鄭文燕 李哲 蔡燕娟 許潤娟

中山市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 中山528400

當(dāng)歸養(yǎng)血丸為益氣養(yǎng)血調(diào)經(jīng)類中藥復(fù)方制劑，收載于《中國藥典》（2015年版）一部［1］，處方由當(dāng)歸、白芍、地黃、炙黃芪、阿膠、牡丹皮、香附、茯苓、杜仲、白術(shù)組成，阿膠在處方中投料量約為7%。近年來，隨著膠類藥材用量增長，巨大的利益驅(qū)動(dòng)和尖銳的供需矛盾導(dǎo)致膠類藥材的生產(chǎn)環(huán)境亂象叢生，市場上含膠類的制劑存在不投、少投、摻偽投料的現(xiàn)象［2-3］。針對膠類藥材造假問題，中國食品藥品檢定研究院開展了一系列的研究工作，建立了阿膠、龜甲膠、鹿角膠3種膠類藥材專屬性特征肽的鑒別方法［1］以及其補(bǔ)充檢驗(yàn)方法［4-6］，以期提高膠類藥材的質(zhì)量控制水平?！吨袊幍洹罚?015年版）收載的含膠類藥材的成方制劑共44個(gè)，僅有兩個(gè)制劑品種（阿膠三寶膏、復(fù)方阿膠漿）的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中，收載了專屬性強(qiáng)的膠類藥材特征肽的檢測方法［7］，大多數(shù)缺乏針對制劑中膠類藥材的專屬性質(zhì)量控制項(xiàng)目，使得含膠類藥材的中成藥摻偽造假投料的現(xiàn)象存在很大空間。

目前，當(dāng)歸養(yǎng)血丸中專屬性強(qiáng)的阿膠藥材鑒別方法尚無文獻(xiàn)報(bào)道，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)也無針對動(dòng)物藥材阿膠的質(zhì)控方法，這使得該制劑的售價(jià)差異很大，質(zhì)量難以保證，也給患者的用藥安全帶來隱患。近年來，關(guān)于膠類制劑中阿膠藥材的專屬性檢測方法研究報(bào)道較多［8-11］，本文采用UPLC-MS/MS技術(shù)，建立當(dāng)歸養(yǎng)血丸中阿膠專屬性特征肽的鑒別方法，以期保障該制劑的安全有效。

1 儀器與材料

Agilent 1290～6460 Triple Quad超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司）；AB SCIEX 3200 Q-Trap超快速高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國AB公司）；XS205DU電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Milli-Q超純水器（德國Merck Millipore公司）；SB-300 DTY超聲波多頻清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；BWS-0510型水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

黃明膠（批號121695-201301）、阿膠（批號121274-201703）、對照藥材購自中國食品藥品檢定研究院；胰蛋白酶（質(zhì)譜級，Promega公司）；甲酸、乙腈（色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；當(dāng)歸養(yǎng)血丸陰性樣品為按照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)處方自制的不含阿膠的樣品，實(shí)驗(yàn)所用樣品為本單位在流通環(huán)節(jié)抽樣或通過網(wǎng)絡(luò)渠道購得。

表1 樣品信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18（2.1×100mm，1.8μm）柱；流速0.3mL/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：5μL；流動(dòng)相：乙腈（A）和0.1%甲酸溶液（B）進(jìn)行梯度洗脫；洗脫程序：0～25min 5%～20%A，25～40min 20%～50%A。

2.2 質(zhì)譜條件離子化方式：ESI+離子源，掃描模式MRM，霧化器壓力為45psi，干燥氣流量為5L/min，干燥氣溫度為325℃，毛細(xì)管電壓為3500V，鞘氣溫度為350℃；檢測離子對：阿膠特征分子離子峰m/z539.8（雙電荷）→923.8，612.4作為檢測離子對［1］。

2.3 供試品溶液的制備取當(dāng)歸養(yǎng)血丸適量，研碎，精密稱取處理好的樣品1.50g，置50mL量瓶中，加1%碳酸氫銨溶液適量，超聲處理30min使溶散，再加上述溶液稀釋至刻度，搖勻，離心（轉(zhuǎn)速為3500r/min）5min，取上清液，用0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液100μL，置微量進(jìn)樣瓶中，加胰蛋白溶液（1μg/μL）10μL，搖勻，37℃恒溫酶解12h，即得。

胰蛋白溶液（臨用時(shí)配制）：取胰蛋白酶，加1%碳酸氫銨溶液制成每1μL中含1μg的溶液。

2.4 對照藥材溶液的制備取對照藥材粉末（約0.10g）適量，精密稱定，置50mL量瓶中，加1%碳酸氫銨溶液適量，超聲處理30min使溶解，再加上述溶液稀釋至刻度，搖勻，用0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液100μL，置微量進(jìn)樣瓶中，加胰蛋白溶液（1μg/μL）10μL，搖勻，37℃恒溫酶解12h，即得。

2.5 專屬性試驗(yàn)用不含阿膠的樣品和黃明膠作為陰性樣品，選擇阿膠特征分子離子峰m/z 539.8（雙電荷）→612.4，923.8作為檢測離子對進(jìn)行測定，結(jié)果陰性樣品色譜圖中，與對照藥材（阿膠）溶液相應(yīng)的位置上，無相應(yīng)的色譜峰，認(rèn)為當(dāng)歸養(yǎng)血丸陰性樣品以及其他膠類如黃明膠對當(dāng)歸養(yǎng)血丸樣品測定無干擾，方法專屬性良好。見圖1。

