王 衍，劉 洋，黃國(guó)慶，劉 敏，陳 浩，胡 瓊

（1.江蘇海洋大學(xué)，江蘇連云港222005；2.連云港磨圣如食品有限公司，江蘇連云港222100；3.連云港興菇生物科技有限公司，江蘇連云港222100）

長(zhǎng)期以來(lái)，食用菌液體菌種在我國(guó)沒(méi)有被廣泛推廣的主要原因之一是發(fā)酵條件與工藝技術(shù)的不成熟。國(guó)內(nèi)對(duì)液體菌種的研究大都停留在實(shí)驗(yàn)室階段，基本是使用三角瓶模擬食用菌發(fā)酵罐的生長(zhǎng)環(huán)境進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)[1]。近年來(lái)，液體菌種的生產(chǎn)伴隨著食用菌工業(yè)化發(fā)展取得了很大進(jìn)步[2-3]。食用菌規(guī)?；⒐S(chǎng)化的生產(chǎn)中50%以上已采用液體菌種生產(chǎn)方式，液體菌種通過(guò)工廠(chǎng)化設(shè)備流水線(xiàn)接種，最終產(chǎn)出菇品不僅效率高而且品質(zhì)佳[4]。但在具體實(shí)施過(guò)程中，仍會(huì)出現(xiàn)液體菌種活性和出菇產(chǎn)量不穩(wěn)定的現(xiàn)象，使較多規(guī)模小、風(fēng)險(xiǎn)承受能力低的中小型企業(yè)對(duì)液體接種技術(shù)望而卻步，限制了液體菌種的進(jìn)一步推廣應(yīng)用。該文根據(jù)和企業(yè)在食用菌種植及生產(chǎn)實(shí)際合作中的多年經(jīng)驗(yàn)及具體情況，以杏鮑菇的育種、栽培、培育為例，就食用菌接種方式由傳統(tǒng)固體向液體轉(zhuǎn)變過(guò)程中存在的主要問(wèn)題和關(guān)鍵技術(shù)研究展開(kāi)論述，以期為食用菌液體菌種的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供經(jīng)驗(yàn)借鑒。

1 接種技術(shù)對(duì)比分析

1.1 固體接種

固體接種為食用菌生產(chǎn)最初采用的主要接種手段，因?yàn)槎嗖捎弥l進(jìn)行，也叫作枝條接種法。目前，食用菌固體接種技術(shù)多為手工操作，由此存在勞動(dòng)強(qiáng)度大、人員密集程度高的問(wèn)題。對(duì)生產(chǎn)企業(yè)造成的主要影響是生產(chǎn)效率低、費(fèi)工費(fèi)時(shí)，且雜菌的污染率較高，同時(shí)由于固體接種法的科技含量低，無(wú)法較好地保證接種的質(zhì)量，對(duì)企業(yè)的正常生產(chǎn)會(huì)造成一些不可控的影響。固體接種在具體實(shí)施過(guò)程中，一般多選用木質(zhì)枝條形式，江蘇地區(qū)楊樹(shù)種植廣泛及楊樹(shù)枝條的優(yōu)良特性，接種枝條多選用楊樹(shù)枝條（圖1）。

圖1 固體接種用枝條

枝條式固體接種的前期準(zhǔn)備工作，主要包括對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌處理，添加固體狀菌種顆粒。這一工序在實(shí)際生產(chǎn)中耗時(shí)較長(zhǎng)，由于添加的菌種顆粒大小不一、很難確保培養(yǎng)基具有較好的均勻性，而且當(dāng)菌種顆粒的添加量達(dá)不到規(guī)定的設(shè)定值要求時(shí)，還會(huì)造成菌絲繁殖困難，大大增加培養(yǎng)時(shí)間。在正常固體菌種培養(yǎng)過(guò)程中，還要注意栽培器皿外其他菌類(lèi)的侵入，防范不當(dāng)會(huì)對(duì)食用菌菌絲的良性繁殖造成影響。當(dāng)采用枝條培養(yǎng)菌種時(shí)，要保證枝條與基料攪拌充分、均勻，然后將枝條裝入菌袋（底部應(yīng)有少許輔料），采用輔料將菌袋一端空隙部分填實(shí)，使得枝條表面留有少量輔料，最后采用套環(huán)對(duì)菌袋封口，隨即放入滅菌框進(jìn)行滅菌準(zhǔn)備。

