馬辰，王堃，馬云勝，單偉

(1.錦州醫(yī)科大學人體解剖學教研室，遼寧 錦州 121000；2.盤錦市中心醫(yī)院急診科，遼寧 盤錦 124000)

多形性膠質母細胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)是以膠質樣腫瘤細胞異常增殖生長為特征的最具侵襲性的人類腦腫瘤之一。目前已知生物節(jié)律的改變常常會導致多種病理情況出現(xiàn)，研究表明機體晝夜節(jié)律紊亂是增加患癌癥和代謝紊亂疾病的風險之一[1]。雖然人們對腫瘤固有的晝夜節(jié)律功能知之甚少，但是通過對一些與生物節(jié)律有關成分的研究發(fā)現(xiàn)，調節(jié)這些成分有可能為癌癥的預防和治療提供新的選擇[2]。人膠質母細胞瘤T98G細胞就是作為研究腫瘤細胞固有生物節(jié)律的一個癌細胞模型。

吡咯衍生物SR9009是一種特異性REV-ERB激動劑，近年來對其生物學特性以及靶向治療生物晝夜節(jié)律紊亂(比如肥胖、血脂異常、葡萄糖耐受不良、睡眠障礙和癌癥)研究發(fā)現(xiàn)：其對生物晝夜節(jié)律的藥理學調節(jié)主要是通過抑制細胞中異常激活的通路從而影響細胞的生存能力。研究表明激活REV-ERB受體激動劑SR9009，對小鼠體內代謝同樣產(chǎn)生了影響：如在不改變動物的運動量或食物攝入量條件下的食源性肥胖鼠的體重減輕[3]?？紤]到REV-ERBs對脂質、葡萄糖和能量代謝調節(jié)的作用以及癌細胞的高代謝需求，我們人為：對生物節(jié)律成分——REV-ERB的藥理學調節(jié)可能會改變癌細胞生存的代謝途徑。因此，本實驗擬采用SR9009處理對T98G細胞，并將其與BOR對照治療進行比較，評估其對腫瘤細胞生存能力的影響，同時觀察在模擬使用地塞米松(dexamethasone，DEX)后不同時間段的藥物敏感反應期，以及觀察其對細胞代謝水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

多形性膠質母細胞瘤T98G細胞株，購置于上海細胞庫。所有實驗操作符合錦州醫(yī)科大學實驗倫理委員會批準并符合相關要求。SR9009，BOR購于深圳華萊生物科技公司；DMEM，F(xiàn)BS購于Gibco公司；兔抗谷氨酰胺合成酶，兔抗GFAP，兔抗REV-ERBα，GFP/CY3二抗試劑盒、MTT(噻唑藍)檢測試劑盒購于北京博奧森公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

人多形性膠質母細胞瘤T98G細胞復蘇后，接種于75 cm2的培養(yǎng)瓶中，采用DMEM培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清(FBS)，于37 ℃，5% CO2和飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。每3天換液1次，待細胞融合后進行消化傳代。應用恢復活力的第二代細胞進行以下實驗。

1.3 MTT法測定SR9009對腫瘤細胞活力的影響

第二代T98G細胞以1×104密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，37 ℃下過夜。次日，培養(yǎng)的細胞分別與DMSO和10、20、40 μM 下REV-ERB激動劑SR9009共同孵育，孵育時間分別為24、48、72 h。孵育后，向每個孔中加入10 μL二苯基四唑溴化銨(MTT，5 mg/mL)，37 ℃ 孵育2 h。然后，向每個孔中加入100 μL DMSO-異丙醇(1∶1)混合液，在室溫下避光孵育10 min。樣品以650 nm波長激發(fā)，在570 nm波長下用的微孔板酶標儀進行分析。將DMSO處理細胞活力設定為100%。

1.4 SR9009對T98G細胞活力的時間影響效應觀察

T98G細胞以1×104密度接種于96孔板中，在37 ℃，飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中孵育過夜。次日，向每孔內添加100 nM 地塞米松后與細胞培養(yǎng)20 min，然后以每6個孔為1個單位，分別按照每6個小時間隔(0、6、12、18、24、30、36 h)，依次添加20 μM的SR9009或500 nM的BOR進行孵育。最后，按照前面所述方法，用MTT法測定細胞活力，在570 nm處用微孔板酶標儀進行對照分析。同樣以DMSO處理的細胞活力作為100%。

