吳曉雯 王鐵桿 劉穎 張鵬

(浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所，溫州市海洋生物遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江溫州 325005)

海洋游泳動(dòng)物是海洋生態(tài)系統(tǒng)和海洋生物資源的重要組成部分，包括海洋魚類、頭足類、甲殼類等，可以直接給人類提供高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的食物，具有重要的經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值。對(duì)海洋游泳生物進(jìn)行調(diào)查鑒定是海洋生物資源監(jiān)測(cè)、海洋生物多樣性研究的基礎(chǔ)工作，也是海洋資源開發(fā)利用和海洋保護(hù)區(qū)建設(shè)重要的參考依據(jù)。長(zhǎng)期以來(lái)，都是根據(jù)生物的外部形態(tài)來(lái)鑒定物種。通常魚類在早期的形態(tài)特征差異不夠明顯或者相類似，很難根據(jù)其早期階段的形態(tài)特征進(jìn)行精確分類[1]。由于物種表型具有可塑性，其形態(tài)特征會(huì)受到生物或者非生物因素的干擾[2]；生物在不同的生長(zhǎng)發(fā)育階段或者兩性異形也會(huì)影響鑒定的準(zhǔn)確性[3]。此外，形態(tài)學(xué)鑒定還受到分類者經(jīng)驗(yàn)和能力的影響，需要大量的專業(yè)知識(shí)積累。因此，準(zhǔn)確地鑒定物種顯得尤為重要。

隨著生物分子技術(shù)的快速發(fā)展，DNA條形碼分析成為物種系統(tǒng)演化和分類鑒定的1種新的手段[4]，是專業(yè)人員可以運(yùn)用的1種有效鑒定工具[5]。Hebert 等[6]明確提出了DNA 條形碼(DNA barcoding) 的概念，即通過(guò)使用短的、標(biāo)準(zhǔn)化的基因片段來(lái)進(jìn)行物種鑒定，以提高真核生物識(shí)別效率，也使得DNA 序列輔助分類方法得到一定程度的統(tǒng)一。DNA條形碼技術(shù)的快速發(fā)展，在物種鑒定方面表現(xiàn)出較高的優(yōu)越性，尤其是DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建，為種類鑒定奠定了基礎(chǔ)。目前，線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ(COI) 基因被公認(rèn)為標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼[7-8]，可以有效鑒定魚類[9-12]、頭足類[13]、甲殼類[14]和多毛類[15]。

洞頭海域處于浙江省南部，該海域受浙閩沿岸流和臺(tái)灣暖流的低、高鹽水系交匯的影響，水文條件適宜，海域開闊，海洋生物資源豐富。雖然已有該海域游泳動(dòng)物的物種組成和群落結(jié)構(gòu)季節(jié)性變化的研究報(bào)道[16-17]，但鮮有關(guān)于DNA條形碼數(shù)據(jù)收集的報(bào)道。為了監(jiān)測(cè)該地區(qū)的游泳生物資源，本研究通過(guò)測(cè)定和比對(duì)溫州海域常見(jiàn)游泳生物的線粒體COI基因的DNA 條形碼序列，分析該基因在溫州海域游泳生物鑒定中的可行性，并為建立溫州海域游泳生物DNA 條形碼庫(kù)提供方法和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，研究結(jié)果可為該地區(qū)漁業(yè)監(jiān)測(cè)、海洋生物資源保護(hù)、海洋保護(hù)區(qū)的建立提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集與鑒定

2020年4月在浙江省洞頭海域進(jìn)行張網(wǎng)調(diào)查(張網(wǎng)網(wǎng)口長(zhǎng)10 m、寬7 m、高5 m， 80目)，生物學(xué)測(cè)定按照《海洋調(diào)查規(guī)范 第6 部分：海洋生物調(diào)查》(GB/T 12763.6—2007)進(jìn)行。將每個(gè)調(diào)查站位的漁獲物全部取樣裝入樣品袋，做好漁撈記錄和樣品袋編號(hào)記錄后，冰鮮保存，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析和鑒定，對(duì)主要品種進(jìn)行生物學(xué)測(cè)定。稱量用電子天平精確度為0.001 g。游泳動(dòng)物中軟體動(dòng)物和節(jié)肢動(dòng)物種類名稱及分類地位參考《中國(guó)海洋生物名錄》[18]，魚類參考《中國(guó)海洋魚類》[19]《浙江海洋魚類》[20]等文獻(xiàn)資料。

