余奉徽 王思霽 代佳秋 歐陽(yáng)曦 袁慧軍 耿佳 盧宇# 康厚墉#

作者單位：1 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 重慶 400010

2 陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳中心 重慶 400038

3 四川大學(xué)華西醫(yī)院罕見(jiàn)病研究院 成都 610041

耳聾作為世界上高發(fā)的、嚴(yán)重致殘的疾病之一，給社會(huì)和家庭帶來(lái)了經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)，其中約60%先天性耳聾與遺傳因素相關(guān)。隨著二代測(cè)序技術(shù)(next generation sequencing，NGS)在耳聾研究中的應(yīng)用推廣，耳聾基因的發(fā)現(xiàn)及變異檢出發(fā)生了質(zhì)的飛躍[1]。迄今為止，遺傳性耳聾網(wǎng)站（http：//hereditary hearingloss.org）已收錄超過(guò)130個(gè)與耳聾相關(guān)的致病基因。其中WFS1基因在基因型及臨床表型上具有高度異質(zhì)性。目前已檢測(cè)出超過(guò)200種發(fā)生于該基因的致病突變，雖然突變位點(diǎn)主要集中在8號(hào)外顯子，但不同位點(diǎn)突變表現(xiàn)出不同臨床表型，如Wolfram綜合征、Wolfram樣綜合征、非綜合征型感音神經(jīng)性耳聾、單純非胰島素依賴型糖尿病等疾病。即使同一突變?cè)诓煌巳?、不同年齡段都可表現(xiàn)出不同的疾病特點(diǎn)[2]。上述復(fù)雜的基因型-表型相關(guān)性對(duì)于該基因的檢測(cè)及診斷造成了一定困難和干擾。本文利用二代測(cè)序技術(shù)在一個(gè)遺傳性耳聾家系中發(fā)現(xiàn)WFS1基因c.2051C＞T（p.A684V）雜合突變，并對(duì)該位點(diǎn)的遺傳特性、臨床表型及族群分布特征等進(jìn)行總結(jié)分析，以利于學(xué)者對(duì)該位點(diǎn)突變致病機(jī)理的探索及臨床診療。

1 資料與方法

1.1 家系資料

該家系來(lái)自四川省，編號(hào)CQ10011，由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻喉科采集。采樣小組對(duì)先證者及其親屬成員進(jìn)行了問(wèn)卷調(diào)查（包括現(xiàn)病史、既往史、母親孕期情況及用藥史、外傷史等）、聽(tīng)力學(xué)檢查、體格檢查及顳骨CT檢查等。采集各家系成員外周血5 ml，提取基因組DNA[天根生化科技有限公司（北京）]于-80℃凍存?zhèn)溆?。參與研究的家系成員均簽署知情同意書(shū)，并通過(guò)重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)認(rèn)可。

1.2 測(cè)序及變異位點(diǎn)致病性分析流程

使用定制的耳聾基因目標(biāo)區(qū)域捕獲試劑盒（Agilent）進(jìn)行檢測(cè)，該試劑盒覆蓋目前已知耳聾基因158個(gè)。制備先證者DNA文庫(kù)后，對(duì)158個(gè)耳聾相關(guān)基因全外顯子和相鄰內(nèi)含子（±50 bp）區(qū)域進(jìn)行捕獲和富集，使用高通量測(cè)序平臺(tái)（Illumina Hiseq X10）進(jìn)行上機(jī)測(cè)序，以GRCh37/hg19為參考序列，測(cè)序下機(jī)數(shù)據(jù)應(yīng)用BWA軟件進(jìn)行原始讀長(zhǎng)定位，Picard工具進(jìn)行質(zhì)控和去重操作，使用GATK和VEP工具進(jìn)行變異識(shí)別和注釋，最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）按0.5%進(jìn)行變異過(guò)濾，結(jié)合先證者及其家系成員的臨床表型和遺傳方式篩查潛在的致病變異，并檢索相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)(HGMD、Clinvar、DVD等)，參考HL-EP2018版本ACMG遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南對(duì)變異位點(diǎn)進(jìn)行致病性判定。

圖1 a CQ10011家系圖，黑色代表耳聾患者，箭頭所示為先證者；b Ⅲ-1、Ⅱ-2為純音聽(tīng)閾圖，Ⅲ-2 、Ⅲ-3為ASSR反應(yīng)閾圖；紅色代表右耳，藍(lán)色代表左耳。

