周逸馳，張 丹，張 沛，金 祺，孫承軍*

（1.武漢科技大學(xué)附屬華潤(rùn)武鋼總醫(yī)院骨科，湖北武漢 430080；2.武漢大學(xué)中南醫(yī)院超聲影像科，湖北武漢 430000）

椎間盤突出是臨床上較為常見的脊柱疾病之一，主要原因是隨著年齡增長(zhǎng)，纖維環(huán)及髓核的含水量逐漸降低，蛋白粘多糖含量逐年下降，膠原纖維逐漸溶解，髓核失去彈力及膨脹性能，在受外力時(shí)椎間盤發(fā)生萎縮、彈性減弱等退行性病變，髓核從而外突［1，2］。在臨床上，目前尚無治療椎間盤退變的有效藥物，主要是以改善患者疼痛癥狀為主，而退變嚴(yán)重或影響日常生活者則需行手術(shù)治療。但手術(shù)治療畢竟是一種終末治療方法，且為開放性，創(chuàng)傷大。如何有效地阻止和逆轉(zhuǎn)椎間盤退變是目前臨床和基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)。多能誘導(dǎo)干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells,IPS）的研究成果為治療椎間盤退變提供了一種新的有效方法及途徑［3，4］。在體外，可將IPS細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化出功能性的多種成熟細(xì)胞，如造血和神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞［5～10］。IPS細(xì)胞的良好生長(zhǎng)、分化增殖和分泌細(xì)胞外基質(zhì)需要良好的微環(huán)境。但目前尚無一種人工材料具有完全類似天然椎間盤基質(zhì)材料的結(jié)構(gòu)和良好的生物學(xué)活性。近年來，隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，海藻酸鈉鹽作為支架材料的運(yùn)用越來越廣泛［11］。本研究擬在前期研究的基礎(chǔ)上，通過將IPS定向分化的髓核細(xì)胞與海藻酸鈉鹽微球凝膠復(fù)合修復(fù)退變椎間盤，旨在為臨床上治療椎間盤退變提供新的途徑。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

懷孕13 d C57/B6小鼠和50只8周齡清潔級(jí)新西蘭大白兔［體重（1.5±0.2）kg］購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房，適應(yīng)環(huán)境1周。懷孕3 d C57/B6小鼠的胚胎用于提純MEF細(xì)胞。50只大白兔隨機(jī)分為對(duì)照組、材料組、細(xì)胞組和聯(lián)合組。

1.2 實(shí)驗(yàn)處理

1.2.1 IPS制備

取懷孕13 d的胚胎組織，采用胰蛋白酶消化胚胎組織，分離胚胎成纖維細(xì)胞，將分離的成纖維細(xì)胞分為2份，一份用于誘導(dǎo)IPS細(xì)胞，一份用于飼養(yǎng)層細(xì)胞。將分離的成纖維細(xì)胞采用包裝OCT4、SOX2、KLF4和C-myc的慢病毒感染，培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基（15% FBS、1%非必需氨基酸、1%丙酮酸鈉、1%谷丙氨酸二肽、55 μM β-巰基乙醇、25 μg/ml慶大霉素、0.55 mM丙戊酸、100 U/ml LIF細(xì)胞因子），形成IPS細(xì)胞克隆，并用CD24+磁珠純化。將純化的IPS細(xì)胞采用胰酶消化，PBS洗滌細(xì)胞，將細(xì)胞重懸于髓核細(xì)胞分化培養(yǎng)基中，每周更換培養(yǎng)基2次，細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)28 d后髓核細(xì)胞分化成功。

1.2.2 IPS與海藻酸鈉復(fù)合鹽微球凝膠復(fù)合

將誘導(dǎo)分化的髓核細(xì)胞采用0.25%胰酶消化，重懸于PBS溶液中將細(xì)胞密度調(diào)整為1×108/ml；將1%醫(yī)用海藻酸鈉鹽微球凝膠2 mg/L，按l∶1比例配置髓核細(xì)胞與海藻酸鈉鹽微球凝膠混合溶液。

1.2.3 椎間盤退變模型建立

40只新西蘭大白兔采用髓核抽吸法建立L3/4、L4/5和L5/6椎間盤退變模型。采用3%巴比妥耳緣靜脈注射全麻，并取側(cè)臥腰椎側(cè)前方手術(shù)入路，沿第12肋術(shù)向下至髂嵴作6 cm長(zhǎng)縱切口，可見胸腰筋膜后層。切開胸腰筋膜后層，在骶棘肌和腰方肌內(nèi)緣間行鈍性分離。剪開胸腰筋膜前層，縱行分離腰大肌，暴露椎體和椎間盤。以髂嵴連線通過L5/6椎間盤來定位，用4號(hào)線于L3/4、L4/5、L5/6椎間盤水平軟組織打結(jié)做標(biāo)記，并用2lG針頭針在上述椎間盤側(cè)前方穿刺，用持針器夾持針頭使尖端保留5 mm，平行終板方向刺入，接10 ml注射器帶負(fù)壓抽吸髓核組織，依次逐層關(guān)閉切口。造模后2周隨機(jī)法取40只實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行腰椎間盤MRI掃描，判斷造模情況。對(duì)照組實(shí)驗(yàn)兔只做暴露椎間盤，不吸取髓核組織。