1.2 試驗(yàn)方法

取漁獲物的肌肉組織，用雙蒸水洗去雜物，再用濾紙吸干，采用海洋動(dòng)物組織DNA提取試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)提取基因組DNA，4 ℃保存?zhèn)溆?。利用通用引物?duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，引物詳見(jiàn)表1。

表1 引物序列信息

PCR反應(yīng)體系為25 μL：上下游引物各1 μL(10 μM)，DNA模板2 μL，金牌PCR Mix(green，北京擎科生物技術(shù)有限公司)21 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，53 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。以上試驗(yàn)均設(shè)置陰性對(duì)照。取2 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將單一目的條帶的PCR產(chǎn)物送到杭州擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行純化和雙向測(cè)定，以確保序列的可靠性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

對(duì)獲得的全部序列進(jìn)行人工比對(duì)并進(jìn)行人工矯正，截取有效準(zhǔn)確片段進(jìn)行后續(xù)分析，將所有序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行blast序列相似性比對(duì)，采用兩兩序列間遺傳相似度>98%的為同一物種、92%～98%為同一屬、85%～91%為同一科的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)洞頭海域的游泳生物進(jìn)行種類鑒定[21-22]。然后通過(guò)MEGA 6.0[23]對(duì)序列進(jìn)行排列，計(jì)算所獲序列的長(zhǎng)度、GC含量、多態(tài)位點(diǎn)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)等參數(shù)。結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)中與樣品DNA 條形碼相似度最高的序列，利用鄰接法(neighbor-joining) 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。鄰接法分支樹的可信度采用Bootstrap檢驗(yàn)，經(jīng)1 000次自檢獲得分支樹節(jié)點(diǎn)的支持率。

2 結(jié)果和分析

2.1 基因序列

本研究共獲得29條序列，經(jīng)過(guò)比對(duì)，平均長(zhǎng)度為666 bp，其中魚類序列共有19條，無(wú)脊椎動(dòng)物10條，所有序列沒(méi)有插入、缺失堿基。保守位點(diǎn)316個(gè)，變異位點(diǎn)350個(gè)，單變異位點(diǎn)13個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)337個(gè)。T、C、A和G含量分別為31.8%、24.9%、25.1%和18.1%。

在脊椎動(dòng)物(魚類)19條序列中，保守位點(diǎn)379個(gè)，變異位點(diǎn)287個(gè)，其中單變異位點(diǎn)30個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)257個(gè)。T、C、A和G含量分別為30.2%、27.1%、24.3%和18.4%。

在無(wú)脊椎動(dòng)物(頭足類、甲殼類和多毛類)10條序列中，保守位點(diǎn)346個(gè)，變異位點(diǎn)320個(gè)，其中單變異位點(diǎn)41個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)279個(gè)。T、C、A和G含量分別為34.8%、20.8%、26.9%和17.5%。

2.2 序列同源性分析

將所獲得的29條有效序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行blast比對(duì)，比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表2。其中魚類19種，頭足類2種，甲殼類5種，多毛類3種。共有15條序列相似度為100%，12條序列相似度為99.0%，1條序列相似度為98.8%，大于98%的序列共有28條，占所有序列的96.5%。只有長(zhǎng)吻沙蠶(Glycerachirori)相似度為86.19%。將所有序列上傳到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得相應(yīng)的登錄號(hào)(見(jiàn)表2)。

表2 樣品信息

2.3 遺傳距離分析

K2P雙參數(shù)模型為生物條形碼協(xié)會(huì)(Consortium for the Barcode of Life，CBOL) 推薦的遺傳距離計(jì)算方法[24]。本研究采用K2P 雙參數(shù)模型，結(jié)合GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到的29條序列，統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)中樣品的種內(nèi)、種間和科間的遺傳距離，結(jié)果見(jiàn)表3。根據(jù)K2P 模型計(jì)算各分類階元的遺傳距離，結(jié)果顯示，硬骨魚綱的種內(nèi)遺傳距離為0.11%，種間遺傳距離為24.87%；甲殼類的種內(nèi)遺傳距離為0.24%，種間遺傳距離為23.99%；多毛類的種內(nèi)遺傳距離為0.24%，種間遺傳距離為29.47%。

