陳淋,王興紅,劉云鵬

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院華北林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心,北京 102300;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)化研究所,北京 100081)

根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)可以通過侵染多種植物的根、莖,導(dǎo)致植物患根癌病(冠癭病),其中薔薇科植物患病較為嚴(yán)重,根癌病的發(fā)生不僅會(huì)影響植物的生長(zhǎng),甚至?xí)斐芍参锏乃劳?根癌病在全球范圍內(nèi)已造成包含薔薇在內(nèi)的薔薇科植物嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。根癌農(nóng)桿菌通過吸附并定殖在植物上,將T-DNA片段轉(zhuǎn)移并整合至植物的基因組上,從而調(diào)控植物的生理代謝,使植物形成冠癭。

目前防治植物病害的方法有多種,包括化學(xué)防治、轉(zhuǎn)基因植物和生物防控等[3-5]。在這些方法中,利用根際促生菌(plant growth-promoting rhizobacteria,PGPR)進(jìn)行的生物防控是一種對(duì)環(huán)境友好且可持續(xù)發(fā)展的方法。PGPR是一類能在植物根際存活和定殖并能提高植物養(yǎng)分吸收、促進(jìn)植物生長(zhǎng)、防控土傳病害和增強(qiáng)植物抗逆的有益微生物[6-7]。

根際定殖對(duì)PGPR發(fā)揮促生和抗脅迫作用至關(guān)重要,也是PGPR有效防控土傳病害的重要前提,該過程主要包括細(xì)菌向根際的趨化和生物膜的形成。植物可以通過調(diào)控根系分泌物組分影響根際微生物的生長(zhǎng)、趨化和生物膜的形成[8]。據(jù)報(bào)道,有20%～80%的光合作用產(chǎn)物會(huì)以根系分泌物的形式釋放到根際[9]。根系分泌物主要分成2大類:小分子化合物和大分子化合物。很多小分子化合物可以與根際微生物相互作用,例如作為微生物的趨化物、趨避物、生物膜形成誘導(dǎo)因子、抑制因子等[10-11]。根系分泌物組分會(huì)隨環(huán)境因子的改變而產(chǎn)生變化,益生菌和病原菌的定殖都可以誘導(dǎo)植物通過調(diào)控根系分泌物構(gòu)建更加健康的微生物群落[12-13]。目前這方面的研究主要還是集中在模式植物和農(nóng)作物上[9,14],木本植物如何通過調(diào)控根系分泌物來影響根際微生物定殖的研究仍較少。

貝萊斯芽胞桿菌(Bacillusvelezensis)CLA178是從薔薇根際分離得到的1株對(duì)植物有顯著促生效果和生防特性的PGPR。根癌病是一種宿主廣泛的病害,薔薇植物易感染此病,而CLA178可誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性,有效減少植物根癌病的發(fā)病情況。本研究利用水培分根系統(tǒng)將植物根系分開,使后接種的CLA178不受預(yù)接種菌株的直接干擾,同時(shí)也避免收集的根系分泌物受到預(yù)接種菌株的直接影響。本研究通過分析根系分泌物組分與CLA178定殖的相關(guān)性篩選潛在的信號(hào)物質(zhì),通過分析不同物質(zhì)與菌株趨化性、生物膜形成和生長(zhǎng)的關(guān)系確定調(diào)控CLA178根際定殖的信號(hào)物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

貝萊斯芽胞桿菌(Bacillusvelezensis)CLA178是本實(shí)驗(yàn)中心從薔薇根際土壤分離到的1株P(guān)GPR。根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)C58是1株根癌病(冠癭病)的致病菌,其菌株保藏編號(hào)是ATCC 33970T/ACCC 10055T。將2株菌分別在LB液體培養(yǎng)基中170 r·min-1振蕩培養(yǎng)8～10 h,培養(yǎng)溫度為 30 ℃。將菌液進(jìn)行離心后收集,用無菌的磷酸緩沖液(PBS,pH 7.0)重懸至D600值為1。

用無刺野薔薇(Rosamultiflora‘innermis’)當(dāng)年生的枝條進(jìn)行扦插苗培育:將枝條進(jìn)行表面消毒,剪成相同長(zhǎng)度的枝段(15 cm),將其扦插于含有生根溶液的無菌蛭石中。將扦插苗置于25 ℃人工氣候室內(nèi)培育8周,光照/黑暗培養(yǎng)時(shí)間為14 h/10 h。

