王春麗，孫驍，周敏，王鳳丹

心力衰竭（心衰），是大部分心血管疾?。–VD）的終末狀態(tài)，其再住院率、致殘率、致死率均較高，給家庭和社會(huì)帶來(lái)極大負(fù)擔(dān)[1,2]。微小RNA-153-3p（miRNA-153-3p）是一種單鏈非編碼內(nèi)源性的小RNA分子，可在基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)行為，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡等[3]。線粒體是細(xì)胞正常生理活動(dòng)的能量來(lái)源，維持細(xì)胞正常的代謝和功能，線粒體損傷后會(huì)造成能量代謝異常、過(guò)度氧化應(yīng)激、線粒體融合分裂失衡、細(xì)胞過(guò)度凋亡等病理改變[4]。報(bào)道指出[5]，損傷的線粒體代謝產(chǎn)物能夠激活腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）進(jìn)而促進(jìn)心衰發(fā)生發(fā)展，線粒體損傷被認(rèn)為是心衰患者心功能異常的關(guān)鍵機(jī)制之一。既往研究發(fā)現(xiàn)[6,7]，miRNA-153-3p與心臟疾病及心肌線粒體損傷關(guān)系密切，但其與心衰關(guān)系的國(guó)內(nèi)報(bào)道較少。因此本研究分析了miRNA-153-3p對(duì)阿霉素性心力衰竭小鼠心肌線粒體損傷的影響，為心力衰竭防治提供新的思路，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇SPF級(jí)雄性且體質(zhì)量160～200 g的SD小鼠30只用于實(shí)驗(yàn)，所有小鼠購(gòu)自東莞瑞健杏澤生物醫(yī)藥有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SYXK（粵）2019-0203。

1.2 分組、造模及處理將30只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、處理組，每組10只。造模方法：尾靜脈注射2 mg/ml的阿霉素溶液（北京雷根生物技術(shù)有限公司，0.5 ml/kg），1/周，連續(xù)注射6周，超聲心動(dòng)圖射血分?jǐn)?shù)（EF）＜60%判定為造模成功[8]。模型組按照上述方法造模，處理組按照上述方法造模成功后腹腔注射100 μl miRNA-153-3p antagomir（百奧邁科生物技術(shù)有限公司，100 nmol/ml，生理鹽水為溶劑），模型組和對(duì)照組腹腔注射等量生理鹽水（上海圻明生物科技有限公司），2/周，干預(yù)1周。造模失敗小鼠及死亡小鼠剔除，并隨機(jī)補(bǔ)足。于造模成功后的第7 d檢測(cè)以下項(xiàng)目。