表3 各個(gè)分類級(jí)別遺傳距離

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化分析

本研究構(gòu)建的NJ 樹由58條序列構(gòu)成，在種的水平上，所有序列均與GenBank中的序列聚合，與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致。所有種類能夠聚為獨(dú)立分支，同種物種均能聚合在一起，同一物種的序列聚合后，再與同一屬的樣品序列聚合，同屬和同科的樣品序列均聚合在一起，同形態(tài)分類一致。在科以上階元中，NJ樹與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果不一致，各目未能完全聚合在一起，存在一定的交叉(見(jiàn)圖1)。

3 討論

傳統(tǒng)的形態(tài)分類物種鑒定過(guò)度依賴于鑒定者的個(gè)人能力和經(jīng)驗(yàn)，分類單元的表型可塑性也會(huì)加大錯(cuò)誤識(shí)別的概率[1]。DNA條形碼方法已被證明是1種有效的物種識(shí)別工具，尤其是對(duì)于損壞、不完整或由幾個(gè)形態(tài)學(xué)上不同階段組成的標(biāo)本，可以使物種鑒定過(guò)程實(shí)現(xiàn)信息化和標(biāo)準(zhǔn)化[25]。DNA 條形碼技術(shù)能夠準(zhǔn)確地鑒定形態(tài)相似種、隱存種以及處于不同生活史階段的物種，為海洋生態(tài)調(diào)查、物種遺傳進(jìn)化以及環(huán)境資源保護(hù)提供數(shù)據(jù)和支持。但是，DNA條形碼也有局限性，如在某些情況下，近緣物種序列相似度較大，可能會(huì)導(dǎo)致DNA條形碼無(wú)法識(shí)別而失敗。因此，DNA條形碼可以作為鑒定物種的輔助工具，但不能替代形態(tài)分類學(xué)分析[26]。本研究中，通過(guò)DNA條形碼鑒定，所鑒定的小公魚sp與島嶼小公魚(Stolephorusinsularis)的相似度為100%。但是根據(jù)《臺(tái)灣魚類志》[27]記載，島嶼小公魚(Stolephorusinsularis)分布于印度-太平洋熱帶海域，包括我國(guó)臺(tái)灣南、北、東北及西部近海，在我國(guó)東海未有記載。本次利用DNA條形碼鑒定出的島嶼小公魚(Stolephorusinsularis)值得探討，遺憾的是由于樣本個(gè)體過(guò)小，無(wú)法對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)的深入比較。出現(xiàn)該結(jié)果的原因可能有以下2個(gè)方面：一是因待測(cè)樣品同時(shí)與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中其他物種序列相似度相同，即種間界限不明顯，DNA片段難以將物種間的遺傳距離拉開，因而無(wú)法做出判定，需要借助其他序列輔助來(lái)綜合判定。利用DNA 條形碼技術(shù)雖然可以快速鑒別物種，但這項(xiàng)技術(shù)還需要結(jié)合傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定方法才能獲得準(zhǔn)確的種類序列，從而為DNA 條形碼鑒別工作累積有效的資料；另一方面，GenBank 是1個(gè)開放的共享數(shù)據(jù)庫(kù)，數(shù)據(jù)資料雖然豐富且龐大，但是其中的基因序列質(zhì)量良莠不齊，上傳者在進(jìn)行形態(tài)鑒定時(shí)也可能存在偏差，導(dǎo)致比對(duì)的序列同源性存在偏差。為了避免此情況，在此基礎(chǔ)上應(yīng)該使用其他的條形碼進(jìn)行輔助鑒定。

