梁榮,宋海鑫,黃佳玲,費(fèi)榮梅,張金秋

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,江蘇 南京 210095;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫工程研究所,江蘇 南京 210014;3.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 揚(yáng)州 225009)

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea,PED)是一種嚴(yán)重危害豬群的病毒性傳染病,自發(fā)生起就一直困擾著全球畜牧業(yè)。其主要發(fā)病特征有嘔吐、水樣腹瀉、嚴(yán)重脫水和體重減輕等[1],對(duì)仔豬的致死率高達(dá)80%以上。該病主要由帶毒豬及其糞便經(jīng)糞-口途徑傳播,呈現(xiàn)明顯的季節(jié)性,冬春季流行爆發(fā),夏秋季呈散在發(fā)生。近年來(lái),PED的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。流行病學(xué)分析表明,豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是引起該病的主要病原。尤其2010年以來(lái),隨著PEDV新變異株的出現(xiàn),PED再次在美洲、歐洲及亞洲的多個(gè)國(guó)家爆發(fā),給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。

病毒感染機(jī)體后,除應(yīng)對(duì)宿主機(jī)體免疫外,還參與多種細(xì)胞活動(dòng),如影響細(xì)胞周期或?qū)е录?xì)胞凋亡等,為自身增殖和擴(kuò)散創(chuàng)造條件。病毒感染與細(xì)胞凋亡之間存在著密切聯(lián)系,細(xì)胞凋亡對(duì)于病毒和宿主都有重要的意義。病毒通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以便子代病毒粒子向周圍細(xì)胞擴(kuò)散,加速病毒的增殖、傳播;而宿主通過(guò)細(xì)胞凋亡響應(yīng)病毒感染,減弱病毒的復(fù)制,保護(hù)機(jī)體免受進(jìn)一步的損害。因此,研究病毒誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制對(duì)于研究病毒致病機(jī)制具有重要的指導(dǎo)意義。PEDV是一種冠狀病毒,研究發(fā)現(xiàn)多種冠狀病毒可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。如α冠狀病毒屬的豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)可以誘導(dǎo)豬腎細(xì)胞(PK-15)凋亡并引起細(xì)胞周期阻滯[3];β冠狀病毒屬的嚴(yán)重急性呼吸綜合征病毒(SARS-CoV)、中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)等在感染Vero細(xì)胞后,可檢測(cè)到染色體DNA的斷裂片段、Bcl-2表達(dá)下調(diào)、Bax表達(dá)升高及Caspase-3被激活等凋亡信號(hào)[4-6];γ冠狀病毒屬的傳染性支氣管炎病毒(IBV)可以誘導(dǎo)雞的巨噬細(xì)胞(HD11)凋亡并引起周期阻滯[7-8];δ冠狀病毒屬的豬δ冠狀病毒通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)豬睪丸細(xì)胞(ST)凋亡[9]。盡管也有研究表明PEDV可以誘導(dǎo)Vero細(xì)胞凋亡,但研究多針對(duì)疫苗株CV777[10-12],尚缺乏對(duì)PEDV流行毒株引起細(xì)胞凋亡機(jī)制的分析。本試驗(yàn)采用流式細(xì)胞術(shù)、Hoechst染色等,并結(jié)合Western blot和細(xì)胞活性分析,探索PEDV流行毒株JS2013誘導(dǎo)Vero細(xì)胞凋亡的機(jī)制,為進(jìn)一步研究PEDV流行毒株的致病機(jī)制提供理論依據(jù),并為后期的疫苗研究、藥物開(kāi)發(fā)及PED的綜合防控等提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