1.2 液體接種

液體接種技術(shù)具有方便快捷、菌期短、一致性好、純度高、活力強(qiáng)等諸多優(yōu)勢(shì)[5-6]，已成為國(guó)內(nèi)外食用菌生產(chǎn)的主流接種手段。主要接種形式為表面接種方式、表面結(jié)合槍頭插入式接種方式、表面扎孔式接種法、袋壁內(nèi)噴射接種法、接種后搖動(dòng)接種法及自動(dòng)接種機(jī)接種法等。為適應(yīng)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，企業(yè)中多采用自動(dòng)接種機(jī)進(jìn)行液體接種，自動(dòng)接種機(jī)可連續(xù)完成自動(dòng)運(yùn)輸、定位、啟蓋、壓腳和噴射接種等多道工序作業(yè)，接種生產(chǎn)率可達(dá)7 000瓶/h[7]。另一方面，通過(guò)對(duì)多家食用菌企業(yè)的調(diào)研發(fā)現(xiàn)，企業(yè)引進(jìn)液體接種法以后，出現(xiàn)的最大問(wèn)題就是單瓶的出菇產(chǎn)量不穩(wěn)定，極大地影響了企業(yè)的成本和收益，已成為制約食用菌液體菌種技術(shù)進(jìn)一步推廣應(yīng)用的關(guān)鍵性技術(shù)問(wèn)題。

1.3 2種接種方式對(duì)比（表1）

表1 固體接種與液體接種優(yōu)缺點(diǎn)對(duì)比

2 液體菌種的培養(yǎng)及關(guān)鍵技術(shù)

2.1 工藝流程

相比于固體菌種，雖然液體菌種的制作和接種工藝較復(fù)雜，但其整個(gè)發(fā)菌周期較短，設(shè)備操作簡(jiǎn)便且效率也較高。該文結(jié)合公司生產(chǎn)實(shí)例，選擇杏鮑菇為研究對(duì)象，其具體工藝流程主要包括培養(yǎng)基制作及分裝環(huán)節(jié)、殺菌冷卻環(huán)節(jié)、入罐環(huán)節(jié)及最后接種環(huán)節(jié)（圖2）。

圖2 杏鮑菇液體菌種接種工藝流程

2.2 杏鮑菇培養(yǎng)基制作技術(shù)

2.2.1 杏鮑菇PDA試管培養(yǎng)基制作。根據(jù)食用菌液體菌種特點(diǎn)及實(shí)際生產(chǎn)要求，選用18 mm×180 mm的試管規(guī)格即可滿(mǎn)足要求。針對(duì)公司生產(chǎn)的產(chǎn)品主要為杏鮑菇，配方主要有：馬鈴薯100~200 g、葡萄糖10~20 g、瓊脂10~20 g、水800~1 000 mL、蛋白胨3~5 g、KH2PO42~3 g、MgSO41.0~1.5 g、pH取 自 然值，選擇硅膠塞進(jìn)行試管封口。

2.2.2 杏鮑菇母種培養(yǎng)基的制作。在以上配方選定之后，首先進(jìn)行材料蒸煮，將約1 000 mL的水置于鍋內(nèi)燒煮，待沸騰以后加入約200 g加工好的馬鈴薯繼續(xù)蒸煮20~30 min左右，通過(guò)紗布過(guò)濾后得到濾液。這一過(guò)程的關(guān)鍵是加水量，需要根據(jù)實(shí)際情況中的蒸發(fā)情況而定。下一步工序?yàn)榄傊芙饧把a(bǔ)水，經(jīng)過(guò)上述環(huán)節(jié)后補(bǔ)水約1 000 mL，沸騰后添加瓊脂，溶解后再次補(bǔ)水。期間需要加入適量的葡萄糖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、蛋白胨等。最后通過(guò)分裝、加棉塞、滅菌、洪綿塞、擺斜面等工序可完成杏鮑菇母種培養(yǎng)基的制作，其中關(guān)鍵步驟為分裝工序，需要注意避免培養(yǎng)液黏附在試管口，使得棉塞也被培養(yǎng)基黏附，這會(huì)增大整個(gè)培養(yǎng)基被污染的風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)而對(duì)后面工序產(chǎn)生影響。