1.2 根系分泌物的收集與分析

將生根的扦插苗轉(zhuǎn)移至裝有無菌的150 mL 1/4 MS培養(yǎng)液的三角瓶中[15],每個(gè)三角瓶中移入1棵扦插苗,50 r·min-1振蕩培養(yǎng)2 h,培養(yǎng)液每2 d換1次。扦插幼苗于25 ℃人工氣候室內(nèi)繼續(xù)培育3周,以獲得更強(qiáng)壯的根系。將三角瓶中無菌幼苗轉(zhuǎn)移至分根盒中(圖1),將根等分至根盒兩側(cè),每側(cè)加入1/4 MS培養(yǎng)液,使根部浸沒于培養(yǎng)液中,分根盒兩側(cè)的培養(yǎng)液每2 d更換1次,繼續(xù)培養(yǎng)1周后進(jìn)行試驗(yàn)處理。

圖1 分根盒試驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖Fig.1 Split-root experimental design

將CLA178和C58的菌懸液分別接種至分根盒左側(cè)根室內(nèi)至D600值為 0.01,無菌的PBS作為對(duì)照處理。2 d后,在檢測(cè)完右側(cè)根室的無菌度后,將右側(cè)根室的營(yíng)養(yǎng)液更換成無菌水,每天收集右側(cè)的根系分泌物并添加無菌水,連續(xù)收集3 d(每個(gè)分根盒裝有6棵苗,每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù))。將收集的溶液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)行凍干,同時(shí)對(duì)浸沒于培養(yǎng)液中的根部稱重。將凍干好的根系分泌物送至北京奧維森進(jìn)行GC-MS分析。取10 mg樣本,進(jìn)行代謝物提取后,通過Agilent 7890氣象色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-TOF-MS,J&W Scientific,USA)進(jìn)行組分分析,毛細(xì)管柱為Agilent DB-5MS(30 m×250 μm×0.25 μm)。

1.3 相關(guān)性分析

在分根盒左側(cè)預(yù)接種不同菌株2 d后,右側(cè)接種CLA178菌株,2 d后測(cè)定右側(cè)的CLA178定殖數(shù),通過根重進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。將不同處理的CLA178的根部定殖數(shù)與對(duì)應(yīng)的根系分泌物組分進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析,分析根系分泌物中調(diào)控CLA178定殖的潛在物質(zhì)。通過P值排序,選擇P值最低的10個(gè)物質(zhì)作為潛在信號(hào)物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步分析。

1.4 趨化性分析

采用微流控芯片技術(shù)檢測(cè)菌株CLA178的趨化性[16]。在體式顯微鏡下組裝干凈的芯片,用白槍頭蘸取5% 9,9-二辛基聚芴(FC-40 oil),用油將2層芯片周圍的縫隙封上,孔道中的油用移液槍吹出。將 1 mg·mL-1牛血清白蛋白(BSA)加入孔道中,隨后用移液槍打出。分別將溶于PBS的物質(zhì)、溶于PBS的菌液和PBS加入芯片的上、中、下孔道。在體式顯微鏡下滑動(dòng)芯片使菌液能自由游動(dòng)至趨化物或PBS的方向,隨后將其置于室溫且避光的條件下,靜置30 min。靜置結(jié)束后的芯片即可在倒置熒光顯微鏡(Ti-Eclipse,200 Nikon,Tokyo Metropolis,Japan)下觀察。分別統(tǒng)計(jì)含有物質(zhì)小孔中的細(xì)菌數(shù)(Ne)和含有PBS對(duì)照小孔中的細(xì)菌數(shù)(Nc),計(jì)算趨化指數(shù)(It),It=Ne/(Ne+Nc),式中:t代表時(shí)間。理論上,It大于0.5時(shí)代表該物質(zhì)是趨化物,It小于0.5時(shí)代表該物質(zhì)是趨避物,It等于0.5時(shí)代表該物質(zhì)沒有趨化性。本研究中,為了獲得更可靠的結(jié)果,設(shè)定It大于0.55時(shí)代表該物質(zhì)是趨化物,It小于0.45時(shí)代表該物質(zhì)是趨避物,It大于0.45并小于0.55時(shí)代表該物質(zhì)沒有趨化性。

