高 宇，孟玉凱，王 晨，石玉節(jié)，張 甜，岳偉東，朱東陽，馬海利

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西太谷030801）

自1991 年加拿大報道首例PCV2 引起的斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）以來，豬圓環(huán)病毒病已成為影響世界養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[1-4]。豬圓環(huán)病毒（PCV）屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，是至今發(fā)現(xiàn)的最小動物病毒。根據(jù)基因序列的不同，PCV 分為PCV1、PCV2、PCV3 和PCV4[5-6]。其中，PCV2 可損傷豬的免疫系統(tǒng)，被認(rèn)為是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）、豬皮炎腎病綜合征（PDNS）等多種病癥的病原體，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的損失[7]。

目前，對于PCV2 的預(yù)防措施主要是免疫接種，市場上主要有PCV 2a，PCV 2b 和PCV 2d 等3 種疫苗基因型，但是PCV2 基因型較多，國內(nèi)外均有免疫失敗的案例報道，因此，對于山西地區(qū)的PCV2 遺傳變異分析很有必要。PCV2 基因為單股環(huán)狀DNA分子，全長1767bp 左右，有13 個開放閱讀框（ORF）。目前對ORF1、ORF2 與ORF3 的功能研究較為清楚，其他開放閱讀框的功能尚不明確[8]。ORF1 基因高度保守，編碼與病毒復(fù)制相關(guān)的Rep 蛋白和Rep'蛋白[9-10]；ORF 2 基因變異程度較高，位于基因組反義鏈上，基因長為702 bp 或705 bp，編碼PCV2 唯一的結(jié)構(gòu)蛋白Cap 蛋白，Cap 蛋白與免疫和病毒的感染密切相關(guān)，可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生針對PCV2 的特異性中和抗體[11-12]；ORF3 基因長為315 bp，位于ORF1內(nèi)，按相反方向進行轉(zhuǎn)錄，編碼104 個氨基酸的凋亡蛋白，在誘導(dǎo)感染細(xì)胞凋亡方面有著重要作用[13-14]。

為了解山西省PCV2 的流行情況及PCV2 病毒株的遺傳差異情況，2019 年收集山西省部分地區(qū)PCV2 疑似感染病料用PCV2 基因鑒定引物進行PCR 擴增和凝膠電泳，對于鑒定陽性樣品進行全基因擴增及測序，并將拼接好的PCV2 序列與GenBank 中公布的PCV2 基因序列進行比對分析，構(gòu)建基因進化樹，為山西省豬圓環(huán)病毒病2 型防控疫苗的基因型選擇及疫苗研發(fā)提供一定的參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品來源

疑似PCV2 感染肺臟組織收集自山西省陽泉、柳林、平遙、澤州和高平5 個地方的屠宰廠，每個地方收集3 份，共15 份。

1.2 主要試劑

DNA 提取試劑盒購買自天根生化科技（北京）有限公司；DL 2000 DNA Marker、2×TaqMaster-Mix購買自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.3 引物

PCV2 特異鑒定引物和PCV2 全基因擴增引物分別源自參考文獻(xiàn)[15]和[16]（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物序列

1.4 病毒基因組DNA 的提取

取豬肺臟組織2 g 左右于研缽中，加液氮研磨粉碎后移至2 mL EP 管中，加入500 μL PBS 溶液，按照DNA 提取試劑盒說明書提取病毒基因組DNA，置-20 ℃冰箱保存，備用。

1.5 疑似PCV2 鑒定

以提取的病毒基因組DNA 為模板，用PCV2鑒定引物進行PCR 擴增，反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)參數(shù)為：預(yù)變性94 ℃4 min；94 ℃1 min，55 ℃1 min，72 ℃1 min，共30 個循環(huán)；72 ℃終末延伸7 min，4 ℃暫時保存。核酸凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物片段大小是否與預(yù)期一致。

1.6 PCV2 全基因擴增與測序

以鑒定PCV2 陽性樣品的基因組DNA 為模板，用PCV2 全基因擴增的4 對引物分別進行PCR擴增，反應(yīng)體系為40 μL，反應(yīng)參數(shù)為：預(yù)變性94 ℃5 min；94 ℃1 min，57 ℃1 min，72 ℃1 min，共35 個循環(huán)；72 ℃終末延伸10 min，4 ℃暫時保存。PCR 擴增產(chǎn)物進行核酸凝膠電泳。將PCV2 陽性樣品中同時擴增出4 條清晰明亮目的條帶PCR 產(chǎn)物送上海英俊生物科技有限公司進行序列測定。

1.7 序列比對分析

利用DNAStar-SeqMan 拼接PCV2 全基因組序列，用DNAStar-MegAlign 和MEGA-X 比對分析擴增序列與GenBank 上已發(fā)布的PCV2 疫苗毒株、各基因型標(biāo)準(zhǔn)參考毒株、國內(nèi)外不同國家和地區(qū)毒株（表2）的核苷酸同源性、遺傳進化（樹）；并對ORF2基因推導(dǎo)的Cap 蛋白氨基酸同源性和突變位點進行分析。

表2 PCV2 參考序列

2 結(jié)果與分析

2.1 疑似PCV2 鑒定

用PCV2 鑒定引物PCV2 F 和PCV2 R 對山西陽泉、柳林、平遙、澤州和高平的15 份疑似PCV2豬肺臟組織進行PCR 擴增和凝膠電泳，有12 份病料擴增出預(yù)期目的片段（圖1），鑒定為PCV2 陽性樣品。

2.2 PCV2 全基因的PCR 擴增

用4 對PCV2 全基因擴增引物分別對陽泉、柳林、平遙、澤州和高平12 份PCV2 陽性樣品進行PCR 擴增和凝膠電泳，共有6 份陽性樣品同時擴增出4 個預(yù)期的目的片段（圖2）。