1.2.4 體內(nèi)干預(yù)處理

50只新西蘭大白兔分為5組，10只作為對(duì)照組，40只建立兔椎間盤退變模型，并隨機(jī)分為4組，聯(lián)合組采用微量注射器在兔退變椎間盤注入IPS定向分化的髓核細(xì)胞與海藻酸鈉鹽微球凝膠材料復(fù)合物，材料組在退變椎間盤注入不含髓核細(xì)胞的海藻酸鈉鹽微球凝膠材料，細(xì)胞組在L5/6退變椎間盤注射誘導(dǎo)分化的髓核細(xì)胞，治療8周后，開始進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 番紅O染色和組織學(xué)評(píng)分

取5組實(shí)驗(yàn)兔的軟骨組織，采用10%多聚甲醛進(jìn)行固定，脫鈣，并制備石蠟切片。常規(guī)脫蠟至水，將組織標(biāo)本至于新鮮配置的WEIGERT染液中染色5 min，結(jié)束后再酸性乙醇分化液中分化15 s，用蒸餾水洗滌10 min，在固綠染色液中染色5 min，蒸餾水洗滌1 min，置入Safranin O染色液中染色2 min，蒸餾水洗滌2 min，然后采用95%乙醇和無水乙醇脫水，二甲苯透明后封片。評(píng)分方法采用國際骨關(guān)節(jié)炎研究協(xié)會(huì)評(píng)分系統(tǒng)的改良OARSI評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：正常關(guān)節(jié)軟骨為0分；聚蛋白聚糖、基質(zhì)、軟骨細(xì)胞丟失及基質(zhì)出現(xiàn)纖維化改變，占全部軟骨5%～10%，評(píng)1分；占全部軟骨11%～25%，評(píng)2分；占全部軟骨26%～50%，評(píng)3分；占全部軟骨51%～75%，評(píng)4分；占全部軟骨75%以上，評(píng)5分?？偡址秶鸀?～30分。

1.3.2 免疫組化檢測(cè)

取5組實(shí)驗(yàn)兔的軟骨組織，采用10%多聚甲醛進(jìn)行固定，脫鈣，并制備石蠟切片。然后按照常規(guī)染色方法對(duì)椎間盤組織Ⅱ型膠原和MMP3蛋白進(jìn)行染色，最后切片采用中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。并對(duì)免疫組化進(jìn)行評(píng)分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)量數(shù)據(jù)比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IPS細(xì)胞鑒定

本研究在成纖維細(xì)胞MEF中過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子成功誘導(dǎo)產(chǎn)生了IPS細(xì)胞，采用磁珠分選CD24+iPS細(xì)胞，在低氧條件下誘導(dǎo)產(chǎn)生了髓核細(xì)胞。低氧誘導(dǎo)分化的細(xì)胞能夠表達(dá)髓核細(xì)胞的標(biāo)記物integrin α6，cytokertin5/8和vimetin等，而未經(jīng)誘導(dǎo)分化的細(xì)胞則不表達(dá)。

2.2 組織學(xué)評(píng)分結(jié)果

將IPS誘導(dǎo)分化的髓核細(xì)胞與海藻酸鈉鹽微球凝膠復(fù)合注射退變椎間盤，組織學(xué)椎間盤軟骨的變化見圖1，表1。與對(duì)照組軟骨退變?cè)u(píng)分比較，模型組、材料組、細(xì)胞組和聯(lián)合組椎間盤軟骨退變?cè)u(píng)分明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，細(xì)胞組和聯(lián)合組椎間盤軟骨退變水平顯著改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與細(xì)胞組比較，聯(lián)合組椎間盤改善更為顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。模型組和材料組比較，椎間盤軟骨退變?cè)u(píng)分無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 5組椎間盤軟骨退變情況組織學(xué)觀察（HE，×200） 1a:對(duì)照組，椎間盤軟骨表面基質(zhì)和軟骨細(xì)胞緊密排列，表面光滑 1b:模型組，兔椎間盤可見基質(zhì)與軟骨細(xì)胞丟失，軟骨細(xì)胞表面出現(xiàn)纖維化改變 1c:材料組，對(duì)椎間盤退變無影響1d:細(xì)胞組也有一定程度改善 1e:聯(lián)合組，椎間盤經(jīng)治療后基質(zhì)和軟骨細(xì)胞退變得到很大程度改善

2.3 免疫組化檢測(cè)結(jié)果

免疫組織化學(xué)分析5組兔椎間盤組織Ⅱ型膠原和MMP3蛋白的表達(dá)水平見表1。與對(duì)照組Ⅱ型膠原比較，模型組、細(xì)胞組、材料組和聯(lián)合組Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，細(xì)胞組和聯(lián)合組Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，其中聯(lián)合組增加更顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組MMP3蛋白表達(dá)水平比較，模型組、細(xì)胞組、材料組和聯(lián)合組MMP3蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，細(xì)胞組和聯(lián)合組MMP3蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)，其中聯(lián)合組下調(diào)更顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 5組動(dòng)物椎間盤組織檢測(cè)結(jié)果（±s）與比較