1.5 生物膜形成分析

將CLA178在LB培養(yǎng)液中30 ℃、170 r·min-1振蕩培養(yǎng)9 h,將菌液離心收集后重懸于MSgg培養(yǎng)液[5]中至D600值為0.1。將150 μL菌懸液加入無菌的96孔板中,再將無菌的釘蓋插入96孔板中,置于30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。在2個(gè)新的96孔板中每個(gè)孔加入200 μL PBS,分別作為沖洗板和回收板。將釘蓋轉(zhuǎn)移到第2個(gè)沖洗板中,放置1 min,隨后將釘蓋轉(zhuǎn)移到第3個(gè)回收板中,將已經(jīng)裝有釘蓋的回收板放入超聲波清洗儀中進(jìn)行超聲處理10 min。超聲結(jié)束后,附在釘蓋上的生物膜就會(huì)溶于回收液中,將回收液在LB平板上稀釋涂布,30 ℃培養(yǎng)24～48 h后,進(jìn)行單菌落計(jì)數(shù)。

1.6 菌株根際定殖的定量檢測(cè)

在含有1/4 MS的三角瓶中,加入不同濃度的GLcA、T6P、DOP,將表面消毒的薔薇扦插幼苗放入三角瓶中,使根浸沒于培養(yǎng)液中,隨后加入D600值為0.01的CLA178菌懸液,在細(xì)菌定殖2 d后,對(duì)根部定殖的細(xì)菌進(jìn)行定量測(cè)定。

將根用無菌水振蕩清洗30 s,去除未定殖在根部的菌,稱取1 g根,用液氮研磨后,用細(xì)菌DNA試劑盒(Omega)提取CLA178的DNA。通過ABI QuantstudioTM3D digital PCR儀(Life Technologies,Carlsbad,CA)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行定量。CLA178的特異性引物見表1。通過熔解曲線和凝膠電泳驗(yàn)證引物的特異性,對(duì)含有目標(biāo)基因的質(zhì)粒進(jìn)行梯度稀釋并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線將CT值轉(zhuǎn)化成拷貝數(shù)。

表1 本研究所用的引物Table 1 Primers used in this study

1.7 生長(zhǎng)曲線檢測(cè)

將LB中30 ℃培養(yǎng)9 h的CLA178離心,重懸于PBS后,以1%(體積分?jǐn)?shù))的接種量加入含有不同濃度GLcA、FAD、T6P、HYA、DOP的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中(1 g·L-1NH4NO3,0.5 g·L-1KH2PO4,1.5 g·L-1Na2HPO4,1 g·L-1NaCl,0.2 g·L-1MgSO4,5 g·L-1葡萄糖),以每孔300 μL加入生長(zhǎng)曲線測(cè)定微孔板中,置于全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀(Bioscreen Cpro,Finland)中,測(cè)量30 ℃下細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線,每個(gè)處理設(shè)置6個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.8 細(xì)菌RNA提取和轉(zhuǎn)錄分析

將重懸于PBS中的CLA178菌液加入至無機(jī)鹽培養(yǎng)基中至D600值為0.5,并在培養(yǎng)液中分別加入GLcA、FAD、T6P、HYA、DOP,置于搖床上,30 ℃、170 r·min-1培養(yǎng)9 h。將菌液離心收集后通過細(xì)菌RNA試劑盒(Omega)提取細(xì)菌的RNA。采用試劑盒(PrimeScriptRTReagent Kit,TaKaRa)將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,采用試劑盒TB Green RTPremixEXTaqTM(TaKaRa)和定量PCR儀(ABI QuantstudioTM3D digital PCR system,Life Technologies,CA)對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行定量PCR,以recA基因作為內(nèi)參。定量PCR所用的基因引物見表1。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用SPSS 25.0軟件進(jìn)行不同處理的方差分析和差異顯著性分析(Duncan’s multiple range tests),利用t測(cè)驗(yàn)分析2個(gè)樣本之間的差異顯著性(P<0.05),用R語言和Prism 8繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株CLA178對(duì)薔薇根癌病的影響

