陸健 張佳佳 周國(guó)勤 王佩佩 慶輝

(南京市水產(chǎn)科學(xué)研究所，江蘇南京 210036)

溶解氧(DO) 是影響水生生物生長(zhǎng)、正常生理功能和生存的重要因素之一。水體中的溶解氧極易受到季節(jié)變化、晝夜節(jié)律和溫度等環(huán)境因素的影響，因此普遍具有不穩(wěn)定性[1]。近年來(lái)，由于水體富營(yíng)養(yǎng)化嚴(yán)重，全球性、季節(jié)性水體缺氧的現(xiàn)象愈加頻繁發(fā)生。特別在沿海地區(qū)，過(guò)多養(yǎng)分的投入使得海洋中初級(jí)生產(chǎn)力提高，從而導(dǎo)致底層有機(jī)物沉積增加，當(dāng)微生物分解底層有機(jī)物質(zhì)所需的氧氣超過(guò)地表水的再充氧速率時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致水體供氧不足[2]。另一方面，二氧化碳大量排放導(dǎo)致的溫室效應(yīng)也會(huì)提高局部缺氧發(fā)生的頻率。因此，在季節(jié)性缺氧的沿海地區(qū)，水生生物通常生活在低氧和常氧交替的環(huán)境下。尤其是在水體較小水位較低的池塘中，溶解氧受天氣、溫度、飼養(yǎng)密度等外部環(huán)境的影響波動(dòng)較大，養(yǎng)殖水體中一旦出現(xiàn)缺氧，就會(huì)有“泛塘”的危險(xiǎn)，甚至?xí)斐删薮蟮慕?jīng)濟(jì)損失[3]。

低氧環(huán)境已被證明會(huì)影響魚類的行為、生長(zhǎng)、生理狀態(tài)以及疾病抵抗力，甚至導(dǎo)致魚類死亡[3-4]。一般情況下，水體溶解氧在5 mg/L以上時(shí)，魚類可正常攝食；當(dāng)溶解氧低于2 mg/L時(shí)，魚類攝食量顯著下降；當(dāng)溶解氧低于1 mg/L時(shí)，大部分魚會(huì)浮頭甚至窒息死亡[5]。因此，魚類在進(jìn)化過(guò)程中一直調(diào)整著對(duì)低氧脅迫的生存策略，而這種生存能力依賴于完整的低氧感受機(jī)制和低氧環(huán)境下復(fù)雜的基因調(diào)控機(jī)制[6]。例如，攀鱸屬魚類進(jìn)化出鰓上器官，使之能在缺氧的池水里生存[7]；在極度低氧的條件下，鯽將有氧呼吸轉(zhuǎn)化為無(wú)氧代謝[8]；鯉科魚類則是通過(guò)增加低氧誘導(dǎo)因子基因(hif-1)的拷貝倍數(shù)來(lái)提高血紅蛋白的載氧能力[6，9]。

大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”是近兩年推廣養(yǎng)殖的大口黑鱸新品種，其幼魚和成魚生長(zhǎng)速度較快，養(yǎng)殖5～7個(gè)月即可達(dá)到上市規(guī)格，適合在我國(guó)淡水水域采用配合飼料進(jìn)行養(yǎng)殖[10]。高密度精養(yǎng)現(xiàn)已成為池塘養(yǎng)殖的主要方式[11]，但隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，養(yǎng)殖密度逐漸增加，也出現(xiàn)了水質(zhì)惡化及富營(yíng)養(yǎng)化等問(wèn)題，因而加大了大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”缺氧的風(fēng)險(xiǎn)。另一方面，魚類的大腦和肝臟參與能量和氧的代謝，對(duì)缺氧特別敏感[12]。為研究低氧脅迫對(duì)大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”呼吸代謝和細(xì)胞凋亡的影響，本試驗(yàn)以大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”為研究對(duì)象，探究其在低氧脅迫下相關(guān)基因的表達(dá)，旨在為大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”健康高效養(yǎng)殖提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，防止或減少缺氧“泛塘”所造成的損失。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”幼魚體質(zhì)量為(10.4±0.8) g，體長(zhǎng)為(8.2±0.5) cm，來(lái)自江蘇南京帥豐飼料有限公司。將試驗(yàn)魚暫養(yǎng)于有生物過(guò)濾水再循環(huán)系統(tǒng)(配備有冷卻和加熱功能，流速為5 L/min，光照時(shí)間為14 h)的水族箱中，每日投飼2次(8:00—9:00和20:00—21:00)，飼料采用江蘇南京帥豐飼料有限公司生產(chǎn)的大口黑鱸配合飼料。暫養(yǎng)期間，水溫為(26 ± 1)℃，溶解氧在5 mg/L以上，氨氮和亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度低于0.01 mg/L。試驗(yàn)前停飼24 h，試驗(yàn)期間不投飼。