圖2 Sanger測(cè)序圖譜

1.3 Sanger測(cè)序驗(yàn)證

針對(duì)檢出的WFS1基因突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)驗(yàn)證引物，對(duì)已采集樣本的家系成員進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序數(shù)據(jù)通過(guò)Mutation-Surveyor軟件進(jìn)行序列比對(duì)，分析檢出變異是否符合家系內(nèi)聽(tīng)力表型和基因型共分離。

2 結(jié)果

2.1 家系資料及聽(tīng)力學(xué)特征

CQ10011家系為彝族，共追溯回訪3代、7人，除Ⅰ-1、Ⅰ-2外，其余人員均行基因檢測(cè)，其中耳聾患者4人、均表現(xiàn)為先天性耳聾。根據(jù)世界衛(wèi)生組織1997年耳聾分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，先證者Ⅲ-1（8歲）及Ⅱ-2（41歲）純音聽(tīng)閾檢測(cè)結(jié)果提示雙耳極重度感音神經(jīng)性聾，Ⅲ-2（5歲）、Ⅲ-3（2歲）患者ABR及ASSR檢測(cè)結(jié)果提示雙耳極重度感音神經(jīng)性聾。Ⅲ-1、Ⅲ-2、Ⅲ-3行顳骨CT檢查未見(jiàn)明顯結(jié)構(gòu)異常。上述耳聾患者否認(rèn)耳鳴、眩暈、視物模糊、繁渴、多飲、多尿及體重下降等不適，否認(rèn)外傷、耳毒性藥物及噪音接觸史，否認(rèn)近親婚育史及母親孕期特殊疾病史；耳科、眼科?？撇轶w及系統(tǒng)體格檢查未見(jiàn)明顯外觀異常（圖1）。

2.2 高通量測(cè)序及結(jié)果分析

對(duì)先證者進(jìn)行靶向捕獲高通量測(cè)序，平均測(cè)序深度126×，10×以上覆蓋度96%。下機(jī)數(shù)據(jù)通過(guò)質(zhì)控和去重后，使用GATK和VEP進(jìn)行變異識(shí)別和注釋。以MAF值＜0.5%進(jìn)行變異位點(diǎn)過(guò)濾，根據(jù)聽(tīng)力表型、VEP Impact注釋得分等條件進(jìn)行篩選，在已知耳聾基因中檢出WFS1基因NM_006005.3：c.2051C＞T（p.A684V）雜合突變，為已報(bào)道的致病突變。

2.3 sanger測(cè)序驗(yàn)證及基因型-表型共分離分析

先證者Ⅲ-1及其弟弟Ⅲ-2、妹妹Ⅲ-3均攜帶WFS1基因c.2051C＞T（p.A684V）雜合突變；先證者父親為野生型，母親攜帶c.2051C＞T雜合突變。先證者Ⅲ-1及其弟弟Ⅲ-2、妹妹Ⅲ-3的基因突變來(lái)源于母親，符合家系內(nèi)表型和基因型共分離，符合常染色體顯性遺傳(圖1、圖2)。

3 討論

本研究中，筆者檢出WFS1基因c.2051C＞T（p.A684V）雜合突變，該突變?cè)谡Ｈ巳褐泻币?jiàn)，為目前已報(bào)道的耳聾致病基因，先證者臨床表型與WFS1基因致病的臨床表型相符合，家系內(nèi)表型和基因型共分離。根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(the American college of medical genetics and genomics，ACMG)遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南分析，明確該突變?yōu)樵摷蚁抵虏⊥蛔儭?/p>

WFS1基因位于染色體4p16.1，由8個(gè)外顯子組成，基因組DNA跨度為33.4 kb，其中1號(hào)外顯子不編碼。該基因編碼的wolframin蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在細(xì)胞膜運(yùn)輸、分泌、加工或調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+穩(wěn)態(tài)方面具有重要生理功能[3]。WFS1基因在基因型及臨床表型上具有高度異質(zhì)性。目前已知WFS1基因突變可致非綜合征型顯性遺傳耳聾，主要以遲發(fā)性低頻下降為主；還可致非綜合征型隱性遺傳耳聾，主要以先天性極重度感音神經(jīng)性聾為主，另外可致Wolfram綜合征、Wolfram樣綜合征、單純非胰島素依賴型糖尿病等疾病。Heredia等[2，4]回顧性分析了1998～2013年發(fā)表的由WFS1基因突變致Wolfram綜合征患者的臨床表型及遺傳數(shù)據(jù)，總結(jié)該綜合征的耳聾主要表現(xiàn)為語(yǔ)后漸進(jìn)性感音神經(jīng)性聾，發(fā)病年齡中位數(shù)為12.5歲(5～39歲)；其他主要癥狀還包括糖尿病、視神經(jīng)萎縮、尿崩癥及神經(jīng)、精神疾病等。