2.3 測序基因的拼接與命名

將同時獲得4 個目的片段的PCR 擴增產(chǎn)物進行測序，用DNAStar-SeqMan 拼接基因，獲得6 株P(guān)CV2 全基因序列，分別命名為SXYQ-1、SXLL-2、SXZZ-3、SXZZ-4、SXGP-5、SXPY-6。其中SXYQ-1、SXLL-2、SXZZ-3、SXZZ-4 有1767 個核苷酸，SXGP-5、SXPY-6 有1 768 個核苷酸。

2.4 全基因遺傳進化分析

應(yīng)用DNAStar-MegAlign 對6 株P(guān)CV2 全基因進行遺傳進化分析和比較。6 株之間核苷酸同源性為96.6%～99.9%。與GenBank 上已發(fā)布的國內(nèi)外疫苗株同源性為95.4%～98.7%，與國內(nèi)、國外其他毒株同源性分別為95.4%～99.8%和94.6%～99.8%。與山西太原毒株（KX352155）同源性為95.5%～95.8%。

應(yīng)用MEGA-X 對6 株P(guān)CV2 全基因進行進化樹分析可知（圖3），6 株P(guān)CV2 處在2 個不同的進化分支上，SXYQ-1、SXLL-2、SXZZ-3、SXZZ-4、SXGP-5處在同一分支上，屬于PCV 2b 型；SXPY-6 處于另一分支上，屬于PCV 2d 型。

2.5 ORF2 基因遺傳進化分析

應(yīng)用DNAStar-MegAlign 軟件對6 株P(guān)CV2ORF2基因進行遺傳進化分析和比較。6 個ORF2 基因序列長度均為702bp。6 株之間核苷酸的同源性為94.8%～99.9%，與GenBank 上已發(fā)布的國內(nèi)外疫苗株同源性為92.3%～99.0%，與國內(nèi)、國外其他毒株同源性分別為91.5%～99.9%和91.8%～99.9%。與山西太原毒株（KX352155）同源性最低，為91.5%～92.8%。

應(yīng)用MEGA-X 對6 株P(guān)CV2 ORF2 基因進行進化樹分析（圖4），6 株處在2 個不同進化分支上。SXYQ-1、SXLL-2、SXZZ-3、SXZZ-4、SXGP-5 處 在同一分支上，屬于PCV 2b 型；SXPY-6 處于另一分支上，屬于PCV 2d 型。

2.6 ORF2 基因推導(dǎo)Cap 蛋白氨基酸分析

應(yīng)用DNAStar-MegAlign 分析6 株P(guān)CV2 的ORF2 基因推導(dǎo)的Cap 蛋白氨基酸序列（圖5）。6 株P(guān)CV2 的Cap 蛋白均為233 個氨基酸，其氨基酸同源性為94.0%～100%；與參考毒株Cap 蛋白氨基酸同源性為88.0%～100%，與國內(nèi)外疫苗株同源性為90.6%～100%。Cap 蛋白氨基酸主要變異位點分析表明，氨基酸主要變異區(qū)域為57—90、121—135、190—210，在8、47、169、232、234 等處存在一些散在的變異位點。在86—90 位SXPY-6 有PCV 2d 特有的Cap 蛋白氨基酸序列SNPLT，屬于PCV2d 型；其余5 株在86—91 位有PCV 2b 特有的Cap 蛋白氨基酸序列SNPRS，屬于PCV 2b 型。

3 結(jié)論與討論

近年來，PCV2 在歐洲、美洲等一些國家和地區(qū)持續(xù)不斷存在，國內(nèi)有關(guān)PCV2 的報道不斷增加，PCV2 引起的圓環(huán)病毒病給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[8，17]。

通過對不同地區(qū)的PCV2 毒株的序列分析、比對，可以了解PCV2 的遺傳與進化，對疫苗的研發(fā)和選用具有重要意義。本研究從山西省部分地區(qū)疑似PCV2 病料中擴增測序獲得6 株P(guān)CV2 完整序列，其中，2 株核苷酸為1 768 bp、4 株核苷酸為1 767 bp，與GenBank 上已發(fā)布的國內(nèi)外PCV2 株同源性為94.6%～99.8%，表明山西省內(nèi)流行的PCV2毒株與目前國內(nèi)外流行的毒株序列同源性很高；6 株P(guān)CV2 的ORF2 基因序列與GenBank 上已發(fā)布的國內(nèi)外毒株進行序列比對同源性為91.5%～99.9%，表明PCV2 的ORF2 基因比全基因組變異程度較高；綜合PCV2 全基因和ORF2 基因同源比對結(jié)果，表明山西省內(nèi)PCV2 基因存在一定程度的變異。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，按Cap 蛋白氨基酸在86—89 位的特定序列分型，與全基因和ORF2 基因分型相一致，和李文良[18]對于PCV2 各個基因型Cap蛋白在86—89 位有特定序列的結(jié)果相一致。

本研究得到的6 株序列按全基因或者ORF2基因分型，5 株屬于PCV 2b 型、1 株屬于PCV 2d型，可以初步判斷山西省目前流行的圓環(huán)病毒2 型以PCV 2b 型為主。本研究只選擇了山西晉中、晉南和晉北5 個地方的樣品，測得的基因序列數(shù)目有限，對于PCV2 在山西省的流行情況，需要進一步加大對PCV2 基因型變異的監(jiān)測力度，以便為PCV2 疫苗基因型選擇、疫苗研發(fā)和山西省PCV2防控提供依據(jù)。