1.5 SR9009對T98G細胞周期影響的分析

T98G細胞分別與DMSO和SR9009(20 μM) 在無血清DMEM中孵育后36 h。然后，去除培養(yǎng)基，向DMEM培養(yǎng)基內添加20%FBS，繼續(xù)應用DMSO或SR9009孵育細胞16 h。最后，胰蛋白酶消化并收集細胞，冷PBS洗滌，在20 ℃下用70% 乙醇固定24 h。細胞重懸于150 mL含50 mg/mL碘化丙啶和10 mg RNAse A的PBS染色液中。分別取5×104個細胞行流式細胞儀檢測細胞周期。

1.6 流式細胞術檢測SR9009或BOR單獨用藥對腫瘤細胞氧化還原狀態(tài)的影響

20 μM SR9009和500 nM BOR 分別與T98G細胞孵育48 h和24 h，同時用40 μM SR9009與HepG2細胞孵育48 h。然后去除培養(yǎng)基，用冷PBS 洗滌細胞，胰酶消化并收集細胞。細胞與2 μM濃度活細胞熒光示蹤探針二乙酸熒光素(FDA)在37 ℃下孵育40 min，PBS洗滌2次，樣本在485 nm波長光激發(fā)，用流式細胞術檢測530 nm處的熒光強度。陰性對照為無熒光指示劑的細胞，用50 mg/mL碘化丙鈉染色鑒別活細胞。使用Flow Jo軟件分析熒光強度。

1.7 藥物聯(lián)合處理對T98G細胞的協(xié)同作用觀察

在37 ℃下將T98G細胞置于含100 nM 地塞米松和5% FBS的DMEM培養(yǎng)基中預孵育20 min。然后采用以下單獨或聯(lián)合不同濃度藥物與細胞共孵育：(1)單獨SR9009低(10 μM)和高劑量組(20 μM)；(2)單獨BOR低(50 nM)和高劑量組(500 nM)；(3)聯(lián)合BOR(50 nM)+SR9009(10 μM)低劑量組；(4)聯(lián)合高劑量組BOR(500 nM)+SR9009(20 μM)。然后37 ℃孵育36 h。MTT法分析細胞活力。

1.8 免疫組織化學檢測

培養(yǎng)細胞的蓋玻片在含4%多聚甲醛PBS中固定15 min，PBS沖洗2次，用封閉緩沖液(PBS中加入0.1% 牛血清白蛋白、0.1% 吐溫20和0.1% 甘氨酸)處理10 min，分別滴加一抗(兔抗谷氨酰胺合成酶、波形蛋白、GFAP、REV-ERBα)，并在4 ℃冰箱內過夜。次日，取出蓋玻片并洗滌3次，與CY3或GFP標記的抗兔免疫球蛋白(IgG，1∶500)室溫孵育1 h。DAPI染色細胞核，沖洗蓋玻片，梯度酒精脫水，封片，共聚焦顯微鏡觀察。

1.9 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 SR9009對T98G細胞活力和形態(tài)的影響

免疫細胞化學方法發(fā)現(xiàn)：人T98G細胞表達了波形蛋白(Vimentin)、谷氨酰胺合成酶(GS)、膠質纖維酸性蛋白(GFAP)這些典型的膠質細胞標志物以及生物鐘成分蛋白REV-ERBa，見圖1A～圖D。此外，與DMSO對照組相比，細胞與不同濃度(10、20、40 μM)SR9009在不同時間(24、48、72 h)處理后，隨著藥物濃度增加和孵育時間的延長細胞形態(tài)受到了顯著影響，可見細胞體積萎縮變小，胞核和胞質均減小，尤其是胞質減少明顯，見圖1E～圖1F。MTT法顯示濃度為10 μM的SR9009處理的T98G細胞活力與20 μM或40 μM處理的細胞活力差異明顯；而SR9009處理24 h與處理48、72 h的細胞活力也不同。在20、40 μM 濃度分別孵育48、72 h的時候細胞活力明顯下降(P<0.01)，見表1、圖2。尤其是與20、40 μM的SR9009孵育72 h后，有活性細胞僅剩下約20%左右。