PEDV流行毒株JS2013由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心分離、鑒定、保存。Vero細(xì)胞由本課題組保存。2.5 g·L-1胰酶、Accutase細(xì)胞消化液、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購(gòu)自Gibco公司;FITC Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BD公司;DAPI染液、細(xì)胞凋亡-Hoechst染色試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司;CCK-8試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué);RIPA裂解液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;PAGE凝膠快速制備試劑盒購(gòu)自上海雅酶生物技術(shù)有限公司;Caspase 3、Caspase 9單抗購(gòu)自CST公司;Caspase 8單抗購(gòu)自Santa Cruz公司;GAPDH單抗購(gòu)自杭州賢至生物科技有限公司;辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG和FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG購(gòu)于Proteintech公司;ECL試劑盒購(gòu)自上海天能科技有限公司;PEDV-N蛋白單抗由本課題組制備;T-25 細(xì)胞瓶、細(xì)胞培養(yǎng)板均購(gòu)自Corning公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 PEDV擴(kuò)增胰酶濃度的篩選Vero細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),待細(xì)胞密度長(zhǎng)至80%～90%時(shí),用PBS清洗細(xì)胞2次,換含有1～10 μg·mL-1不同胰酶濃度的維持液繼續(xù)培養(yǎng)72 h,觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài),確定72 h內(nèi)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響最小的最高胰酶濃度為擴(kuò)增PEDV JS2013的最適胰酶濃度。

1.2.2 PEDV的增殖從-80 ℃冰箱取出PEDV病毒原液,靜置至室溫,將生長(zhǎng)良好的Vero細(xì)胞棄掉培養(yǎng)基,PBS清洗后,用混合有5 μg·mL-1胰酶的PEDV感作細(xì)胞1 h,棄去培養(yǎng)液,換為含有5 μg·mL-1胰酶的DMEM維持液繼續(xù)培養(yǎng),待細(xì)胞出現(xiàn)90%以上病變時(shí),收集細(xì)胞及上清液,于-80 ℃反復(fù)凍融3次,4 ℃、12 000 r·min-1離心5 min,取病毒上清液,小量分裝后置于-80 ℃?zhèn)溆?并按照Reed-Muench法測(cè)定病毒TCID50。

1.2.3 間接免疫熒光(IFA)觀察PEDV感染在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中放入滅菌的細(xì)胞爬片,接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Vero細(xì)胞,當(dāng)細(xì)胞密度長(zhǎng)至80%時(shí),以感染復(fù)數(shù)(MOI)為0.1的PEDV感染Vero細(xì)胞,分別于接毒后6、12、24、36和48 h,利用冷甲醇固定細(xì)胞,以抗PEDV-N蛋白單抗為一抗,FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG為二抗,用DAPI染液對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色,夾出細(xì)胞爬片,用濾紙吸干殘余洗液,輕輕置于含5 μL抗熒光淬滅劑的載玻片上,4 ℃靜置,利用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行拍照。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PEDV誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡細(xì)胞經(jīng)Accutase酶消化后,用PBS洗滌,用1×Binding Buffer調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106mL-1,轉(zhuǎn)移100 μL至流式管中,加入5 μL FITC Annexin V,避光孵育15 min后,再加入5 μL碘化丙啶(PI),避光孵育5 min。同時(shí)設(shè)立FITC Annexin V和PI單染組對(duì)照。用400 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞,1 h內(nèi)使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 Hoechst染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Vero細(xì)胞接種24孔細(xì)胞板,細(xì)胞密度為80%時(shí),以MOI=0.1的PEDV JS2013感染Vero細(xì)胞,感染48 h后,棄培養(yǎng)基,PBS清洗細(xì)胞2次,加入固定液固定細(xì)胞15 min后,PBS清洗3次,加入Hoechst 33258染色液,5 min后PBS清洗,于熒光顯微鏡下拍照。

1.2.6 PEDV JS2013對(duì)細(xì)胞活性檢測(cè)的影響將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Vero細(xì)胞接種96孔板,當(dāng)細(xì)胞密度為80%時(shí),以MOI=0.1的PEDV感染細(xì)胞36 h后,每孔加入10 μL CCK-8試劑,繼續(xù)孵育1～4 h,用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光值(A450)。檢測(cè)每個(gè)細(xì)胞孔的A450值,減去本底(基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入CCK-8試劑,無(wú)細(xì)胞)A450值。按如下公式計(jì)算細(xì)胞存活率:細(xì)胞存活率=A450(試驗(yàn)組)/A450(對(duì)照組)×100%。