1.3 評(píng)價(jià)項(xiàng)目①各組小鼠的心肌細(xì)胞線粒體功能：將各組小鼠處死，取心尖部心肌，用線粒體分離試劑盒（北京英文特生物技術(shù)有限公司）分離線粒體。A：線粒體膜電位（MMP）檢測(cè)：制備線粒體懸液，然后將0.5 ml JC-1熒光染色工作液（深圳市博銳德生物科技有限公司，2 μmol/L）加至線粒體懸液中，37℃孵育20 min后檢測(cè)其熒光值，最終結(jié)果以綠色熒光值與紅色熒光值之比表示。B：線粒體三磷酸腺苷（ATP）含量檢測(cè)：將蛋白提取液（上海欽誠(chéng)生物科技有限公司）加至線粒體懸液中，10 000 rpm離心10 min，取上清，用ATP生物發(fā)光試劑盒（上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司）檢測(cè)ATP含量。②各組心肌細(xì)胞凋亡率：取各組小鼠心肌組織，剪碎勻漿后裂解，消化傳代后取第3代心肌細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，重懸細(xì)胞，向流式管中依次加入5 μl Annexin V-FITC（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司）、100 μl細(xì)胞懸液、5 μl PI染液（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司），顛倒混勻，25℃避光孵育15 min，用伯樂(lè)S3e流式細(xì)胞儀（上?，|馳儀器有限公司）檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率。③采用透射電鏡觀察各組心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)變化：取心尖部心肌，用戊二醛固定劑（上海釜誠(chéng)生物科技有限公司）固定，用KD-3368AM全自動(dòng)組織切片機(jī)（北京佳源科儀科技有限公司）將組織切成1 mm3大小，固定過(guò)夜，經(jīng)漂洗包埋后，切成厚度為70～90 nm切片，經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色，通過(guò)LVEM5透射電子顯微鏡（北京Quantum量子科學(xué)儀器貿(mào)易有限公司）觀察各組心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)。④各組心肌組織中的miRNA-153-3p水平：取各組小鼠心肌組織，液氮研磨，用總RNA提取試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海偉進(jìn)生物科技有限公司）將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為：cDNA模板5 μl，上下游引物各0.5 μl，dNTP 1 μl，ddH2O 15 μl，10×Taq DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液2.5 μl，反應(yīng)體系共25 μl。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性120 s，95℃變性30 s，72℃退火延伸15 s，39次循環(huán)。根據(jù)擴(kuò)增曲線讀取循環(huán)閾值（Cycle threshold，Ct），將β-actin作為內(nèi)參基因，用相對(duì)定量法以2-△△Ct對(duì)miRNA-153-3p水平進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0軟件，計(jì)量資料以（）形式表示，兩兩計(jì)量資料比較采用snk-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠的心肌細(xì)胞凋亡率比較處理組和模型組小鼠的心肌細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；處理組小鼠的心肌細(xì)胞凋亡率低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），（表1，圖1）。

2.2 各組小鼠的心肌細(xì)胞線粒體功能對(duì)比處理組和模型組小鼠的心肌細(xì)胞MMP和線粒體ATP含量低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；處理組小鼠的心肌細(xì)胞MMP和線粒體ATP含量高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），（表2，圖2）。

2.3 各組小鼠的心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)變化對(duì)照組小鼠的心肌細(xì)胞線粒體形態(tài)和結(jié)構(gòu)正常，肌絲排列整齊，Z線清晰，細(xì)胞核形態(tài)規(guī)整，線粒體密集的分布在肌絲間，線粒體形狀多為圓形或橢圓形。模型組小鼠的心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊，可見(jiàn)脂質(zhì)沉積，肌絲排列不整齊，并伴有肌絲斷裂和溶解，伴空泡變性及肌漿網(wǎng)腔擴(kuò)張。處理組小鼠的心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)損傷形態(tài)較模型組明顯改善（圖3）。

表1 各組小鼠的心肌細(xì)胞凋亡率比較（）

表1 各組小鼠的心肌細(xì)胞凋亡率比較（）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

圖1 各組小鼠的心肌細(xì)胞凋亡率

表2 各組小鼠的心肌細(xì)胞線粒體功能對(duì)比（）

表2 各組小鼠的心肌細(xì)胞線粒體功能對(duì)比（）

注：與對(duì)照組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05

圖2 各組小鼠的心肌細(xì)胞線粒體功能

圖3 透射電鏡觀察各組心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)變化（×6000）

2.4 各組小鼠心肌組織中的miRNA-153-3p水平對(duì)比處理組和模型組小鼠心肌組織中的miRNA-153-3p水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；處理組小鼠心肌組織中的miRNA-153-3p水平低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），（表3，圖4）。

3 討論

心力衰竭是由心臟負(fù)荷過(guò)度增加、心室重構(gòu)、炎癥損傷等因素引起心臟結(jié)構(gòu)或功能異常而導(dǎo)致的心臟循環(huán)障礙癥候群，其主要病理變化為組織血液灌注不足和體循環(huán)淤血，其主要臨床表現(xiàn)為呼吸困難、體液潴留及體力活動(dòng)受限，嚴(yán)重時(shí)可危及生命。目前的臨床治療未能令人滿意，故希望從分子發(fā)病機(jī)制方面探尋有效的治療方法應(yīng)用于臨床。

表4 各組小鼠心肌組織中的miRNA-153-3p水平對(duì)比（）

表4 各組小鼠心肌組織中的miRNA-153-3p水平對(duì)比（）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