在薔薇根部預(yù)接種CLA178或PBS(CK)1 d后,在薔薇的莖段接種根癌農(nóng)桿菌C58,經(jīng)過14 d培養(yǎng)后,對(duì)照組(CK-C58)形成明顯的冠癭瘤,而處理組(CLA178-C58)則沒有形成明顯的瘤(圖2-A),CLA178顯著減少冠癭瘤的鮮重(圖2-B),該結(jié)果說明CLA178誘導(dǎo)薔薇植物系統(tǒng)抗性以抵抗冠癭病。

圖2 菌株CLA178對(duì)薔薇根癌病的作用Fig.2 The effect of CLA178 on rose crown gall diseaseCK-C58代表預(yù)接種PBS 1 d后接種C58;CLA178-C58代表預(yù)接種CLA178 1 d后接種C58。不同小寫字母代表不同處理之間顯著差異(P<0.05)。下同。CK-C58 indicates plants inoculated with C58 after pre-inoculation with PBS for 1 d. CLA178-C58 indicates plants inoculated with C58 after pre-inoculation CLA178 for 1 d. Different lowercase letters indicate significant difference among different treatments(P<0.05). The same as follows.

2.2 根系分泌物組分與CLA178根際定殖數(shù)的相關(guān)性

Chen等[17]研究發(fā)現(xiàn),在分根盒左側(cè)預(yù)接種PGPR CLA178或病原菌C58 2 d后,隨后在根盒右側(cè)接種的CLA178根際定殖數(shù)分別是(13.02±7.88)×106、(26.30±7.38)×105copies·g-1,顯著高于左側(cè)未預(yù)接種菌株的對(duì)照組(1.74±1.22)×103copies·g-1。為了進(jìn)一步分析影響CLA178根際定殖的根系分泌物中的潛在信號(hào)物質(zhì),通過GC-MS分析CK、 C58、CLA178處理薔薇根系分泌物組分,并將不同處理CLA178的根際定殖數(shù)與不同處理的根系分泌物組分進(jìn)行相關(guān)性分析(圖3-A),根據(jù)相關(guān)性的P值選出可信度最高的10個(gè)物質(zhì)進(jìn)行分析。在10個(gè)物質(zhì)中,葡萄糖酸(gluconic acid,GLcA)、黃素腺嘌呤二核苷酸二鈉(flavin adenine dinucleotide disodium,FAD)和海藻糖-6-磷酸(trehalose-6-phosphate,T6P)的含量與CLA178根際定殖數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系,且在2個(gè)預(yù)接種的根系分泌物中其含量均顯著高于對(duì)照組;2-羥基丁酸(2-hydroxybutanoic acid,HYA)和鄰苯二甲酸二辛酯(dioctyl phthalate,DOP)的含量與CLA178定殖數(shù)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,且2個(gè)預(yù)接種的根系分泌物中其含量均顯著低于對(duì)照組(圖3-B)。因此,推測(cè)GLcA、FAD、T6P、HYA、DOP可能是調(diào)控CLA178根際定殖的信號(hào)物質(zhì),對(duì)這5種根系分泌物進(jìn)行進(jìn)一步分析。

圖3 根系分泌物組分和CLA178根際定殖數(shù)的相關(guān)性Fig.3 Correlation of root exudates and number of CLA178 root colonizationA. 根系分泌物中各物質(zhì)與CLA178定殖數(shù)的相關(guān)性;B. 5個(gè)潛在的信號(hào)物質(zhì)在不同處理中的相對(duì)含量(GLcA:葡萄糖酸;FAD:黃素腺嘌呤二核苷酸二鈉;T6P:海藻糖-6-磷酸;HYA:2-羥基丁酸;DOP:鄰苯二甲酸二辛酯)。*P<0.05;**P<0.01。下同。A. The correlation between root colonization of CLA178 and each compound in the root exudates was shown in heatmap. B. The relative content of five potential signal compounds in each treatments(GLcA:Gluconic acid;FAD:Flavin adenine dinucleotide disodium;T6P:Trehalose-6-phosphate;HYA:2-hydroxybutanoic acid;DOP:Dioctyl phthalate). *P<0.05;**P<0.01. The same as follows.