1.2 低氧脅迫處理

挑選20尾試驗(yàn)魚放入循環(huán)水養(yǎng)殖玻璃缸(長(zhǎng)70 cm×寬48 cm×高30 cm)中，用于測(cè)試“浮頭點(diǎn)”。低氧脅迫開始前，利用LDO101 probe測(cè)定儀測(cè)得水體溶解氧為7.89 mg/L。低氧脅迫開始后，關(guān)閉增氧機(jī)和進(jìn)水閥，用透明保鮮膜將整個(gè)玻璃缸密閉，充入氮?dú)猓?0 min記錄1次水中的溶解氧。試驗(yàn)過(guò)程中，觀察魚的活動(dòng)情況，當(dāng)試驗(yàn)魚開始因低氧而浮在水面吞食空氣時(shí)，則達(dá)到“浮頭點(diǎn)”。經(jīng)測(cè)試，大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”幼魚的“浮頭點(diǎn)”DO為 0.45 mg/L。因此本試驗(yàn)將低氧脅迫的條件設(shè)置為(0.70±0.05) mg/L，此質(zhì)量濃度使試驗(yàn)魚處于穩(wěn)定的低氧脅迫狀態(tài)同時(shí)又不引起死亡。

選擇健康無(wú)病、體質(zhì)良好的試驗(yàn)魚120尾，隨機(jī)放入6個(gè)循環(huán)水養(yǎng)殖玻璃缸中，每缸20尾魚。試驗(yàn)設(shè)置DO為(7.50±0.50)mg/L的常氧對(duì)照組和(0.70±0.05) mg/L的低氧脅迫組，各3個(gè)平行。關(guān)閉低氧脅迫組的進(jìn)水，停止增氧，開始低氧脅迫試驗(yàn)。在充入氮?dú)饧s40 min時(shí)，低氧脅迫組的溶解氧水平下降至(0.70 ± 0.05) mg/L，之后維持此水平8 h。在低氧處理后的1、2、4、6、8 h以及恢復(fù)常氧24 h時(shí)，于每個(gè)時(shí)間點(diǎn)在低氧脅迫組和對(duì)照組各隨機(jī)選取1尾魚，對(duì)其肝臟及腦組織進(jìn)行取樣，經(jīng)液氮處理后置于-80 ℃下保存。

1.3 組織RNA的提取和cDNA的合成

組織RNA的提取采用高純總RNA快速抽提試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司，RP1202)，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的質(zhì)量(電壓120 V，電流165 mA，時(shí)長(zhǎng)25 min)，用Nanodrop檢測(cè)RNA的純度(OD260/OD280)和質(zhì)量濃度。根據(jù)HiScript?Reverse Transcriptase的說(shuō)明(Vazyme，R123-01)進(jìn)行第1鏈cDNA反轉(zhuǎn)錄。

1.4 熒光定量PCR

參考樊佳佳等[13]的方法以18 s基因?yàn)閮?nèi)參基因，caspases引物序列參考Yu等[14]，大口黑鱸轉(zhuǎn)錄組序列(hif-1α，NCBI：KY952764.1)、(glut-1，KY952765.1)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)基因特異性上下游引物，參考引物序列詳見表1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用SYBR qPCR Master Mix(High ROX Premixed)試劑盒(Vazyme，Q341-02/03)在ABI熒光定量PCR儀上擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：2 μL cDNA模板(5 ng/μL)，4 μL的上、下游引物(10 μmol/L)，10 μL 2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix(High ROX Premixed)。擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火60 s，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線60 ℃→95 ℃，每15 s升溫0.3 ℃。

1.5 數(shù)據(jù)處理和分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析后得到的試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用 SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。利用單因素方差分析(One-Way ANOVA)和LSD多重比較檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和檢驗(yàn)分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，用Origin 8.6軟件繪圖。

表1 引物信息

2 結(jié)果和分析

2.1 低氧脅迫對(duì)大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”hif-1α基因表達(dá)的影響

由圖1、圖2可見，低氧脅迫下大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”腦和肝組織hif-1α的表達(dá)量均從1 h后開始顯著升高，腦組織的hif-1α表達(dá)量在4 h時(shí)達(dá)到峰值(P<0.01)，為對(duì)照組的16.84倍，肝組織的hif-1α表達(dá)量在6 h時(shí)達(dá)到峰值(P<0.01)，為對(duì)照組的6.07倍。復(fù)氧24 h后，二者均下降至常氧水平(P>0.05)。

注：*表示組間差異顯著(P<0.05)，**表示組間差異極顯著(P<0.01),下同。)