2.2.3 PDA試管的接種及培養(yǎng)。PDA試管的接種過(guò)程應(yīng)在接種箱內(nèi)或者環(huán)境超凈的工作臺(tái)中進(jìn)行，關(guān)鍵環(huán)節(jié)在于接種管PDA空白斜面菌種試管間的無(wú)菌銜接，期間與火焰配合的灼燒方法和程度需要反復(fù)練習(xí)，確保效率的同時(shí)更要保證不被帶菌空氣污染。多采用恒溫箱進(jìn)行恒溫環(huán)境下的PDA試管培養(yǎng)，確保溫度恒定及避光要求，對(duì)于大多數(shù)菌類(lèi)而言，培養(yǎng)溫度一般介于22℃~25℃，對(duì)于草菇菌類(lèi)，溫度稍高約為35℃左右。

2.2.4 PDA試管母種的保藏。PDA試管母種需要專(zhuān)用的保藏設(shè)備，要求溫度穩(wěn)定、結(jié)霜較少，一般選用專(zhuān)用微生物菌種保藏冰箱。入藏的菌種培養(yǎng)間不能太久，以免菌種的活性被降低。同時(shí)確保試管棉塞沒(méi)有受潮、封口沒(méi)有破裂，需定期檢查，確保菌種水分適宜和未被污染。

2.2.5 搖瓶菌種的制作。針對(duì)杏鮑菇類(lèi)菌種，配方一般為：馬鈴薯100~200 g、葡萄糖5~10 g、白糖5~10 g、蛋白胨3~5 g、磷酸二氫鉀2~3 g、硫酸鎂1~1.5 g、水約800~1 000 mL、黃豆粉5~8 g、白糖20 g左右；搖瓶的制作流程一般為：稱(chēng)量、溶解→分裝→加棉塞→滅菌→烘干棉塞→冷卻等。然后選用三角瓶進(jìn)行接種，接種后將三角瓶置于磁力攪拌器上攪拌，轉(zhuǎn)速約為800~1 000 r/min即可，選擇適宜于菌種類(lèi)型的溫度區(qū)間，攪拌時(shí)間約為1~2 d；之后繼續(xù)將三角瓶置于旋轉(zhuǎn)搖床，搖床轉(zhuǎn)速約為120~150 r/min，搖轉(zhuǎn)時(shí)間約為4~6 d；當(dāng)三角瓶在搖床上的菌球濃度達(dá)標(biāo)后，再將三角瓶置于磁力攪拌器中，轉(zhuǎn)速約為1 000~1 300 r/min，時(shí)間為1~2 d，通過(guò)以上步驟可使搖瓶菌種具有合理的菌球及原始發(fā)菌點(diǎn)。

2.3 發(fā)酵罐培育罐體設(shè)計(jì)

相比于固體接種方式，液體接種需要特制的培育罐體——發(fā)酵罐（圖3），整個(gè)工作系統(tǒng)由罐體、壓力表、視鏡、安全閥、空氣過(guò)濾器、排氣閥、進(jìn)氣閥、加熱冷卻水進(jìn)出口等組成。依據(jù)生產(chǎn)企業(yè)要求，進(jìn)行固體接種向液體接種的生產(chǎn)轉(zhuǎn)變，選用的液體菌種發(fā)酵罐的罐體材料和其上閥門(mén)、管道、過(guò)濾器等材料皆采用優(yōu)質(zhì)不銹鋼，對(duì)罐體的內(nèi)部和外部都進(jìn)行拋光作業(yè)；發(fā)酵培育系統(tǒng)的攪拌方式為氣體環(huán)流形式，此種形式具有操作便捷、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[8]。罐體上的空氣過(guò)濾器選用高精度過(guò)濾器，確保絕對(duì)過(guò)濾，避免雜菌污染，液體菌種的滅菌和發(fā)酵培育過(guò)程都可以在發(fā)酵罐內(nèi)完成。過(guò)濾器分上下2個(gè)過(guò)濾器，拆裝方便，但目前此類(lèi)罐體主要的缺點(diǎn)是內(nèi)部清潔不易徹底，為解決這個(gè)問(wèn)題，在清洗罐體時(shí)先通入蒸汽，然后使用高壓水槍對(duì)罐體內(nèi)部，特別是對(duì)角落進(jìn)行沖洗，此種方法對(duì)罐體內(nèi)部具有良好的清洗效果。