2.3 菌株CLA178對(duì)不同根系分泌物的趨化響應(yīng)研究

為了鑒定CLA178對(duì)不同根系分泌物的趨化反應(yīng),通過微流控芯片技術(shù)進(jìn)行趨化性研究。當(dāng)處理 30 min 時(shí),趨化指數(shù)It大于0.55代表具有趨化性,小于0.45代表具有趨避性,0.45～0.55代表無趨化作用。結(jié)果顯示,20～100 μmol·L-1GLcA、1 μmol·L-1FAD、10～100 μmol·L-1T6P和1 μmol·L-1HYA對(duì)CLA178的趨化指數(shù)均高于0.55,50～100 μmol·L-1HYA的趨化指數(shù)小于0.45(圖4-A、B、C、D)。隨GLcA和T6P濃度的增加,CLA178對(duì)這2種根系分泌物的趨化性增加(圖4-A、C);隨HYA濃度的增加,CLA178對(duì)HYA的趨化性減弱,而趨避性增強(qiáng)(圖4-D)。CLA178僅對(duì)1 μmol·L-1FAD有一定的趨化性,對(duì)10～100 μmol·L-1FAD無趨化反應(yīng)(圖4-B);隨濃度改變,CLA178對(duì)DOP也無趨化反應(yīng)(圖4-E)。上述結(jié)果顯示,僅GLcA和T6P的濃度變化與CLA178趨化呈正相關(guān),HYA的濃度變化與CLA178趨化性呈負(fù)相關(guān),這與3種物質(zhì)在根系分泌物中含量與CLA178定殖數(shù)的相關(guān)性一致(圖3、4)。

圖4 CLA178對(duì)不同濃度根系分泌物的趨化響應(yīng)Fig.4 Effect of root exudates with different concentrations on chemotaxis of CLA178

2.4 不同根系分泌物對(duì)CLA178生物膜形成和生長(zhǎng)的影響

從圖5-A可知:GLcA和T6P在50～100 μmol·L-1時(shí)顯著促進(jìn)CLA178生物膜的形成,100 μmol·L-1HYA顯著促進(jìn)CLA178生物膜的形成,而不同濃度的FAD對(duì)CLA178生物膜的形成無顯著影響,20～100 μmol·L-1DOP顯著抑制CLA178生物膜的形成。整體而言,隨GLcA、T6P、HYA濃度的增加,CLA178生物膜形成也逐漸增加;而隨DOP濃度增加,CLA178生物膜形成逐漸減弱。此外,我們也檢測(cè)了不同濃度的物質(zhì)對(duì)CLA178生長(zhǎng)曲線的影響,僅DOP對(duì)CLA178生長(zhǎng)產(chǎn)生顯著影響(圖5-B),其他4個(gè)物質(zhì)并未對(duì)CLA178的生長(zhǎng)產(chǎn)生顯著影響(未提供無差異數(shù)據(jù))。10～100 μmol·L-1DOP顯著抑制CLA178的生長(zhǎng),因此DOP對(duì)CLA178生物膜的抑制作用可能是其抑制CLA178生長(zhǎng)而引起。HYA隨濃度增加促進(jìn)生物膜形成的結(jié)果與根系分泌物中HYA含量和CLA178定殖的負(fù)相關(guān)關(guān)系相矛盾,而在CLA178對(duì)FAD的趨化響應(yīng)研究和FAD對(duì)CLA178生物膜形成分析中均沒有顯著影響,因此排除HYA和FAD是薔薇根系調(diào)控CLA178定殖的潛在物質(zhì)的可能性。GLcA、T6P和DOP的濃度變化與CLA178生物膜形成或生長(zhǎng)的相關(guān)性是與這3種物質(zhì)在根系分泌物中含量和CLA178定殖的相關(guān)性一致。這說明GLcA、T6P和DOP可能是調(diào)控CLA178定殖根系分泌物質(zhì),可用于進(jìn)一步分析。

圖5 不同濃度根系分泌物對(duì)CLA178生物膜和生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effect of root exudates with different concentrations on biofilm formation and growth of CLA178A. 不同物質(zhì)對(duì)CLA178生物膜的影響;B. 不同濃度DOP處理下CLA178的生長(zhǎng)曲線。不同小寫字母代表同一物質(zhì)不同濃度之間顯著差異(P<0.05)。A. Effect of root exudates with different concentrations on biofilm formation of CLA178. B. Effect of DOP with different concentrations on growth of CLA178. Different lowercase letters indicate significant difference among different concentration(P<0.05).