圖2 低氧脅迫對(duì)大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”肝組織

2.2 低氧脅迫對(duì)大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”glut-1基因表達(dá)的影響

由圖3、圖4可見，低氧脅迫下大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”腦和肝組織glut-1的表達(dá)量均從1 h后開始顯著升高，且均在6 h時(shí)達(dá)到峰值(P<0.01)，分別為對(duì)照組的14倍和13.18倍；隨后有所下降，但直至8 h時(shí)仍極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。復(fù)氧24 h后，腦和肝組織的glut-1表達(dá)量均恢復(fù)至常氧對(duì)照組水平(P>0.05)。

圖3 低氧脅迫對(duì)大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”腦組織glut-1表達(dá)的影響

圖4 低氧脅迫對(duì)大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”肝組織glut-1表達(dá)的影響

2.3 低氧脅迫對(duì)大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”caspases(半胱氨酸蛋白酶)基因表達(dá)的影響

低氧脅迫下，大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”腦組織caspase3和caspase9的表達(dá)量極顯著升高，均在8 h時(shí)達(dá)到峰值(P<0.01)，分別為對(duì)照組的10.36和11.42倍。復(fù)氧24 h后，腦組織caspase3和caspase9的表達(dá)量逐漸下降，但仍極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)(見圖5、圖6)。肝組織caspase3和caspase9的表達(dá)量在低氧脅迫2 h后極顯著升高(P<0.01)，均在8 h時(shí)達(dá)到峰值(P<0.01)，分別為對(duì)照組的11.89和9.27倍。復(fù)氧24 h后，肝組織caspase3和caspase9的表達(dá)量逐漸下降，caspase3仍顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而caspase9則恢復(fù)至常氧水平(P>0.05)(見圖7、圖8)。

圖5 低氧脅迫對(duì)大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”腦組織caspase 3表達(dá)的影響

圖6 低氧脅迫對(duì)大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”腦組織caspase 9表達(dá)的影響

圖7 低氧脅迫對(duì)大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”肝組織caspase 3表達(dá)的影響

圖8 低氧脅迫對(duì)大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”肝組織caspase 9表達(dá)的影響

3 討論

在自然水體或漁業(yè)生產(chǎn)中，尤其是在較高密度的養(yǎng)殖水體中，由于溫度、季節(jié)和水質(zhì)等因素的改變導(dǎo)致魚類出現(xiàn)急性低氧應(yīng)激的情況時(shí)有發(fā)生。低氧誘導(dǎo)因子(HIF)是目前被鑒定到的低氧信號(hào)傳導(dǎo)途徑中最為關(guān)鍵的因子。關(guān)于hif-1的低氧誘導(dǎo)機(jī)制已被證實(shí)，其主要影響氧的傳遞和利用[15-16]。有研究表明，HIF的調(diào)控功能在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均可發(fā)揮作用，例如斑馬魚(Daniorerio)[17]、牙鲆(Paralichthysolivaceus)[18]等。本研究結(jié)果顯示，急性低氧脅迫后大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”腦和肝組織hif-1α的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組。同樣的，草魚[19]hif-1α在低氧脅迫4 h后高度表達(dá)，半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)[16]hif-1α在低氧脅迫初期表達(dá)量呈現(xiàn)明顯的上調(diào)趨勢(shì)。在正常情況下，hif-1α通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑迅速降解，減少積累[20]，但在低氧條件下，羥基化途徑被抑制，導(dǎo)致hif-1α蛋白累積，這可能是低氧脅迫下hif-1α表達(dá)量上升的原因[20-21]。但是，團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)[22]和虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[23]在低氧脅迫下hif-1α的表達(dá)量與對(duì)照組無(wú)顯著差異。引起這種不同表達(dá)模式的原因，一方面可能是不同魚種有不同的低氧耐受閾值或者物種特異性的氧氣需求[22]，另一方面也可能是魚類hif-1α在低氧脅迫下的表達(dá)具有種屬特異性[16]。研究表明，上調(diào)的hif-1α表達(dá)可以有效地激活下游目標(biāo)基因，例如葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子(Gluts)[24]，它們可以編碼細(xì)胞膜上的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。在低氧條件下Gluts被誘導(dǎo)表達(dá)，從而加強(qiáng)細(xì)胞葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)效率，以增強(qiáng)細(xì)胞能量需求[6]。對(duì)低氧敏感的歐洲鱸(Dicentrarchuslabrax)在面對(duì)低氧刺激后，glut-2 mRNA拷貝數(shù)發(fā)生了相應(yīng)變化，這印證了glut與低氧適應(yīng)性相關(guān)的認(rèn)識(shí)[25]。本研究結(jié)果也表明，在低氧脅迫后，大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”腦和肝組織中g(shù)lut-1的表達(dá)量顯著上升。這種glut-1的增加與先前對(duì)小鼠3T3-L1細(xì)胞[26]的觀察結(jié)果一致。在缺氧條件下，水生動(dòng)物產(chǎn)生多種代謝適應(yīng)，將新陳代謝從有氧氧化轉(zhuǎn)換到糖酵解途徑是1種增加葡萄糖的攝取以促進(jìn)對(duì)低氧張力反應(yīng)的策略，對(duì)葡萄糖的更高需求導(dǎo)致細(xì)胞膜上葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的數(shù)量增加[6]。因此，大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”glut-1的上調(diào)可有效增加葡萄糖的攝取，并維持低氧條件下的能量補(bǔ)充。值得一提的是，Yang等[24]發(fā)現(xiàn)，在1.2 mg/L的低氧脅迫后，大口黑鱸hif-1α和glut-1達(dá)到峰值的時(shí)間與本研究相比均較晚，主要原因可能是溶解氧水平不同。同樣，Sun等[27]的研究也顯示，大口黑鱸在不同程度低氧脅迫后，hif-1α和glut-1的表達(dá)量在嚴(yán)重低氧組(1.2 mg/L)顯著升高的時(shí)間早于中度低氧組(3 mg/L)。

