李再巧，王沙凝，吳 沖，田 迪，葉桂芝，宋 羚，桂明英，馬 嘯,*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)龍潤(rùn)普洱茶學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南省高原特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)研究院，云南 昆明 650201)

【研究意義】 隨著生活水平的不斷提高，人們?cè)絹?lái)越重視各種原因引起的皮膚問(wèn)題，如：皮膚老化、炎癥、癌變等[1]。當(dāng)人體自身?yè)碛杏糜诘钟趸瘬p傷的系統(tǒng)不足以抵御氧化損傷時(shí)，則需進(jìn)行外界干預(yù)，那么更天然、更安全的抗氧化劑和抗衰老藥物就成為人們迫切需要的物質(zhì)[2]。如暴露于微小顆粒物(PM 2.5)、紫外線、灰塵等環(huán)境中都能引起皮膚老化從而引發(fā)一系列的皮膚問(wèn)題：皺紋、異常色素沉著和皮膚干燥等，產(chǎn)生這些的原因是由于細(xì)胞過(guò)度暴露于活性氧(reactive oxygen species, ROS)等之類的自由基所引起的，也就是ROS的形成與自身抗氧化防御能力之間出現(xiàn)不平衡導(dǎo)致的結(jié)果[3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】已有研究表明多酚類物質(zhì)能夠抗氧化、抗炎和抗菌，同時(shí)對(duì)傷口愈合起作用。柚皮素屬于二氫黃酮類化合物，以柚子等柑橘類水果中含量較豐富，也是一種天然抗氧化劑[4]。在菝葜、化紅、枳實(shí)、桃葉等天然植物中也含有該類物質(zhì)，具有和多酚類物質(zhì)相似的功效：抗病毒、抗菌、抗炎、抗腫瘤清除自由基及抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、抗衰老[5]等多種活性。因其抗氧化和抗炎作用可以對(duì)肝臟起到很好的保護(hù)作用[6]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】與其他抗氧化劑相比，柚皮素有更強(qiáng)的效力和良好的作用，從而在生活中顯示出很大的等待發(fā)掘利用的潛在價(jià)值?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】研究柚皮素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞氧化損傷的作用，為柚皮素在皮膚保護(hù)方面的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞，中國(guó)科學(xué)院昆明細(xì)胞庫(kù)；培養(yǎng)基，Hyclone公司；胎牛血清，Gibco公司；青鏈霉素，碧云天公司；CO2培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；超凈工作臺(tái)，蘇州凈化公司；低溫高速離心機(jī)，Eppendorf公司；電泳儀，北京六一生物科技有限公司；低速離心機(jī)，上海盧湘離心儀器有限公司；酶標(biāo)儀，Molecular Devices公司；曝光機(jī)，北京科創(chuàng)銳新生物科技有限公司；倒置顯微鏡，上海蔡康光學(xué)儀器有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)器，count star公司；一抗SOD2、CDK2，成都正能生物技術(shù)有限責(zé)任公司；DMSO、柚皮素和氧化試劑盒，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HaCaT細(xì)胞復(fù)蘇后，用含有10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 U·mL-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基在5% CO2培養(yǎng)箱 (37 ℃，相對(duì)濕度95%)中培養(yǎng)，2～3 d傳代1次，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用胰酶消化后再用培養(yǎng)基稀釋制成細(xì)胞密度為1×106細(xì)胞混合液，接種在60 mm培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)3～4 d后進(jìn)行給藥處理。

1.2.2 構(gòu)建細(xì)胞氧化損傷模型[7]首先將H2O2稀釋為10 mmol·L-1濃度的母液，之后再用培養(yǎng)基稀釋為100、200、300、400 μmol·L-1幾個(gè)濃度，分別加到已經(jīng)接種細(xì)胞且細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿底部面積80%以上的60 mm培養(yǎng)皿中去處理4 h進(jìn)行造模，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。

1.2.3 MTT[8]活力測(cè)定 用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞, 吸取0.25%胰酶1 mL消化8～10 min, 用培養(yǎng)基將細(xì)胞數(shù)量調(diào)整為5.0×104個(gè) mL-1，每孔以200 μl的細(xì)胞培養(yǎng)基混合液體積接種在96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后吸去上層培養(yǎng)基之后進(jìn)行后續(xù)操作。實(shí)驗(yàn)組及空白對(duì)照組各200 μl，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，在5% CO2(37 ℃，相對(duì)濕度95%) 條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加入MTT (5 ng·mL-1) 16 μl。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)吸去上清液加入160 μl的DMSO 振蕩10 min，充分溶解結(jié)晶物并測(cè)定吸光度(A492值)并計(jì)算分析。