1.2.7 Western blot 檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)蛋白樣品經(jīng)BCA法測(cè)定濃度后,煮沸10 min使其變性,進(jìn)行SDS-PAGE電泳,電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移至PVDF膜,用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,加入一抗(Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9和GAPDH)后4 ℃孵育過(guò)夜,TBST洗膜3次后加入二抗(羊抗兔抗體、羊抗鼠抗體),37 ℃孵育 1 h,用TBST洗膜后加ECL試劑顯影并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

使用GraphPad Prism 7.0軟件繪制柱狀圖;對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行One-way ANOVA方差分析和差異顯著性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 適宜PEDV JS2013擴(kuò)增的胰酶濃度

如圖1所示:用含有1～10 μg·mL-1胰酶的維持液培養(yǎng)Vero細(xì)胞72 h,每組設(shè)置3個(gè)重復(fù),每隔12 h觀察細(xì)胞狀態(tài)。當(dāng)胰酶濃度為6 μg·mL-1及以上時(shí),細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)不同程度的損傷,出現(xiàn)拉網(wǎng)、脫落的現(xiàn)象,而5 μg·mL-1以下的濃度則對(duì)細(xì)胞基本無(wú)損害,并能有效促進(jìn)PEDV JS2013在Vero細(xì)胞上增殖,故選擇 5 μg·mL-1胰酶作為PEDV JS2013體外擴(kuò)增的維持液濃度。

圖1 不同胰酶濃度對(duì)Vero細(xì)胞形態(tài)的影響(×100)Fig.1 Effects of different trypsin concentrations on Vero cell morphology

2.2 PEDV JS2013感染Vero細(xì)胞后的病變觀察

如圖2所示:PEDV JS2013感染Vero細(xì)胞后,24 h出現(xiàn)細(xì)胞病變(CPE),可觀察到多個(gè)細(xì)胞融合,形成典型的合胞體現(xiàn)象。感染36 h,CPE更為明顯,細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)空泡;感染48 h,約有90%以上細(xì)胞出現(xiàn)典型CPE,空泡化進(jìn)一步加劇,且形成合胞體的部分細(xì)胞開(kāi)始成片脫落。

2.3 間接免疫熒光(IFA)確定PEDV JS2013感染情況

通過(guò)間接免疫熒光試驗(yàn)進(jìn)一步觀察PEDV JS2013在Vero細(xì)胞的增殖情況。如圖3所示,與對(duì)照細(xì)胞相比,接種PEDV JS2013后6～12 h,有小部分病毒成功感染Vero細(xì)胞;接毒24～36 h后,病毒感染程度更加廣泛;48 h后,約90%的細(xì)胞被感染。

2.4 Hoechst染色檢測(cè)凋亡小體的形成

用Hoechst 33258對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色,在熒光顯微鏡下,對(duì)照組細(xì)胞核呈現(xiàn)正常的藍(lán)色,而被PEDV JS2013感染的細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡細(xì)胞的典型特征,即細(xì)胞核致密濃染,顏色有些發(fā)白,并且可見(jiàn)明顯的凋亡小體(圖4)。

圖4 PEDV JS2013感染對(duì)Vero細(xì)胞核形態(tài)的影響Fig.4 Effects of PEDV JS2013 infection on the nuclear morphology of Vero cells紅色箭頭表示凋亡小體。The red arrows represent apoptotic bodies.

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PEDV JS2013對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

以不同MOI值的PEDV JS2013感染Vero細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。由圖5可見(jiàn):與對(duì)照細(xì)胞相比,細(xì)胞感染PEDV后,凋亡細(xì)胞比例顯著升高,且細(xì)胞凋亡率隨接毒劑量的增加而增加,呈劑量依賴性。

圖5 感染不同感染復(fù)數(shù)PEDV JS2013后Vero細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)Fig.5 The apoptotic rate of Vero cells measured after infected with different multiplicity of infection(MOI)PEDV JS2013A. 流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡程度Flow cytometry to detect the apoptotic rate;B. 不同劑量JS2013導(dǎo)致細(xì)胞凋亡率柱狀圖Histogram of apoptotic rate in different dose of JS2013.Annexin V陽(yáng)性,PI陰性代表早期凋亡細(xì)胞,Annexin V和PI雙陽(yáng)性代表晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。 **P<0.01。下同。Annexin V positive and PI negative represented early apoptotic cells,while Annexin V and PI double positive represented late apoptotic and necrotic cells. **P<0.01. The same as follows.

2.6 PEDV JS2013感染對(duì)細(xì)胞活性的影響

以MOI=0.1的PEDV JS2013感染Vero細(xì)胞,用CCK-8試劑盒檢測(cè)病毒對(duì)細(xì)胞活性的影響。結(jié)果如圖6所示:JS2013感染后36 h,Vero細(xì)胞活性下降約40%,與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01),表明PEDV JS2013顯著抑制Vero細(xì)胞生長(zhǎng),這與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的凋亡結(jié)果一致。

圖6 PEDV JS2013感染36 h對(duì)Vero 細(xì)胞活性的影響Fig.6 Effect of PEDV JS2013 infection for 36 h on Vero cell viability

2.7 PEDV JS2013感染對(duì)Caspase通路的影響

Caspase的激活是凋亡過(guò)程中必不可少的,為研究PEDV JS2013誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是否激活Caspase通路,對(duì)病毒感染細(xì)胞后不同時(shí)間的Caspase相關(guān)蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)分析。結(jié)果(圖7)顯示:感染后48 h,可檢測(cè)到激活的Caspase 8和Caspase 9,其活化片段相對(duì)分子質(zhì)量分別為18×103和35×103;感染 60 h 后,在相對(duì)分子質(zhì)量約17×103處檢測(cè)到Caspase 3的活化片段,表明PEDV JS2013誘導(dǎo)Vero細(xì)胞凋亡激活Caspase通路。

圖7 PEDV JS2013感染對(duì)Caspase通路的影響Fig.7 Effect of PEDV JS2013 infection on Caspase pathway

3 討論

PEDV的體外培養(yǎng)比較困難,研究人員先后采用豬睪丸細(xì)胞(ST)、豬腎細(xì)胞(PK-15)等進(jìn)行體外增殖,但均未成功。直至1988年,在培養(yǎng)基中添加胰酶后,在Vero細(xì)胞上成功實(shí)現(xiàn)了PEDV的增殖,僅第1代就觀察到病變,由此認(rèn)為胰酶是PEDV進(jìn)入Vero細(xì)胞所必需的條件[13],并在后續(xù)試驗(yàn)中得到驗(yàn)證[14]。由于胰酶可能會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一定的損傷作用,本研究首先篩選體外培養(yǎng)時(shí)適宜的胰酶濃度,選取5 μg·mL-1作為增殖PEDV流行毒株JS2013的合適胰酶濃度。接種病毒后發(fā)現(xiàn),PEDV JS2013株可以造成Vero細(xì)胞合胞體病變,且隨感染時(shí)間的延長(zhǎng),病變范圍逐漸擴(kuò)大。間接免疫熒光試驗(yàn)也表明PEDV JS2013可以成功感染 Vero 細(xì)胞,且隨接毒時(shí)間延長(zhǎng),感染程度更加廣泛。表明該流行毒株能在Vero細(xì)胞有效增殖。

細(xì)胞凋亡又稱為程序性細(xì)胞死亡,是細(xì)胞在基因調(diào)控下發(fā)生的主動(dòng)程序性死亡過(guò)程,是機(jī)體維持自身穩(wěn)定和平衡的一種重要機(jī)制。細(xì)胞凋亡的典型特征包括細(xì)胞膜破裂、細(xì)胞皺縮、染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂以及出現(xiàn)凋亡小體等[15]。本研究Hoechst染色結(jié)果表明,PEDV感染可引起Vero細(xì)胞皺縮及細(xì)胞核致密濃染,并可觀察到明顯的凋亡小體。