2.6 檢測下限測定取阿膠對照藥材粉末（約0.10g）適量，精密稱定，置50mL量瓶中，加1%碳酸氫銨溶液適量，超聲處理30min使溶解，再加上述溶液稀釋至刻度，搖勻。取該溶液適量，并平行稱取4份當(dāng)歸養(yǎng)血丸陰性樣品（1.50g），照“2.3供試品溶液的制備”方法分別制得含阿膠為0.2%、0.5%、1%、5%的當(dāng)歸養(yǎng)血丸系列溶液，以阿膠特征分子離子峰m/z 539.8（雙電荷）→612.4，923.8作為檢測離子對進(jìn)行測定，結(jié)果含阿膠為0.2%的當(dāng)歸養(yǎng)血丸溶液中，阿膠特征分子離子峰的信噪比約為3∶1，因此檢測下限為含阿膠為0.2%的當(dāng)歸養(yǎng)血丸樣品溶液，在MRM模式下檢測。

圖1 當(dāng)歸養(yǎng)血丸（A）、阿膠對照藥材（B）、陰性樣品（C）、黃明膠對照藥材（D）的EIC色譜圖a m/z 539.8（雙電荷）→612.4 b m/z 539.8（雙電荷）→923.8

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)取當(dāng)歸養(yǎng)血丸樣品（批號：180302），按“2.3供試品溶液的制備”項(xiàng)平行制備6份供試品溶液，測定。結(jié)果當(dāng)歸養(yǎng)血丸供試品溶液中均檢出相應(yīng)的阿膠特征肽離子峰，以m/z539.8（雙電荷）→923.8，612.4特征分子離子峰峰面積計(jì)算，峰面積的RSD分別為4.3%、2.4%，表明方法具有良好的重復(fù)性。

2.8 樣品測定以所建立的方法對3個(gè)廠家10批次當(dāng)歸養(yǎng)血丸樣品進(jìn)行測定，結(jié)果均檢出阿膠特征肽，可以作為制劑中阿膠藥材的鑒別方法。

表2 當(dāng)歸養(yǎng)血丸中阿膠檢測結(jié)果

3 討論

3.1 供試品制備方法的考察當(dāng)歸養(yǎng)血丸為處方中各味藥材粉末投料生產(chǎn)，制劑中煉蜜含量較高，供試品超聲處理后，溶液混濁較黏稠，若直接采用0.22μm微孔濾膜濾過，操作困難。因此供試品超聲處理后采用離心的方式，除去溶液中的沉淀，得到較澄清的上清液后，再濾過，取續(xù)濾液進(jìn)行酶解。為考察阿膠粉末在溶散過程中是否能夠溶解完全，制備過程中阿膠分別為以粉末及溶液兩種狀態(tài)與當(dāng)歸養(yǎng)血丸陰性樣品混合，比較阿膠特征分子離子峰的峰面積。結(jié)果顯示，阿膠固體樣品和阿膠液體樣品中阿膠特征分子離子峰的色譜峰面積基本一致，表明前處理過程中，阿膠粉末溶解完全。

3.2 酶解時(shí)間和酶量的考察參考《中國藥典》（2015年版）阿膠鑒別方法［1］，阿膠的取樣量為0.1g，依據(jù)當(dāng)歸養(yǎng)血丸處方量及制劑工藝計(jì)算，每1.50g丸中約含有0.10g阿膠對照藥材，由此確定供試品的取樣量為1.50g。

參考《中國藥典》（2015年版）阿膠鑒別方法的酶解時(shí)間和酶用量［1］以及《中國藥典》（2015年版）四部“通則3405肽圖檢查法”中的溶劑條件［12］，在37℃恒溫水浴中，取1.50g當(dāng)歸養(yǎng)血丸，酶用量分別為10、15、20μL（酶濃度1mg/mL），酶解8、12、16、20h后分別進(jìn)樣，計(jì)算當(dāng)歸養(yǎng)血丸中阿膠特征分子離子峰的峰面積。結(jié)果表明當(dāng)歸養(yǎng)血丸取樣量為1.50g，酶用量10μL，酶解時(shí)間12h與酶用量20μL，酶解時(shí)間20h中阿膠特征分子離子峰的峰面積基本一致。最終確定當(dāng)歸養(yǎng)血丸取樣量為1.50g，酶用量為10μL，酶解時(shí)間為12h。

3.3 耐用性考察考察了本方法在Agilent 1290-6460 Triple Quad、AB SCIEX 3200 Q-Trap，兩臺(tái)高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀上的重現(xiàn)性，以m/z 539.8（雙電荷）→612.4，923.8作為阿膠特征肽離子對進(jìn)行檢測，結(jié)果表明兩個(gè)品牌的UPLC-MS/MS均可檢出阿膠特征分子離子峰，方法耐用性良好。

3.4 結(jié)論當(dāng)歸養(yǎng)血丸現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中缺乏專屬性強(qiáng)的阿膠鑒別方法，阻礙了該類制劑的質(zhì)量控制和市場監(jiān)管。本文所建立的當(dāng)歸養(yǎng)血丸中阿膠的定性鑒別方法專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確可靠、重現(xiàn)性好，可以對制劑中阿膠藥材進(jìn)行有效監(jiān)控，為該類制劑的療效及服用安全提供保障，具有重要的社會(huì)應(yīng)用價(jià)值。