A:綠色為T98G細胞表達的波形蛋白；B：綠色為T98G細胞表達的谷氨酰胺合成酶；C：T98G細胞與DMSO孵育48 h，紅色熒光為GFAP表達；D：T98G細胞與DMSO孵育48 h，REV-ERBa 呈綠色熒光；E：T98G細胞與SR9009 孵育48 h，GFAP呈紅色熒光；F：T98G細胞與SR9009孵育48 h，REV-ERBa呈綠色熒光。標尺：10 μm；VIMENTIN：波形蛋白；GFAP：膠質原纖維酸性蛋白；GS：谷氨酰胺合成酶

表1 MTT法測試SR9009對T98G細胞活力的影響

SR9009濃度和處理時間對T98G細胞活力均有顯著差異；◇P<0.01；與24 h組比較，△P<0.01；與48 h比較，☆P<0.01，n=6

2.2 SR9009、BOR處理時間對T98G細胞活力的影響

MTT法分析SR9009(20 μM)處理不同的時間對T98G細胞活力的影響，結果顯示出明顯的藥物處理時間效應。T98G細胞活力水平隨藥物處理時間變化而變化，孵育6 h與孵育18、24、30 h有顯著差異。即在SR9009處理18～30 h時間段內細胞活力為最低水平，在該時間段內藥物對細胞活力的影響也最明顯(P<0.05)，見圖3A。和SR9009相似，使用BOR(500 nM)處理的T98G細胞同樣發(fā)現(xiàn)細胞活力存在顯著的時間效應。與6 h相比，在共孵育后的12～24 h時間段內細胞活力為最低(P<0.01)，見圖3B。

2.3 SR9009對T98G細胞周期的影響

流式細胞術分析顯示，經(jīng)20% FBS刺激，SR9009處理后的T98G細胞58.2%處于G0/G1期，而DMSO處理后的細胞只有43.3% 處于G0/G1期(P<0.01)。相反，經(jīng)DMSO處理的細胞中，S期細胞比例為40.1%，遠高于經(jīng)SR9009處理的細胞的22.6%(P<0.05)，見圖4。

2.4 SR9009對T98G細胞氧化還原和脂質代謝的影響

用流式細胞術測量熒光強度顯示：與DMSO對照組相比，20 μM 濃度SR9009處理的T98G細胞ROS水平顯著降低(P<0.01)，見圖5A。相反，與DMSO對照組細胞相比，與500 nM濃度的BOR孵育24 h的T98G細胞中ROS水平明顯升高(P<0.05)，見圖5B。

A：MTT法檢測不同時間添加20 μM濃度的SR9009與地塞米松(100 nM)共同處理的T98G細胞后不同時間段的細胞活力；B：MTT法測定BOR(500 nM)和地塞米松處理的T98G細胞在不同時間段的細胞活力，*P<0.05，#P<0.01，n=6。BOR=硼替佐米

A：DMSO處理組細胞周期；B：SR9009處理組細胞周期圖；C：DMSO和SR9009處理對T98G細胞周期影響統(tǒng)計圖。SR9009組在G0/G1期比例更高，G0/G1 *P<0.01；S *P<0.05，n=6

A:使用SR9009(20 μM，48 h) 處理T98G細胞；B：使用BOR(500 nM，24 h)處理T98G細胞。SR9009、BOR與DMSO處理的細胞相比有顯著性差異，**P<0.01，*P<0.05，n=6

2.5 SR9009和BOR聯(lián)合應用對T98G細胞協(xié)同作用結果

通過MTT測定細胞活力發(fā)現(xiàn)：當單獨給予低濃度BOR(50 nM)或SR9009(10 μM)處理時，細胞存活率仍能達到60%；然而，與每種藥物單獨處理相比，低濃度聯(lián)合(BOR 50 nM +SR9009 10 μM)處理后，細胞活力下降到28%(P<0.01)，見圖6A。此外，當單獨給予高濃度BOR(500 nM)或SR9009(20 μM)藥物處理后，細胞存活率分別為28%和34%。然而，當兩種藥物同時聯(lián)合以高劑量(BOR 500 nM+SR9009 20 μM)應用于T98G細胞時，細胞存活率顯著降低，細胞活力下降到17%(P<0.001)，見圖6B。可見兩種藥物聯(lián)合具有重要的協(xié)同增效作用。