1.2.4 細(xì)胞H&E染色 用胰酶消化下對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞在培養(yǎng)基稀釋后接種在24孔板中，接種密度為每個(gè)孔10 000個(gè)細(xì)胞，在5% CO2(37 ℃，相對(duì)濕度95%) 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d后可以進(jìn)行后續(xù)給藥處理，結(jié)束后用95%乙醇固定20 min后用PBS洗兩次；用蘇木精浸泡4 min除去蘇木精后用水洗3 s，然后用含有1%的乙醇溶液沖洗3 s，水沖洗10 s，氨水沖洗15 s，水沖洗10 s。之后用伊紅染色2 min除去伊紅，用水沖洗2 s，80%乙醇洗2 s，隨后用95%乙洗5 min，100%乙醇洗10 min，然后在空氣中自然干燥后進(jìn)行拍照。

1.2.5 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) 用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，胰酶消化后收集并稀釋后接種在6孔板中，每個(gè)孔中接種細(xì)胞數(shù)為500～1000個(gè)，放入5% CO2(37 ℃, 相對(duì)濕度95%) 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d后棄去培養(yǎng)基，加入含有不同濃度的柚皮素(6.25、12.5、25 μmol·L-1)的培養(yǎng)基處理細(xì)胞2 d后換成正常培養(yǎng)基培養(yǎng)15 d后，用甲醇固定細(xì)胞10 min后0.1%結(jié)晶紫溶液染色15～30 min，回收結(jié)晶紫染液后多洗滌幾次后放在空氣中干燥之后即可拍照。接下來(lái)用10%的冰乙酸對(duì)結(jié)晶紫進(jìn)行溶解在560 nm處測(cè)量吸光值后進(jìn)行計(jì)算分析。

1.2.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 先在6孔板背后做好標(biāo)記(用標(biāo)記筆配合直尺劃線，線與線之間隔0.75 cm，至少劃5條線)為方便后續(xù)劃痕；把消化收集到的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞稀釋后以細(xì)胞密度為5×105每個(gè)孔加到6孔板中，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組做3個(gè)重復(fù)孔，等細(xì)胞在顯微鏡下被觀察到呈單層貼壁生長(zhǎng)時(shí)，用提前消過(guò)毒的200 μl槍頭和直尺并用在6孔板上方垂直劃痕(用力均勻慢速，盡量避免傾斜)；之后用PBS多次清洗盡量洗干凈劃下來(lái)懸浮著的細(xì)胞；接著分別加入不同濃度的柚皮素處理，放入5% CO2(37 ℃, 相對(duì)濕度95%) 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h后置于顯微鏡下拍照。

1.2.7 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 用不同濃度的柚皮素(6.25、12.5、25 μmol·L-1)處理H2O2損傷的HaCaT細(xì)胞4 h后，以100∶1的比例配制混合均勻RIPA裂解液和PMSF用于提取HaCaT細(xì)胞總蛋白，之后用BCA試劑盒對(duì)所提蛋白進(jìn)行濃度測(cè)定并

分裝制成自己實(shí)驗(yàn)需要的蛋白樣品，然后通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳來(lái)把不同分子量的蛋白分離開(kāi)之后用轉(zhuǎn)膜裝置將電泳好的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，再把膜放入含有5%脫脂奶粉的封閉液中在搖床上(室溫下)封閉1 h后回收封閉液，用TBST清洗3次每次5 min后加入一抗放在4 ℃冰箱中的搖床上孵育12 h，回收一抗后用TBST清洗3次每次5 min，加入二抗在搖床上(室溫下)孵育1 h后，用TBST清洗3次每次5 min(具體洗滌次數(shù)和時(shí)間可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整)，最后用曝光機(jī)進(jìn)行拍照顯影，用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.2.8 MDA、SOD 水平檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[9]根據(jù)丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒的說(shuō)明書(shū)步驟逐一進(jìn)行測(cè)定并統(tǒng)計(jì)結(jié)果。上述所有實(shí)驗(yàn)操作重復(fù)3次及以上。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

