MAb）、HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 抗體（HRP-IgG）、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）及Ni2+argose 填料購(gòu)自康維世紀(jì)公司；DH5α 和BL21 感受態(tài)細(xì)胞由河北科技師范學(xué)院動(dòng)物傳染病研究室制備保存；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒和質(zhì)粒小提取試劑盒購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 bfr 基因的克隆

參考細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取哈維氏弧菌VHCL-1 的基因組。根據(jù)GenBank 上已公布的哈維氏弧菌bfr 基因序列（GenBank 登錄號(hào)：CP 025796.1），分別設(shè)計(jì)含BamH I 和Sal I 酶切位點(diǎn)的上下游引物，上游引物P1：5'-CGGGATCCATGAAAGGCGATCCAATCATAATCC-3'（BamH I），下游引物P2：5'-GCGTCGACACTCTTCATCAACGTAT TGCGCTTG-3'（Sal I）。以哈維氏弧菌VHCL-1 的基因組為模板鏈擴(kuò)增bfr 基因。PCR 反應(yīng)體系為50 μL，反應(yīng)條件為95℃5 min；94℃30 s，54℃30 s，72℃1 min，30 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，擴(kuò)增的目的片段用純化試劑盒純化，再將純化產(chǎn)物與載體PMD18-T 連接，16℃連接2 h 后轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)LB 液體培養(yǎng)1 h 后，取200 μL 涂布于平板培養(yǎng)基，經(jīng)過(guò)夜培養(yǎng)后，挑取單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，并送至上海生工生物科技有限公司測(cè)序[11，12]。

1.2.2 生物信息學(xué)分析

用DNA STAR 的MegAlign 軟件將所測(cè)菌株的bfr 基因序列與GenBank 中已知不同細(xì)菌的bfr 基因序列進(jìn)行Blast 對(duì)比分析，將已測(cè)序的菌株序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析。

1.2.3 表達(dá)載體pET-32a-bfr 的構(gòu)建

對(duì)測(cè)序正確的pMD-18T-bfr 和pET-32a 載體用BamH I 和Sal I 雙酶切后，經(jīng)T4 連接酶連接并轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 感受態(tài)細(xì)胞中。挑取單克隆進(jìn)行PCR 驗(yàn)證，陽(yáng)性克隆參照質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證和序列測(cè)定，保證構(gòu)建的表達(dá)載體pET-32a-bfr 在表達(dá)中不發(fā)生突變和移碼。

1.2.4 rBfr 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

參照文獻(xiàn)[11]描述的方法，將含pET-32a-bfr 重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21 接種于LB 液體培養(yǎng)基后，當(dāng)OD600達(dá)到0.4～0.6 時(shí)，向培養(yǎng)基中加入1 mmoL/L誘導(dǎo)劑IPTG 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，以不誘導(dǎo)的含pET-32abfr 的BL21 為對(duì)照組。37℃再次震蕩培養(yǎng)4 h 后離心收集菌液，PBS 洗凈后水煮法提取細(xì)菌蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分析。將重組表達(dá)菌體進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，超聲破碎菌體，離心分離沉淀、上清，利用SDS-PAGE 方法分析目的蛋白在沉淀和上清中的含量，用Ni2+親和層析方法純化蛋白，并用BCA 蛋白濃度檢測(cè)試劑盒測(cè)定純化蛋白濃度，于-70℃保存。

1.2.5 Western blot 分析

參照文獻(xiàn)[12]描述的方法，SDS-PAGE 電泳后，將蛋白膠轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，用鑷子取出PVDF 膜浸泡在含5%脫脂奶粉（w/v）的封閉液中，浸泡條件為：4℃、12 h。TBST 洗液清洗3 次，每次清洗3 min。加鼠抗His-Tag 單克隆抗體（體積比1∶1000 稀釋）后室溫放至搖床孵育2 h，TBST 漂洗后加入HRP-Tag 山羊抗鼠IgG（體積比1∶5000 稀釋）室溫放至搖床孵育2 h，TBST 漂洗后使用BAD 顯色液在避光條件下顯色5 min，ddH2O 終止反應(yīng)，拍照觀察結(jié)果。