圖3 發(fā)酵罐結(jié)構(gòu)

2.4 發(fā)酵罐內(nèi)部氣體輸送系統(tǒng)布置

氣體的輸送和壓縮設(shè)備統(tǒng)稱(chēng)為輸送機(jī)械，發(fā)酵罐內(nèi)部氣體輸送管道布置方式見(jiàn)圖4。杏鮑菇菌種為好氧菌，需要利用往復(fù)式空壓機(jī)向發(fā)酵罐中注入壓力為0.2~0.3 MPa的高壓空氣。往復(fù)式空壓機(jī)的工作原理類(lèi)似于往復(fù)泵的結(jié)構(gòu)，氣缸外面需要配備相應(yīng)的冷卻裝置，為保持正常、持續(xù)的供氣，一般選用水冷冷卻。

圖4 發(fā)酵罐內(nèi)部管道系統(tǒng)

2.5 發(fā)酵罐的電控系統(tǒng)設(shè)計(jì)

液體菌種的發(fā)酵罐電控系統(tǒng)主要包括主控箱體、控制開(kāi)關(guān)、LED顯示屏、報(bào)警器、集成儀表測(cè)控等部分組成。該系統(tǒng)具有溫度自控、工作時(shí)間、罐內(nèi)壓力自控的優(yōu)點(diǎn)控制界面示意圖（圖5）。

圖5 控制界面

2.6 液體菌種自動(dòng)接種技術(shù)

食用菌工廠(chǎng)化生產(chǎn)過(guò)程中，固體菌種接種方法存在工序間切換耗時(shí)長(zhǎng)、接種后菌種大小不均勻的問(wèn)題。尤其是當(dāng)菌種的充填量在設(shè)定量以下時(shí)，會(huì)造成栽培時(shí)菌絲在容器內(nèi)繁殖困難，進(jìn)而會(huì)耗費(fèi)較長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間。目前，隨著液體菌種快速占領(lǐng)市場(chǎng)，出現(xiàn)了較多的自動(dòng)接種設(shè)備，在提高接種工作效率的同時(shí)，可以精確調(diào)節(jié)單次的注菌量，確保接種容器內(nèi)的菌種數(shù)量穩(wěn)定、充足，相關(guān)全套設(shè)備可在市場(chǎng)上直接購(gòu)買(mǎi)。

根據(jù)接種要求及產(chǎn)業(yè)化水平，企業(yè)選擇購(gòu)買(mǎi)的自動(dòng)接種設(shè)備為浙江金華地區(qū)相關(guān)企業(yè)生產(chǎn)的液體菌種自動(dòng)接種機(jī)（圖6），接種機(jī)可自動(dòng)完成運(yùn)輸、定位、啟蓋、注菌、加蓋等工序。該設(shè)備一共購(gòu)買(mǎi)3臺(tái)，可形成70 000瓶/d的生產(chǎn)能力，完全滿(mǎn)足企業(yè)的實(shí)際需求。

3 實(shí)際應(yīng)用中存在問(wèn)題

該文從企業(yè)引進(jìn)液體接種技術(shù)后面臨的單瓶出菇產(chǎn)量不穩(wěn)定、整體菌菇產(chǎn)出量偏低的問(wèn)題出發(fā)，闡述造成這一現(xiàn)象的主要因素及應(yīng)對(duì)辦法。單瓶出菇產(chǎn)量直接決定了整個(gè)液體接種技術(shù)的菌菇產(chǎn)出量，也決定了企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，是企業(yè)經(jīng)營(yíng)成敗的關(guān)鍵。企業(yè)在引進(jìn)液體接種技術(shù)后，單瓶出菇產(chǎn)量起初沒(méi)有達(dá)到預(yù)期值，經(jīng)過(guò)調(diào)整后逐漸恢復(fù)至正常水平，現(xiàn)梳理總結(jié)發(fā)現(xiàn)存在的主要問(wèn)題。