表1 5組動(dòng)物椎間盤組織檢測(cè)結(jié)果（±s）與比較

images/BZ_69_205_3017_506_3083.png組織學(xué)評(píng)分（分）II型膠原（OD值）images/BZ_69_506_3017_804_3083.png1.27±0.19 8.59±2.01images/BZ_69_804_3017_1103_3083.png19.43±3.48 2.18±1.15images/BZ_69_1103_3017_1418_3083.png18.59±4.01 2.87±1.38images/BZ_69_1418_3017_1755_3083.png13.11±3.81 4.59±1.84images/BZ_69_1755_3017_2099_3083.png5.90±2.01 6.94±2.31images/BZ_69_2099_3017_2276_3083.pngimages/BZ_69_205_3150_506_3216.pngimages/BZ_69_506_3150_804_3216.pngimages/BZ_69_804_3150_1103_3216.pngimages/BZ_69_1103_3150_1418_3216.pngimages/BZ_69_1418_3150_1755_3216.pngimages/BZ_69_1755_3150_2099_3216.pngimages/BZ_69_2099_3150_2276_3216.png0.003 0.011

3 討論

細(xì)胞治療為椎間盤退變提供了一種全新的治療理念。椎間盤退變的本質(zhì)是髓核細(xì)胞減少，導(dǎo)致椎間盤出現(xiàn)退化。目前研究證實(shí)采用向椎間盤注射髓核細(xì)胞可顯著緩解椎間盤退變；另有研究采用骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞也可以緩解椎間盤退變，達(dá)到治療椎間盤退變的功能［12，13］。多能誘導(dǎo)干細(xì)胞為臨床細(xì)胞治療提供了新的途徑。目前采用不同的誘導(dǎo)條件可將IPS細(xì)胞誘導(dǎo)分化成多種成熟細(xì)胞［14］。本研究采用在成纖維細(xì)胞中過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)產(chǎn)生IPS細(xì)胞，并通過篩選和優(yōu)化分化條件，成功在低氧條件下產(chǎn)生了髓核細(xì)胞。采用免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)，IPS誘導(dǎo)分化的細(xì)胞均表達(dá)髓核細(xì)胞的標(biāo)記物，這一研究為后續(xù)試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

雖然直接采用髓核細(xì)胞注射治療能夠起到治療椎間盤退變的作用，但是研究發(fā)現(xiàn)，髓核細(xì)胞治療退變椎間盤還需要為其提供良好生長(zhǎng)、不斷分化增殖和分泌細(xì)胞外基質(zhì)的微環(huán)境［15］。天然的椎間盤基質(zhì)材料不僅需要具備良好的強(qiáng)度，而且能通過特定的細(xì)胞信號(hào)傳遞系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞的粘附和向髓核定向分化進(jìn)行精確的調(diào)控。隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，海藻酸鈉鹽作為支架材料的運(yùn)用越來越廣泛。海藻酸鈉鹽支架穩(wěn)定性好，具有良好的生物降解性和生物相容性，能夠支持種子細(xì)胞分布，并為其提供了良好的微環(huán)境［16］。本研究將海藻酸鈉鹽微球凝膠和IPS定向分化的髓核細(xì)胞復(fù)合，分析了其對(duì)兔退變椎間盤的修復(fù)作用。

研究結(jié)果顯示，海藻酸鈉鹽微球凝膠和IPS定向分化的髓核細(xì)胞復(fù)合治療8周后，可見兔椎間盤軟骨退變得到顯著緩解，明顯優(yōu)于單純材料和單純細(xì)胞治療的效果。椎間盤退變主要表現(xiàn)為膠原蛋白的丟失和細(xì)胞外基質(zhì)降解的增加。II型膠原主要由軟骨細(xì)胞表達(dá)，也被稱為軟骨膠原，主要存在于軟骨，角膜，椎間盤髓核等組織中，在椎間盤承受壓力方面發(fā)揮主要作用。在椎間盤發(fā)生退變時(shí)，II型膠原會(huì)逐漸減少［17］。MMP-3是基質(zhì)降解酶亞家族之一，是降解細(xì)胞外基質(zhì)的主要酶類，在細(xì)胞外基質(zhì)的降解中起重要作用，可裂解II型膠原的非螺旋區(qū)以及其他種類膠原，最近導(dǎo)致軟骨降解［20］。本研究結(jié)果說明海藻酸鈉鹽微球凝膠和IPS定向分化的髓核細(xì)胞復(fù)合治療顯著改善了椎間盤的內(nèi)環(huán)境，使得軟骨組織開始重新合成，降解減少。此外，本研究也觀察到單純IPS定向分化的髓核細(xì)胞注射液具有一定的治療作用，但是效果遠(yuǎn)遜于聯(lián)合治療法。

綜上所述，海藻酸鈉鹽微球凝膠和IPS定向分化的髓核細(xì)胞復(fù)合對(duì)兔退變椎間盤具有治療作用。