與單獨藥物處理的細胞相比：**P<0.01，***P<0.001，n=6

3 討 論

現(xiàn)代人的一些生活習慣—如輪班、時差等可能會導致機體晝夜節(jié)律紊亂，從而增加患癌癥和代謝紊亂疾病的風險[4]。雖然人們對腫瘤固有的晝夜節(jié)律功能知之甚少，但是通過對一些與生物節(jié)律有關成分的研究發(fā)現(xiàn)，調節(jié)這些成分有可能預防和治療癌癥。REV-ERBs是血紅素結合的生物節(jié)律蛋白成分，它是腫瘤發(fā)生過程(如新陳代謝、增殖和炎癥)的抑制因子[5]。SR9009作為REV-ERBs特異性的激動劑，是一種合成的吡咯衍生物。在對小鼠的初步試驗表明，它可以使肌肉和新陳代謝率增加，運動時耐力增強。此外，它還可以降低膽固醇，減少炎癥和焦慮[6]。

本研究表明，SR9009對腫瘤固有生物節(jié)律蛋白成分的調節(jié)對腫瘤細胞的代謝具有重大影響，它對膠質瘤細胞產(chǎn)生了一定的細胞毒性作用。這些觀察結果表明，通過調節(jié)膠質母細胞瘤細胞特定的生物節(jié)律鐘成分(如調節(jié)REV-ERBs代謝)可以發(fā)揮明顯的抗腫瘤治療作用。SR9009通過減少ROS生成改變了膠質細胞典型的形態(tài)、細胞生存能力和新陳代謝水平。本研究中發(fā)現(xiàn)與SR9009的聯(lián)合治療進一步增強了BOR的作用效果。然而，我們也發(fā)現(xiàn)這兩種藥物發(fā)揮抗腫瘤的作用機制似乎不同，BOR抑制蛋白酶體功能，而SR9009作用于與生物節(jié)律鐘相關的細胞代謝功能。同時，這兩種藥物都表現(xiàn)出具有一個對細胞產(chǎn)生藥物治療最高敏感性的作用時間段，即從12～18 h到24 h。

本研究結果表明，REV-ERB激動劑明顯影響了細胞周期，因為與DMSO對照組細胞相比，SR9009處理的細胞中約有60%處于G0/G1期。我們探討了聯(lián)合治療是否能改善或增強治療效果。為此，本實驗采用了BOR(50 nM或500 nM)，SR9009(10 nM或20 μM)單獨處理T98G細胞，以及低濃度(50 nM BOR+10 μM SR9009)和高濃度組合(500 nM BOR+20 μM SR9009)孵育T98G細胞36 h，通過MTT測定細胞活力。我們發(fā)現(xiàn)了兩種藥物具有良好的協(xié)同作用，因此在適當?shù)臅r間階段采用兩種藥劑的聯(lián)合治療可以實現(xiàn)以較低的單獨劑量獲得更好的療效[7]。

本研究發(fā)現(xiàn)BOR和SR9009這兩種藥物影響氧化還原狀態(tài)的機制似乎不同，因為研究中發(fā)現(xiàn)BOR誘導ROS水平升高，而SR9009處理后細胞中ROS水平下降。盡管BOR抑制蛋白酶體后導致細胞凋亡等后續(xù)機制尚不清楚。此外，在結直腸癌和人H460非小細胞肺癌細胞以及人白血病細胞中也觀察到BOR處理后的細胞中ROS水平升高[8-9]。相反，SR9009處理的細胞與未處理的細胞相比，兩種腫瘤細胞系的ROS水平都降低。這些結果與Sulli等人提出的觀點一致，即癌細胞對SR9009治療的敏感性增強與ROS的生成增加無關[10]。