3.1 專(zhuān)用設(shè)備匹配不規(guī)范

目前，國(guó)內(nèi)各地的液體接種設(shè)備和水平有較大差距，特別是在液體菌種的培養(yǎng)、自動(dòng)接種方面仍存在不足[9-11]。公司為實(shí)現(xiàn)自動(dòng)接種、提高生產(chǎn)效率，購(gòu)買(mǎi)了3臺(tái)自動(dòng)接種設(shè)備，短時(shí)間使用較好，連續(xù)使用超過(guò)1個(gè)月左右機(jī)器會(huì)出現(xiàn)卡機(jī)、注菌量不均勻和接種點(diǎn)偏移等問(wèn)題。經(jīng)檢測(cè)維修后，問(wèn)題主要是以下幾點(diǎn)：①操作順序隨意、不規(guī)范；②使用過(guò)程中保養(yǎng)不夠，長(zhǎng)時(shí)間使用超過(guò)1周左右需對(duì)關(guān)鍵部件做潤(rùn)滑、去污處理；③缺少對(duì)循環(huán)運(yùn)動(dòng)部件的預(yù)緊情況進(jìn)行檢測(cè)，預(yù)緊力不足或松動(dòng)后會(huì)出現(xiàn)注菌定位不準(zhǔn)、出現(xiàn)偏移的情形。以上問(wèn)題的發(fā)現(xiàn)，希望對(duì)菌菇類(lèi)企業(yè)在生產(chǎn)中遇到類(lèi)似問(wèn)題時(shí)提供方法借鑒。

圖6 液體菌種自動(dòng)接種機(jī)

3.2 產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)儲(chǔ)備不足

一方面，就企業(yè)生產(chǎn)而言，不僅要保證整個(gè)菌種培養(yǎng)直至出菇階段每個(gè)環(huán)節(jié)的良好銜接，而且還要實(shí)現(xiàn)企業(yè)的最低產(chǎn)業(yè)化指標(biāo)。從目前國(guó)內(nèi)食用菌的生產(chǎn)現(xiàn)狀來(lái)看，絕大多數(shù)環(huán)節(jié)都已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化或半自動(dòng)化的生產(chǎn)加工，但在菌包培育-出菇階段，由于育菇和出菇環(huán)境要求的不同，需要對(duì)菌包進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。這一階段的產(chǎn)業(yè)化設(shè)備較少，會(huì)產(chǎn)生大量的人員用工，這一過(guò)程也增加了菌菇生長(zhǎng)階段的不確定性風(fēng)險(xiǎn)，可見(jiàn)，如何實(shí)現(xiàn)菌包培育-出菇階段的自動(dòng)化轉(zhuǎn)運(yùn)或環(huán)境的自動(dòng)控制設(shè)計(jì)，進(jìn)一步降低成本，已成為食用菌生產(chǎn)企業(yè)急需解決的技術(shù)難題。

另一方面，國(guó)內(nèi)液體菌種實(shí)際產(chǎn)業(yè)化時(shí)間不長(zhǎng)，其關(guān)鍵的液體菌種產(chǎn)業(yè)化技術(shù)儲(chǔ)備也不夠充分，特別是液體發(fā)酵罐的產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)及高效率注菌設(shè)備，相關(guān)技術(shù)雖然在實(shí)驗(yàn)室階段已不存在技術(shù)瓶頸，但是在實(shí)際產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用中依舊存在較多技術(shù)問(wèn)題。

3.3 菌絲活性的隨機(jī)性波動(dòng)較大

與企業(yè)生產(chǎn)合作中發(fā)現(xiàn)，企業(yè)的關(guān)切點(diǎn)在于優(yōu)良菌種的選育，這也是菌類(lèi)企業(yè)的核心競(jìng)爭(zhēng)力，為此，許多企業(yè)不惜投入巨額資金與高校、研究院所進(jìn)行科研合作。在進(jìn)行液體菌種接種法的推廣中發(fā)現(xiàn)，即使選用同一型號(hào)的菌種，經(jīng)過(guò)育菇、出菇等作業(yè)后，采用液體菌種接種法得到的出菇產(chǎn)量也是不穩(wěn)定的，與固體接種法相比，單瓶產(chǎn)量偏低、隨機(jī)性波動(dòng)較大。初步分析后認(rèn)為，一方面需要進(jìn)一步調(diào)整培養(yