張琦惠，胡 凱，梁 偉

（云南省玉溪市食品藥品檢驗(yàn)所 云南 玉溪 653100）

維生素B2，也可被稱為維他命B2、核黃素等，其是人體多種輔酶的重要構(gòu)成部分。維生素B2 的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載從2015 年版《中國(guó)藥典》到2020 年版《中國(guó)藥典》[1]，未進(jìn)行維生素B2 含量均勻度檢測(cè)，為了提高了制劑的均勻性要求。鑒于維生素B2 的應(yīng)用相對(duì)廣泛，當(dāng)前對(duì)其涉及含量測(cè)定的研究比較多，但少見有關(guān)維生素B2 含量均勻度的檢測(cè)方法，因而開展此次研究，以探究高效液相色譜法測(cè)定維生素B2 含量均勻度的效果，提高用藥安全。

1.儀器和試藥

1.1 儀器

Agilent1200 型高效液相色譜儀，配置二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)安捷倫公司）；PM200 電子天平（梅特勒托利多）；TBˉ215D 電子天平（賽多利斯）；ELGA 超純水儀；優(yōu)普超純水儀，HUI10260F 超聲波清洗儀（天津恒奧科技發(fā)展有限公司）。

1.2 試藥

乙腈、甲醇、庚烷磺酸鈉都是色譜純，冰醋酸是分析純，水為蒸餾水，維生素B2 對(duì)照品（純度：98.2%，批號(hào)：100369 ～201504）由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；維生素B2 片（昆藥集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)：170415 ～01；華中藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：20171116；20170605，規(guī)格：5 mg）。量瓶中，加入鹽酸溶液（1 →2）10 mL,振搖，加適量蒸餾水，采用HUI10260F 超聲波清洗儀對(duì)其進(jìn)行超聲震蕩，以使維生素B2 溶解，室溫下放冷，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，作為儲(chǔ)備液（濃度為200μg/mL）。

2.2.2 供試品溶液制備的避光操作 選取含有維生素B2 的藥品10 片，分別將其置入50 mL 容量瓶中，加入鹽酸溶液（1 →2）10 mL,振搖，加適量蒸餾水，超聲震蕩，以使維生素B2 溶解，室溫下放冷，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，精密量取濾過(guò)液5 mL，將其置入25 mL 容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 采用移液器，精密稱取維生素B2 的對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL、2 mL、5 mL、10 mL、20 mL 分別加入到100 mL 容量瓶中，用蒸餾水稀釋，將其制備成質(zhì)量濃度為2μg/mL、4μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL 的系列溶液，按擬定色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。以系列溶液濃度（C）為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如下表1 和圖1。得回歸方程y=35.886xˉ4.6485（r=1.000）。結(jié)果表明，維生素B2 的質(zhì)量濃度在2 ～40μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，見表1。

2.方法和結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為AgilentHCˉC18（4.6×150 mm,5μm）,流動(dòng)相為甲醇ˉ乙腈ˉ0.01 mol/L 庚烷磺酸鈉（0.5%冰醋酸溶液）按照5 ∶10 ∶85 比例設(shè)定，流速1.0 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)λ=444nm，進(jìn)樣量20μl,柱溫30℃，理論塔板數(shù)按維生素B2 峰計(jì)高于2000，維生素B2 峰和其他雜質(zhì)峰分離度達(dá)到1.5。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液制備避光操作 采用TBˉ215D 電子天平精密稱取維生素B2 的對(duì)照品10 mg，將其置入50 mL

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取維生素B2 的對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，將其制備成維生素B2 的低質(zhì)量濃度（10μg/mL）、中質(zhì)量濃度（20μg/mL）、高質(zhì)量濃度（40μg/mL）的系列溶液，分別重復(fù)進(jìn)樣六次，記錄色譜峰面積。三個(gè)不同濃度對(duì)照品溶液的RSD 值分別為0.63%、0.70%和1.28%（n=6），結(jié)果符合規(guī)定RSD＜2.0%，表示隨機(jī)誤差小，儀器精密度較好，可用于維生素B2 質(zhì)量控制。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品（批號(hào)為20171116），參照“2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備溶液，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h 時(shí)按照上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰面積。所得結(jié)果的RSD 為1.04%（n=6），結(jié)果表明供試品溶液穩(wěn)定性較好，在24 h 內(nèi)變化不明顯，可以達(dá)到檢測(cè)時(shí)間的要求。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品（批號(hào)為20171116）6 份，參照“2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備溶液6 份，采用移液器，精密量取20μl 制備溶液，將其注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖峰面積。所得結(jié)果的RSD 為1.13%（n=6），結(jié)果表明供試品溶液的重復(fù)性較好，能夠滿足檢測(cè)要求。

2.4 樣品含量均勻度測(cè)定

取三個(gè)不同批號(hào)的樣品，參照“2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，采用移液器，精密量取20μl 制備溶液，將其注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖峰面積并帶入回歸方程，計(jì)算百分含量，所得結(jié)果均滿足藥典要求，見表2。

表2 樣品含量均勻度的測(cè)定結(jié)果（n=6）

3.結(jié)果

本文采取高效液相色譜法測(cè)定維生素B2 含量均勻度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這種方法具有較強(qiáng)的專屬性與靈敏度，結(jié)果準(zhǔn)確且可靠，可以用于維生素B2 含量均勻度測(cè)定。

4.討論

維生素B2 是人體生命活動(dòng)中不可或缺的重要組成部分，為體內(nèi)黃酶類輔基的組成部分（黃酶在生物氧化還原中發(fā)揮遞氫作用），當(dāng)缺乏時(shí)，就影響機(jī)體的生物氧化，使代謝發(fā)生障礙[4]。維生素B2 在中性或酸性溶液中是比較穩(wěn)定的，其損失主要為以下方面：（1）可被光破壞；（2）在堿溶液中加熱可被破壞。由于體內(nèi)維生素B2 的儲(chǔ)存是很有限的，因此每天都要由飲食提供。準(zhǔn)確檢測(cè)維生素B2 的含量，具有重要的臨床價(jià)值。

目前，維生素B2 的檢測(cè)方法多樣，在2020 年版《中國(guó)藥典》中，未進(jìn)行含量均勻度測(cè)定，因維生素B2 影響因素多，易受輔料的干擾。但陳振欽的研究認(rèn)為[5]，采用紫外ˉ可見分光光度法測(cè)定維生素B2 片的含量均勻度是可行的，所建立的方法簡(jiǎn)便且準(zhǔn)確，檢測(cè)結(jié)果中，穩(wěn)定性和重復(fù)性都比較好，可將紫外ˉ可見分光光度法測(cè)定維生素B2 含量均勻度作為維生素B2 片的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了高效液相色譜法可用于測(cè)定維生素B2 含量均勻度檢測(cè)，該法檢測(cè)靈敏度高，是一種行之有效的方法。提示高效液相色譜法可用于維生素B2片質(zhì)量控制，且結(jié)果準(zhǔn)確。黃偉志等研究也同樣認(rèn)為，維生素B1、維生素B2 的質(zhì)量濃度分別在0 ～80μg/mL、0 ～40μg/mL 范圍內(nèi)，與其峰面積呈線性關(guān)系，R2值分別為0.99998、0.99999,說(shuō)明線性關(guān)系較好。檢測(cè)方法的精密度、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.50%、0.77%。結(jié)果得出檢測(cè)相對(duì)偏差分別在2%～5%、1%～5%，檢測(cè)結(jié)果與實(shí)測(cè)結(jié)果接近。提示高效液相色譜法可用，且結(jié)果準(zhǔn)確。

有文獻(xiàn)提出，供試品溶液在避光條件下儲(chǔ)放保存，放置時(shí)間不會(huì)對(duì)測(cè)定帶來(lái)明顯影響。但是因?yàn)閮?chǔ)放中空氣的影響，讓測(cè)定結(jié)果不穩(wěn)定，有偏高的趨勢(shì)。同時(shí)，溫度對(duì)測(cè)定結(jié)果有較大的影響，所以在實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，選擇密封性能良好的量瓶，并隨時(shí)密封好量瓶，實(shí)驗(yàn)室溫度不能過(guò)低。

依照方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果與含量均勻度測(cè)定結(jié)果可以得知，高效液相色譜法快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度極高，相對(duì)偏差比較小，可以用于維生素制劑的質(zhì)量控制，確保藥品質(zhì)量，降低用藥風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，高效液相色譜法具有操作方便、靈敏度高、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，可用于維生素B2 含量均勻度測(cè)定。