基因表達(dá)結(jié)果顯示:100 μmol·L-1GLcA顯著上調(diào)epsD基因的表達(dá);20～100 μmol·L-1GLcA顯著上調(diào)yqxM基因表達(dá);1～100 μmol·L-1GLcA顯著上調(diào)sinI和kinC基因的表達(dá)(圖6-A)。隨GLcA濃度的增加,這4個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平也增加,該基因定量結(jié)果與生物膜結(jié)果相一致。20～100 μmol·L-1T6P顯著上調(diào)epsD基因的表達(dá);1 μmol·L-1T6P下調(diào)yqxM基因的表達(dá),在100 μmol·L-1時(shí)顯著上調(diào)yqxM基因的表達(dá);1～100 μmol·L-1T6P對(duì)sinI基因的表達(dá)沒有顯著調(diào)控作用,但是顯著上調(diào)kinC基因的表達(dá)(圖6-B)。除了sinI基因,其他3個(gè)基因的表達(dá)量隨T6P濃度的增加而增加,該基因定量結(jié)果與生物膜結(jié)果相一致。20 μmol·L-1DOP顯著上調(diào)epsD基因表達(dá);1～20 μmol·L-1DOP顯著上調(diào)yqxM基因表達(dá);100 μmol·L-1DOP則顯著下調(diào)yqxM和sinI基因的表達(dá);20～100 μmol·L-1DOP顯著上調(diào)kinC基因的表達(dá)(圖6-C)。隨著DOP濃度的增加,這4個(gè)基因的表達(dá)水平?jīng)]有呈現(xiàn)一致的變化趨勢(shì),該基因表達(dá)定量結(jié)果與生物膜結(jié)果存在差異。

圖6 不同根系分泌物對(duì)CLA178菌株epsD、yqxM、sinI、kinC基因表達(dá)水平的影響Fig.6 Effect of different root exudates on epsD,yqxM,sinI and kinC transcript levels in B. velezensis CLA178

2.5 不同根系分泌物對(duì)CLA178定殖的影響

從圖7可知:隨GLcA或T6P濃度的增加,CLA178的根際定殖數(shù)也逐漸增加;隨DOP濃度增加,CLA178的根際定殖數(shù)逐漸減少。這些結(jié)果表明,預(yù)接種CLA178或C58后,GLcA和T6P含量增加,以及DOP含量減少,均促進(jìn)薔薇根際CLA178的定殖。

圖7 不同濃度的根系分泌物對(duì)CLA178根際定殖的影響Fig.7 Effect of root exudates with different concentrations on CLA178 root colonization

3 討論

微生物根際定殖是根際微生物生態(tài)位競(jìng)爭(zhēng)的關(guān)鍵,也是其發(fā)揮益生作用的重要條件[18]。植物和微生物的根際互作是復(fù)雜的,受到多種環(huán)境因素的影響。根系分泌物是植物與根際微生物互作的重要媒介,植物與微生物互作可以通過調(diào)控根系分泌物來募集和排斥特異的微生物,并有助于防控植物病害[8,12]。很多植物均易受根癌病的侵染,本研究發(fā)現(xiàn)菌株CLA178可有效抑制薔薇根癌病的發(fā)生,且預(yù)接種病原菌C58和益生菌CLA178均可促進(jìn)薔薇根部CLA178的定殖。通過對(duì)根系分泌物的變化與CLA178根際定殖相關(guān)性的進(jìn)一步研究,初步確定根系分泌物中調(diào)控CLA178定殖的信號(hào)物質(zhì),并通過分析不同信號(hào)物質(zhì)與CLA178菌株趨化性、生物膜形成和定殖的關(guān)系,確定預(yù)接種菌株薔薇的根系分泌物中促進(jìn)CLA178定殖的3種信號(hào)物質(zhì)為GLcA、T6P和DOP。薔薇可能是通過增加根系分泌物中GLcA和T6P的含量,以及降低DOP的含量來增加益生菌CLA178的定殖,從而增強(qiáng)薔薇植物自身的抗病能力。本研究為植物-根際微生物互作提供了新的證據(jù),并為通過調(diào)控根際環(huán)境增強(qiáng)薔薇抗根癌病提供了理論基礎(chǔ)。

已報(bào)道有多種菌株可以抑制其他植物根癌病的發(fā)生,例如發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)K84、葡萄土壤桿菌(Agrobacteriumvitis)E26、VAR03-1、水生拉恩菌(Rahnellaaquatilis)HX2等,但是大多數(shù)已知防控根癌病的生防菌都與致病的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium)是近源關(guān)系,由于微生物之間基因的水平轉(zhuǎn)移非常普遍,這導(dǎo)致使用這類生防農(nóng)桿菌存在潛在風(fēng)險(xiǎn)[19]。而我們發(fā)現(xiàn)防控根癌病的益生菌CLA178是芽胞桿菌屬,相對(duì)于其他具有生防作用的農(nóng)桿菌近源微生物更加安全。

根系分泌物不僅為根際微生物提供碳源和能量,還是植物-微生物根際互作的重要信號(hào)物質(zhì)[8]。目前,已有多篇關(guān)于根系分泌物中影響微生物生理物質(zhì)的報(bào)道[20-22],枯草芽胞桿菌(B.subtilis)NCD-2對(duì)棉花根系分泌物中精氨酸、丙氨酸和賴氨酸有較強(qiáng)的趨化性[21];多黏類芽胞桿菌(Paenibacilluspolymyxa)SQR-21對(duì)西瓜根系分泌物中精氨酸、組氨酸和苯丙氨酸有顯著的趨化性,并促進(jìn)SQR-21的根際定殖[22];在黃瓜-解淀粉芽胞桿菌(B.amyloliquefaciens)SQR9-尖飽鐮刀菌(Fusariumoxysporum)FOC三方互作的研究中發(fā)現(xiàn),接種解淀粉芽胞桿菌SQR9可使黃瓜根系分泌物中的色氨酸含量增加,促進(jìn)SQR9定殖,而接種病原菌FOC則會(huì)降低黃瓜根系分泌物中的棉籽糖含量,進(jìn)一步減少FOC的定殖[14]。本研究發(fā)現(xiàn)預(yù)接種CLA178可以通過增加薔薇根系分泌物中GLcA和T6P的含量與減少DOP的含量來促進(jìn)CLA178的根際定殖。

菌株的趨化性和生物膜形成對(duì)菌株根際定殖有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)CLA178對(duì)GLcA和T6P有趨化性,GLcA和T6P對(duì)菌株CLA178有促進(jìn)生物膜形成作用,外源分別添加GLcA和T6P也促進(jìn)CLA178的根際定殖。此外,PGPR菌株SQR9對(duì)黃瓜根系分泌物產(chǎn)生趨化響應(yīng)時(shí),SQR9對(duì)GLcA有顯著的趨化性,該菌株對(duì)GLcA響應(yīng)的主要趨化蛋白是McpC[23]。T6P是植物各個(gè)階段生長(zhǎng)和發(fā)展的重要信號(hào)代謝物質(zhì),是植物碳水化合物變化的信號(hào)物質(zhì)和調(diào)控因子[24-25]。對(duì)于植物共生菌根瘤菌而言,菌株內(nèi)T6P合成酶的過表達(dá)可以增強(qiáng)共生植物抗干旱脅迫能力[26]。本研究植物根系分泌物中的T6P含量與CLA178的趨化性、生物膜形成和根際定殖正相關(guān)。有研究表明DOP對(duì)細(xì)菌有一定的抑菌作用[27-28],本研究中DOP對(duì)CLA178生物膜形成有抑制效果,且10～100 μmol·L-1DOP對(duì)CLA178生長(zhǎng)有顯著抑制作用。此外,生物膜形成相關(guān)基因的定量PCR結(jié)果顯示,20 μmol·L-1DOP對(duì)生物膜形成相關(guān)基因epsD、yqxM和kinC顯著上調(diào),這說明DOP對(duì)CLA178生物膜的抑制作用可能是由于其抑制菌株生長(zhǎng)引起的。

植物根際是一個(gè)復(fù)雜的環(huán)境,植物可以發(fā)出“求救”信號(hào)來“招募”益生菌來排斥土傳病原菌,從而營(yíng)造一個(gè)相對(duì)健康的微生物群落環(huán)境,“招募”而來的益生菌可以進(jìn)一步促進(jìn)植物生長(zhǎng),協(xié)助植物抗病等[29]。這個(gè)理論對(duì)病原菌的防控有指導(dǎo)意義,然而植物-微生物之間互作的具體信號(hào)機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。