圖片分析用Image J軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Graphpad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 HaCaT細(xì)胞存活率

2.1.1 H2O2對(duì)HaCaT細(xì)胞存活率的影響 由圖1可見(jiàn)，H2O2100、200 μmol·L-12個(gè)濃度處理與0 μmol·L-1(CK)處理相比，細(xì)胞活力在P<0.01水平差異顯著，300、400 μmol·L-12個(gè)濃度處理與0 μmol·L-1(CK)處理相比，細(xì)胞活力在P<0.001水平差異極顯著，表明隨著H2O2的濃度升高，HaCaT細(xì)胞活力呈下降趨勢(shì)。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇300 μmol·L-1作為H2O2的建模濃度。

2.1.2 柚皮素對(duì)HaCaT細(xì)胞存活率的影響 由圖2可見(jiàn)，與0 μmol·L-1(CK)處理相比，柚皮素50 μmol·L-1濃度處理的細(xì)胞活力在P<0.05水平有差異顯著，柚皮素100、200 μmol·L-12個(gè)濃度處理的細(xì)胞活力在P<0.001水平差異高度顯著。試驗(yàn)表明，隨著柚皮素濃度的升高，HaCaT 細(xì)胞活力呈下降趨勢(shì)。因此選擇柚皮素濃度0～50 μmol·L-1為治療濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞H&E染色

由圖3可見(jiàn)，與0 μmol·L-1(CK，a)處理相比，DMSO(25 μmol·L-1，b)處理對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯損傷作用；H2O2(300 μmol·L-1，c)處理的細(xì)胞形狀明顯發(fā)生變化，邊緣皺縮明顯，細(xì)胞飽滿度不足；柚皮素(6.25 μmol·L-1，d；12.5 μmol·L-1，e；25 μmol·L-1，f)處理能夠顯著治療H2O2損傷的HaCaT細(xì)胞形狀越來(lái)越飽滿，邊緣皺縮逐漸減少，結(jié)果表明柚皮素對(duì)H2O2損傷的HaCaT細(xì)胞有治療作用。

2.3 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)

由圖4可見(jiàn)，與0 μmol·L-1(CK，a)處理相比，H2O2(濃度300 μmol·L-1，b)處理的細(xì)胞數(shù)量在P<0.001水平差異極顯著。與0 μmol·L-1(CK，a)處理相比，用H2O2(濃度300 μmol·L-1)處理后，加柚皮素6.25 μmol·L-1(c)處理的細(xì)胞數(shù)量在P<0.001水平差異極顯著，加柚皮素12.5 μmol·L-1(d)處理的細(xì)胞數(shù)量在P<0.05水平有差異，加柚皮素25 μmol·L-1(e)處理的細(xì)胞數(shù)量在P<0.01水平差異顯著。結(jié)果表明柚皮素可恢復(fù)H2O2損傷HaCaT細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)，且柚皮素的處理濃度在12.5 μmol·L-1時(shí)效果更佳。

2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

由圖5可見(jiàn)，與0 μmol·L-1(CK，b)處理相比，在H2O2(濃度300 μmol·L-1，c)處理后，細(xì)胞劃痕閉合度在P<0.01水平差異顯著。與0 μmol·L-1(CK，b)處理相比，用H2O2(濃度300 μmol·L-1)處理后，加柚皮素6.25 μmol·L-1(d)處理的細(xì)胞劃痕閉合度在P<0.05水平有差異，柚皮素12.5μmol·L-1(e)處理的細(xì)胞劃痕閉合度在P<0.01水平差異顯著，柚皮素25 μmol·L-1(f)處理的細(xì)胞劃痕閉合度在P<0.001水平差異極顯著。說(shuō)明柚皮素在低濃度下能夠加快受氧化損傷HaCaT細(xì)胞快速生長(zhǎng)。柚皮在濃度為6.25 μmol·L-1時(shí)效果更佳。

2.5 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

由圖6可見(jiàn)，與0 μmol·L-1(CK)處理相比，僅用H2O2(濃度300 μmol·L-1)的處理其SOD2、CDK2蛋白表達(dá)量在P<0.05水平有差異；與0 μmol·L-1(CK)處理相比，H2O2(濃度300 μmol·L-1)加柚皮素6.25、12.5、25 μmol·L-13個(gè)處理的SOD2、CDK2蛋白表達(dá)量水平在P<0.05水平無(wú)差異，說(shuō)明柚皮素能通過(guò)調(diào)節(jié)SOD2、CDK2蛋白對(duì)氧化損傷產(chǎn)生作用。