2001年意大利Tessa等[5]首次報(bào)道WFS1基因c.2051C＞T（p.A684V）突變致兒童期Wolfram綜合征，隨后不同地區(qū)的多位學(xué)者相繼報(bào)道該位點(diǎn)突變致非綜合征型耳聾等不同臨床表型[6～11]。筆者結(jié)合本研究病例對(duì)該位點(diǎn)已報(bào)道的文獻(xiàn)進(jìn)行分析總結(jié)，其主要致病特點(diǎn)總結(jié)見(jiàn)表1。

表1可知，除20號(hào)病例表現(xiàn)出Wolfram綜合征典型癥狀外，其余患者均以感音神經(jīng)性聾為首發(fā)癥狀，且發(fā)病年齡均小于3歲，表現(xiàn)為語(yǔ)前聾、全頻受損、受損程度為重度至極重度，需要及時(shí)的聽(tīng)力檢查及干預(yù)措施。第2個(gè)出現(xiàn)的癥狀為視神經(jīng)萎縮，發(fā)病年齡中位數(shù)為12歲(3～41歲)，這與典型的Wolfram綜合征患者視神經(jīng)萎縮的發(fā)病年齡基本吻合[4]。另有少部分病例表現(xiàn)出尿崩癥及精神神經(jīng)系統(tǒng)癥狀；除20號(hào)病例外，均未發(fā)現(xiàn)糖尿病相關(guān)癥狀。

同時(shí)筆者觀察到一個(gè)有趣的現(xiàn)象，在現(xiàn)有病例中，中國(guó)、日本等東亞地區(qū)的病例僅表現(xiàn)為非綜合征型感音神經(jīng)性聾，未觀察到糖尿病、視神經(jīng)萎縮及尿崩癥等相關(guān)病變，而歐美地區(qū)病例以Wolfram樣綜合征為主。這提示筆者可能不同人群遺傳背景或地理環(huán)境因素對(duì)該致病位點(diǎn)的致病性有重要影響因素，這對(duì)該基因致病機(jī)理的闡明有重要啟示作用。在本家系及其余中國(guó)和日本病例中，除1號(hào)及9號(hào)病例外，其余病例報(bào)道時(shí)年齡均較小、未達(dá)到視神經(jīng)萎縮發(fā)病年齡中位數(shù)，是否出現(xiàn)視神經(jīng)萎縮及糖尿病等其它癥狀仍需繼續(xù)觀察，這也提示對(duì)于該類病例進(jìn)行視神經(jīng)萎縮的相關(guān)眼科檢查和糖尿病的相關(guān)內(nèi)分泌科檢查及隨訪的必要性。

Guan等[10]對(duì)中國(guó)128個(gè)非血緣關(guān)系的非綜合征型感音神經(jīng)性耳聾散發(fā)性病例進(jìn)行基因篩查，發(fā)現(xiàn)5例WFS1基因突變致耳聾，其中c.2051C＞T (p.A684V)4例、c.2590G＞A (p.E864K)1例，從而推測(cè)c.2051C＞T可能為中國(guó)人群的熱點(diǎn)突變。本研究與該突變位點(diǎn)及臨床表型吻合，進(jìn)一步支持該推測(cè)的可能性。同時(shí)也觀察到在這20例病例中至少有8例為新發(fā)突變，從而推測(cè)在本研究中先證者母親可能也是新發(fā)突變，因此其父母都沒(méi)有耳聾表型。

表1 20 例WFS1 基因c.2015c＞T 突變病例特征總結(jié)

綜上所述，筆者通過(guò)二代測(cè)序技術(shù)鑒定出WFS1基因c.2051C＞T（p.A684V）雜合突變?yōu)樵摷蚁刀@致病基因，且該結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了c.2051C＞T突變可能為WFS1基因在中國(guó)人群中的熱點(diǎn)突變，該致病突變?cè)谥袊?guó)人群中主要臨床表型為語(yǔ)前非綜合征型感音神經(jīng)性聾。不排除將來(lái)表現(xiàn)為綜合征的可能性，應(yīng)當(dāng)注意隨訪其他系統(tǒng)的表型。