1.2.6 rBfr 蛋白免疫小鼠抗體水平檢測(cè)

參照文獻(xiàn)[12]描述的方法，利用小鼠模型評(píng)價(jià)rBfr 的免疫效果。將40 只健康昆明鼠隨機(jī)分成兩組，每組20 只。實(shí)驗(yàn)組以純化的rBfr 蛋白作為免疫原，分別于第0 d、15 d 和30 d 進(jìn)行免疫，首免以50 g弗式完全佐劑乳化的蛋白皮下注射免疫，二免和三免蛋白用弗氏不完全佐劑免疫；在每次免疫對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)，對(duì)照組小鼠免疫等體積乳化的PBS；在小鼠免疫前后不同時(shí)間，尾尖采取小鼠血液并分離血清，以rBfr 蛋白作為包被抗原，利用間接ELISA 方法檢測(cè)小鼠血清中抗體的效價(jià)，以陰性血清OD450平均值加3 倍標(biāo)準(zhǔn)差作為陰陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.7 哈維氏弧菌感染斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)

將60 尾斑馬魚(yú)隨機(jī)分成6 組，實(shí)驗(yàn)組5 組，分別以不同濃度的哈維氏弧菌腹腔接種斑馬魚(yú)，接種劑量為10 μL/尾，接種菌量分別為1010cfu、109cfu、108cfu、107cfu 和106cfu，測(cè)定哈維氏弧菌VHCL-1菌株對(duì)斑馬魚(yú)的致病力。

2 結(jié)果與分析

2.1 bfr 基因擴(kuò)增及同源性分析

圖1 bfr 基因的克隆Fig.1 Cloning of bfr gene

PCR 擴(kuò)增bfr 基因的結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1 可知，于475 bp 處出現(xiàn)特異性條帶，條帶大小與預(yù)測(cè)的bfr 基因開(kāi)放閱讀框大小一致。將bfr 基因片段克隆到pMD18-T 載體上進(jìn)行測(cè)序。由圖2 可知，弧菌屬各成員細(xì)菌間bfr 氨基酸同源性均在80%以上，其中與沙門(mén)菌Salmonella 和大腸桿菌Escherichia coli的氨基酸序列同源性分別達(dá)67%和68%，表明Bfr蛋白高度保守。

2.2 重組蛋白rBfr 的表達(dá)驗(yàn)證

SDS-PAGE 凝膠電泳分析重組蛋白顯示，在約25 ku 處表達(dá)出rBfr 目的蛋白，而空載對(duì)照組在該位置處無(wú)明顯條帶（圖3-A），Western blot 分析結(jié)果也同樣于25 ku 處出現(xiàn)目的條帶（圖3-B），表明rBfr 重組蛋白成功表達(dá)。

2.3 rBfr 重組蛋白可溶性分析及純化

對(duì)rBfr 重組蛋白進(jìn)行可溶性分析，結(jié)果顯示（圖4-A），菌體超聲破碎上清和沉淀中rBfr 均有表達(dá)，表明表達(dá)的rBfr 蛋白部分可溶。而取誘導(dǎo)表達(dá)上清進(jìn)行純化，在25 ku 處純化出目的蛋白（圖4-B），測(cè)定蛋白濃度為0.36 mg/mL。

圖2 不同菌株bfr 氨基酸同源性分析Fig.2 Homology analysis of bfr from Vibrio harveyi and other bacterial strains

圖3 rBfr 蛋白的表達(dá)驗(yàn)證Fig.3 Analysis of prokaryotic expression of rBfr

圖4 rBfr 蛋白的純化Fig.4 Analysis of purification of rBfr from E.coli

2.4 rBfr 蛋白免疫小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將rBfr 蛋白免疫小鼠4 次采集的血清按1∶100 進(jìn)行稀釋，以500 ng/mL 重組蛋白包被酶標(biāo)板，羊抗鼠IgG-HRP 二抗進(jìn)行1∶5000 倍稀釋。結(jié)果顯示（圖5），在二免后，免疫小鼠即產(chǎn)生較高水平的特異性抗體，在加強(qiáng)免疫后達(dá)到最高水平，表明rBfr蛋白具有優(yōu)良的免疫原性。