Hebert等[5]最早提出DNA條形碼的定義，以COI基因部分DNA序列作為物種分類指標(biāo)，種內(nèi)遺傳距離一定要小于種間距離，種間遺傳距離在2%以上，且是種內(nèi)遺傳距離的10 倍以上。本次研究中，硬骨魚綱的種內(nèi)遺傳距離為0.11%，種間遺傳距離為24.87%，種間遺傳距離約為種內(nèi)遺傳距離的226倍；甲殼類的種內(nèi)遺傳距離為0.24%，種間遺傳距離為23.99%，種間遺傳距離約為種內(nèi)遺傳距離的100倍；多毛類的種內(nèi)遺傳距離為0.24%，種間遺傳距離為29.47%，種間遺傳距離約為種內(nèi)遺傳距離的122倍。以上結(jié)果表明以COI基因進(jìn)行游泳生物鑒定是可行的。在構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹中，所有物種都能聚為獨(dú)立分支，且以屬、科作為分類單元均能在進(jìn)化樹上成功聚類，說(shuō)明DNA條形碼技術(shù)能成功應(yīng)用于游泳生物的鑒定。

本研究遵循：相似度>98%的序列為同一種類，90%～98%為同一屬，80%～89%為同一科的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)洞頭海域游泳生物進(jìn)行種類判定[1]。所獲物種獲得的COI基因的DNA片段與相應(yīng)基因的標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼進(jìn)行序列同源性比對(duì)，得到的比對(duì)結(jié)果相較于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定更為精準(zhǔn)。本研究根據(jù)DNA 條形碼的鑒定結(jié)果，共鑒定出了28種游泳生物，其中魚類19種，頭足類2種，甲殼類5種，多毛類1種，序列比對(duì)的相似度均大于98%，條形碼鑒定和形態(tài)學(xué)判別結(jié)果互相吻合，因而可精準(zhǔn)判別樣品所屬的物種，與預(yù)期結(jié)果一致。結(jié)果表明，該方法穩(wěn)定、精準(zhǔn)、易于操作，可應(yīng)用于物種鑒定，值得推廣。

本研究中還存在一些不足的地方需要改進(jìn)。例如有樣品的基因組DNA提取失敗，導(dǎo)致目的基因擴(kuò)增失敗，無(wú)法進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，因此未能獲得該物種的序列。該樣品在捕獲時(shí)未能及時(shí)進(jìn)行冰凍保存，在鑒定時(shí)出現(xiàn)反復(fù)凍溶的情況，可能因此導(dǎo)致基因組DNA降解嚴(yán)重。此外，為了避免腸道內(nèi)其他生物對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，一般只取背部肌肉來(lái)提取基因組DNA，由于一些稚魚個(gè)體較小，其肌肉組織非常少，提取過(guò)程中稍有操作不當(dāng)，即導(dǎo)致樣品基因組DNA提取失敗，未能獲得有效的基因組DNA。在今后的研究中需對(duì)操作進(jìn)行優(yōu)化，以提高實(shí)驗(yàn)的檢出率。

本研究基于COI基因的DNA條形碼分析能夠識(shí)別洞頭海域的的大部分游泳生物，其鑒定結(jié)果與形態(tài)鑒定結(jié)果相吻合。DNA條形碼技術(shù)已成功應(yīng)用于識(shí)別其他地理區(qū)域中的海洋魚類[1,28]。本研究建立了一個(gè)較可靠的洞頭海域的游泳生物DNA條形碼參考文庫(kù)，這將有助于更好地進(jìn)行該地區(qū)的漁業(yè)監(jiān)測(cè)、海洋生物資源保護(hù)和管理。

4 結(jié)論

基于COI基因的DNA 條形碼技術(shù)將隨機(jī)選取的29個(gè)樣品中的28個(gè)樣品準(zhǔn)確鑒定到種，表明COI基因序列適用于溫州海域游泳生物物種的分類鑒定。在形態(tài)學(xué)分類資料缺乏或樣品形態(tài)特征缺失的情況下，DNA 條形碼技術(shù)可以作為游泳生物鑒定的一種便捷有效的方式，同時(shí)可以用來(lái)對(duì)游泳生物形態(tài)學(xué)分類系統(tǒng)進(jìn)行補(bǔ)充和修訂。

由于COI基因的突變速率相對(duì)于線粒體DNA 控制區(qū)低，在鑒定分化程度較低的物種(如圓屬)時(shí)，利用COI序列無(wú)法準(zhǔn)確鑒定到種。為了更好地發(fā)揮DNA 條形碼技術(shù)在物種鑒定中的作用，DNA 條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)在數(shù)量和種類上亟需完善，以使物種鑒定更為精確。