圖4 各組小鼠心肌組織中的miRNA-153-3p水平

miRNA是一種小分子RNA，高度保守，長(zhǎng)度約為20～25個(gè)核苷酸，廣泛存在于動(dòng)物、病毒、植物中，可通過(guò)降解靶mRNA來(lái)沉默其同源靶基因。miRNA具有多種生物調(diào)控作用，如能參與細(xì)胞增殖、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、組織損傷修復(fù)、免疫應(yīng)答等，并與心肌纖維化、心臟肥厚等有關(guān)聯(lián)[9]。miRNA-153-3p是新近發(fā)現(xiàn)的miRNA，已被證實(shí)能參與心臟疾病的發(fā)生及發(fā)展進(jìn)程[10]。研究發(fā)現(xiàn)[11]，過(guò)氧化氫可通過(guò)上調(diào)miRNA-153-3p而促使心肌細(xì)胞凋亡。研究顯示[12]，miRNA-153-3p表達(dá)量檢測(cè)對(duì)左室肥厚有較高的判斷價(jià)值，其ROC曲線下面積為0.786。有學(xué)者在一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中選擇大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，制備高血壓所致心力衰竭大鼠模型，發(fā)現(xiàn)大鼠血漿中包括miRNA-153-3p在內(nèi)的多個(gè)miRNA表達(dá)水平增高[13]。文獻(xiàn)報(bào)道[14]，miRNA-153-3p在充血性心力衰竭患者外周血中的表達(dá)水平顯著上升，并與N末端腦鈉肽前體（NT-proBNP）水平呈正相關(guān)。本研究中，模型組小鼠心肌組織中的miRNA-153-3p水平高于對(duì)照組，提示miRNA-153-3p在心衰中呈高表達(dá)；處理組小鼠心肌組織中的miRNA-153-3p水平低于模型組，提示抑制miRNA-153-3p表達(dá)的干預(yù)成功。線粒體對(duì)離子穩(wěn)態(tài)、代謝底物攝取、活性氧水平、ATP合成、線粒體動(dòng)力學(xué)、電子傳遞鏈活性的影響和線粒體DNA損傷的調(diào)節(jié)異常是心衰的重要病理機(jī)制，也是推動(dòng)心衰病程的關(guān)鍵因素[15-17]。線粒體結(jié)構(gòu)和功能正常是維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、保證細(xì)胞能量供應(yīng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等生命活動(dòng)的基礎(chǔ)[18,19]。MMP、ATP被認(rèn)為是線粒體功能狀態(tài)的重要指標(biāo)之一，線粒體功能障礙可導(dǎo)致MMP降低及ATP生成減少[20]。本研究透射電鏡觀察結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠的心肌細(xì)胞線粒體形態(tài)和結(jié)構(gòu)均正常，模型組小鼠的心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊，可見(jiàn)脂質(zhì)沉積，肌絲排列不整齊，并且伴有肌絲斷裂和溶解，伴有空泡變性以及肌漿網(wǎng)腔擴(kuò)張，提示心力衰竭小鼠存在明顯的心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)損傷，處理組小鼠的心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)損傷形態(tài)較模型組有明顯的改善，提示抑制微小RNA-153-3p表達(dá)能夠減輕心力衰竭小鼠心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)損傷。本研究還顯示，模型組小鼠的心肌細(xì)胞MMP和線粒體ATP含量低于對(duì)照組，處理組小鼠的心肌細(xì)胞MMP和線粒體ATP含量高于模型組，提示抑制微小RNA-153-3p表達(dá)能夠促進(jìn)心力衰竭小鼠受損心肌細(xì)胞線粒體功能恢復(fù)。本研究還顯示，模型組小鼠的心肌細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組，處理組小鼠的心肌細(xì)胞凋亡率低于模型組，提示抑制微小RNA-153-3p表達(dá)能夠減少心力衰竭小鼠心肌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，抑制微小RNA-153-3p表達(dá)能夠減輕阿霉素性心力衰竭小鼠心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)損傷，促進(jìn)小鼠受損心肌細(xì)胞線粒體功能恢復(fù)，具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。