圖5 免疫小鼠抗體水平變化Fig.5 The changes in specific antibody levels of mice induced by rBfr

2.5 哈維氏弧菌感染斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將不同濃度的哈維氏弧菌腹腔感染斑馬魚(yú)，結(jié)果僅有最高劑量組即1010cfu 接種劑量組斑馬魚(yú)死亡2 尾，其余組均無(wú)死亡，表明哈維氏弧菌對(duì)斑馬魚(yú)的致病力較低。

3 討論

哈維氏弧菌對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)危害十分嚴(yán)重，感染宿主范圍廣泛，日益引發(fā)關(guān)注[13]。然而，目前對(duì)哈維氏弧菌的研究尚處于起步階段，遠(yuǎn)不如對(duì)遲緩愛(ài)德華菌Edwardsiella tarda、鰻弧菌Vibrio anguillarum以及嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophila 的研究深入[14]。疫苗的應(yīng)用能夠使免疫動(dòng)物獲得針對(duì)特定病原的免疫力，是疫病防治的高效手段，在水產(chǎn)疫病防控中，遲緩愛(ài)德華菌、鰻弧菌和嗜水氣單胞菌等疫苗的使用證實(shí)了疫苗在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的應(yīng)用前景[15]。針對(duì)哈維氏弧菌尚無(wú)商品化疫苗這一現(xiàn)狀，本研究借鑒其它病原的研究成果，以哈維氏弧菌儲(chǔ)鐵蛋白為研究對(duì)象，嘗試?yán)迷吮磉_(dá)和動(dòng)物模型評(píng)估其免疫效力。

Bfr 蛋白的免疫特性已在大腸桿菌和沙門(mén)氏菌等諸多細(xì)菌中得到證實(shí)[16]。本研究中，首先對(duì)該蛋白的保守性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Bfr 蛋白在弧菌屬細(xì)菌成員間高度保守，與其它腸桿菌科細(xì)菌也具有較高的同源性（可達(dá)67%以上），揭示了該蛋白可作為弧菌屬致病菌的疫苗候選蛋白。Bfr 蛋白成功在原核中表達(dá)和純化，表達(dá)的Bfr 蛋白重組菌培養(yǎng)物經(jīng)過(guò)離心后，菌體沉淀為棕紅色，而空白對(duì)照組菌體為黃白色，猜測(cè)可能與Bfr 蛋白結(jié)合有色三價(jià)鐵離子有關(guān)[17]。

本研究將純化的Bfr 蛋白免疫小鼠，激發(fā)小鼠產(chǎn)生高水平的特異性抗體，表明該蛋白具有較高的免疫原性。在接下來(lái)的研究中，筆者嘗試建立哈維氏弧菌感染小鼠模型以評(píng)估rBfr 蛋白的免疫保護(hù)效果。然而，接種哈維氏弧菌的小鼠并無(wú)死亡和疾病癥狀，表明哈維氏弧菌對(duì)小鼠不具有致病性，與前人研究一致[13]。斑馬魚(yú)是漁業(yè)疾病的經(jīng)典模型，在多種病原致病機(jī)制研究中得到廣泛應(yīng)用[18,19]。本研究試圖建立哈維氏弧菌感染斑馬魚(yú)模型，結(jié)果并不理想，接種斑馬魚(yú)并未有明顯的死亡和病變。但是，用哈維氏弧菌過(guò)夜培養(yǎng)物上清成分接種斑馬魚(yú)，發(fā)現(xiàn)接種的斑馬魚(yú)全部死亡，表明哈維氏弧菌胞外產(chǎn)物具有致病性，與已有的研究一致[20,21]。針對(duì)此現(xiàn)象分析認(rèn)為，哈維氏弧菌是海水病原，生長(zhǎng)和增殖需要一定的鹽度，所以其致病力和試驗(yàn)結(jié)果也會(huì)受外界環(huán)境因素的影響[22]，有待于進(jìn)一步研究確認(rèn)。

本研究確定了哈維氏弧菌Bfr 蛋白具有優(yōu)良的免疫原性和潛在的應(yīng)用價(jià)值，為研制哈維氏弧菌疫苗提供了參考。