此外,當(dāng)細(xì)胞發(fā)生早期凋亡時(shí),細(xì)胞膜內(nèi)表面的磷脂酰絲氨酸(PS)外翻,暴露于細(xì)胞膜外表,這是細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的生化特征之一。Annexin V是一種Ca2+依賴性的磷脂結(jié)合蛋白,對(duì)PS有很高的親和力,能與暴露出PS的細(xì)胞結(jié)合,而碘化丙啶(PI)能透過(guò)凋亡晚期和壞死細(xì)胞的膜而與細(xì)胞核結(jié)合呈紅色,因此將Annexin V和PI結(jié)合使用,可以將凋亡細(xì)胞與壞死細(xì)胞區(qū)分,也是目前一種比較成熟的凋亡細(xì)胞檢測(cè)方法。本試驗(yàn)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),PEDV JS2013感染后,Vero細(xì)胞凋亡比例顯著升高,且凋亡率與接毒劑量呈正相關(guān)。進(jìn)一步通過(guò)CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性,發(fā)現(xiàn)病毒感染后顯著抑制Vero細(xì)胞活性,與流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果一致。

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶Caspase家族是凋亡過(guò)程中的效應(yīng)蛋白。正常情況下,Caspase以無(wú)活性的酶原(Pro-Caspase)形式存在,但當(dāng)發(fā)生凋亡時(shí),Caspases 分子內(nèi)天冬氨酸殘基后的肽鍵斷裂,游離的大、小亞基結(jié)合成活化酶(Cleaved-Caspase)。其中Caspase 9介導(dǎo)內(nèi)部線粒體通路,Caspase 8介導(dǎo)死亡受體通路,最終二者均激活效應(yīng)凋亡蛋白酶Caspase 3,引發(fā)凋亡過(guò)程的級(jí)聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[16-17]。目前,TGEV、SARS、IBV、PDCoV、SADS-CoV等病毒已被證實(shí)在其誘導(dǎo)凋亡過(guò)程中激活Caspase[3-5,7,9,18-19]。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)Vero細(xì)胞感染PEDV JS2013后不同時(shí)間Caspase蛋白的檢測(cè),發(fā)現(xiàn)感染后48 h,Caspase 8和Caspase 9被切割而激活,感染后60 h,Caspase 3被切割而具有活性,這表明Caspase在PEDV JS2013誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程中被激活,病毒可能通過(guò)Caspase途徑介導(dǎo)凋亡,這也與之前的研究結(jié)果一致[11]。但也有研究表明PEDV誘導(dǎo)凋亡可以不依賴Caspase途徑,而是通過(guò)活化線粒體凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)途徑[20-21],這是否與病毒株的特性有關(guān)尚需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

總之,本試驗(yàn)證實(shí)PEDV流行株JS2013感染Vero細(xì)胞后能夠激活一系列Caspase級(jí)聯(lián)信號(hào),最終誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。然而,病毒感染與細(xì)胞凋亡的關(guān)系非常復(fù)雜,如一些病毒既能在感染早期抑制細(xì)胞凋亡,避免細(xì)胞被過(guò)早瓦解而影響病毒自身復(fù)制,同時(shí)也能在感染中后期誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,以便于釋放子代病毒粒子。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PEDV JS2013流行毒株在感染后期誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,有利于病毒在細(xì)胞內(nèi)完成復(fù)制和生活周期,加速子代病毒顆粒的釋放,更有利于病毒增殖。關(guān)于PEDV及其編碼蛋白究竟如何調(diào)控凋亡分子及相關(guān)凋亡通路,將是下一步的研究重點(diǎn)。同時(shí),由于冠狀病毒獨(dú)特的復(fù)制機(jī)制,其通常具有高頻的變異性,能夠不斷適應(yīng)新宿主、新環(huán)境,不斷進(jìn)化。因此,研究流行病毒誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制,對(duì)于研究病毒的致病機(jī)制具有重要的指導(dǎo)意義。