研究表明，hif-1可以通過(guò)調(diào)控Bax(B淋巴細(xì)胞瘤-2基因相關(guān)的X蛋白質(zhì))改變線粒體膜通透性或誘導(dǎo)MPTP(線粒體膜轉(zhuǎn)運(yùn)通道孔)增加，促進(jìn)凋亡的發(fā)生[28]。吳勝春等[29]發(fā)現(xiàn)，低氧條件下，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304通過(guò)上調(diào)hif-1a的表達(dá)，進(jìn)而使Caspase3和Bax的表達(dá)上調(diào)，Bcl-2(B淋巴細(xì)胞瘤-2)的表達(dá)下調(diào)，促使細(xì)胞凋亡的發(fā)生。低氧主要通過(guò)死亡受體通路以及內(nèi)源性的線粒體通路這兩條途徑來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，而caspase3則是這兩種途徑中常見的效應(yīng)子，被稱為凋亡的“執(zhí)行者”[30]，而作為凋亡的“啟動(dòng)者”，caspase9主要參與線粒體凋亡途徑[31]。在正常條件下，Caspases以休眠的酶原形式存在于正常細(xì)胞中，當(dāng)其受到凋亡信號(hào)刺激后，可以裂解特異性的蛋白質(zhì)底物，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[32]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在低氧脅迫后，肝臟和腦組織caspase3和caspase9的表達(dá)量均顯著升高。與本結(jié)果類似的是，鱘魚(Acipensersinensis)在急性低氧30 min (氧飽和度為15%)時(shí)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的各個(gè)區(qū)域均可檢測(cè)到細(xì)胞凋亡，同時(shí)caspase3的表達(dá)量顯著高于常氧組[33]；在0.2 mg/L低氧脅迫下的斑馬魚[34]，其caspase3基因表達(dá)量顯著升高，表明急性低氧脅迫會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)受到損傷，觸發(fā)激活凋亡相關(guān)系列基因的變化，從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，通過(guò)清除受損的細(xì)胞來(lái)維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。另一方面，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)對(duì)缺氧最為敏感，而且對(duì)低氧的耐受性較差，缺氧可誘導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性或急性損傷。在腦缺氧損傷中，不僅存在細(xì)胞凋亡，還可能存在細(xì)胞壞死，細(xì)胞凋亡是腦缺氧后遲發(fā)性神經(jīng)元死亡的重要表現(xiàn)形式[35]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在低氧脅迫8 h時(shí)腦組織caspases的表達(dá)量達(dá)到峰值，并且在復(fù)氧24 h時(shí)caspases的表達(dá)量仍高于對(duì)照組，這可能是遲發(fā)性神經(jīng)元出現(xiàn)死亡的表現(xiàn)，也可能是復(fù)氧時(shí)氧化應(yīng)激帶來(lái)的損傷致使腦細(xì)胞再一次發(fā)生凋亡。因此，在日常的養(yǎng)殖中，應(yīng)做好池塘日常管理和巡查工作，避免因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間缺氧導(dǎo)致池魚死亡，造成經(jīng)濟(jì)損失。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，低氧脅迫會(huì)引起大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”肝臟和腦組織hif-1α、glut-1和caspases基因表達(dá)量顯著升高，初步表明hif-1α和glut-1是“優(yōu)鱸3號(hào)”低氧信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的重要組成部分。另一方面也表明，低氧脅迫可能會(huì)激活線粒體凋亡通路，從而可能會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。