2.6 抗氧化試劑盒檢測(cè)

由圖7可見(jiàn)，與0 μmol·L-1(CK)處理相比，僅用H2O2(濃度300 μmol·L-1)的處理其MDA含量和SOD含量在P<0.001水平差異極顯著；與0 μmol·L-1(CK)處理相比，H2O2(濃度300 μmol·L-1)加柚皮素6.25、12.5、25 μmol·L-13個(gè)處理的MDA含量在P<0.05水平?jīng)]有差異，H2O2(濃度300 μmol·L-1)加柚皮素6.25 μmol·L-1處理的SOD含量在P<0.01水平差異顯著，而H2O2(濃度300 μmol·L-1)加柚皮素12.5、25 μmol·L-12個(gè)處理的SOD含量在P<0.05水平?jīng)]有差異。說(shuō)明柚皮素能夠治療H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷。

3 討 論

本研究用H2O2成功建成HaCaT細(xì)胞衰老模型，這與已有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，在用柚皮素進(jìn)行治療處理的結(jié)果：細(xì)胞活性、形態(tài)、增值能力、抗氧化試劑盒和相關(guān)通路蛋白研究結(jié)果也與前人的研究結(jié)果保持一致。有實(shí)驗(yàn)證明黃酮能對(duì)H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷起到保護(hù)作用[10]，從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看柚皮素確實(shí)能對(duì)氧化損傷起到治療作用；對(duì)氧化損傷的細(xì)胞在治療效果和改善細(xì)胞形態(tài)上的作用較明顯[11]，在對(duì)抗糖尿病和改善肝臟和腎臟功能方面也很有可能起到增強(qiáng)作用[12]；對(duì)成纖維細(xì)胞的增殖產(chǎn)生抑制作用、對(duì)細(xì)胞周期產(chǎn)生阻斷作用，促進(jìn)凋亡，抑制成纖維細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)活性[13]。還可以通過(guò)抑制HaCaT細(xì)胞的凋亡從而保護(hù)皮膚減弱損傷[14]；能夠起到抑制大鼠肺鱗癌的作用[15]；降低皮炎炎癥程度[16]。凹紋胡蜂蜂巢中的黃酮同樣具有抗氧化活性[17]，枸杞多糖[18]，楊梅黃酮[19]，花青素[20]，枸杞多糖[21]等都能對(duì)皮膚起到抗氧化進(jìn)而保護(hù)皮膚的作用。皮膚老化隨著年齡的增長(zhǎng)而發(fā)生，表現(xiàn)為皮膚變薄、細(xì)紋出現(xiàn)、彈性降低等現(xiàn)象[22]。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，低濃度的柚皮素對(duì)皮膚衰老有治療作用。通過(guò)調(diào)節(jié)HaCaT細(xì)胞增殖能夠達(dá)到保護(hù)皮膚的作用[23]。類似的研究也證實(shí)了柚皮素能減緩氧化應(yīng)激反應(yīng)，延長(zhǎng)壽命，延緩衰老相關(guān)疾病的發(fā)展[24]。本實(shí)驗(yàn)只是進(jìn)行了初步的研究，日后將可以進(jìn)一步探討研究柚皮素的其他相關(guān)保護(hù)機(jī)制。

4 結(jié) 論

本研究主要是通過(guò)H2O2來(lái)建造HaCaT細(xì)胞的氧化損傷模型，從而通過(guò)幾種方式來(lái)驗(yàn)證柚皮素對(duì) H2O2造成的細(xì)胞氧化損傷的作用。結(jié)果表明H2O2在一定的濃度下能夠降低HaCaT細(xì)胞的活性和生長(zhǎng)速度并且影響其細(xì)胞形態(tài)，增強(qiáng)細(xì)胞的氧化反應(yīng)，影響HaCaT細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。用具有抗氧化性能的柚皮素治療處理，能夠不同程度的降低氧化損傷，恢復(fù)細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。柚皮素在HaCaT細(xì)胞中展現(xiàn)出初步的抗氧化效果，進(jìn)一步確定柚皮素的抗氧化性能，為柚皮素開(kāi)拓更廣闊的用途提供理論支持。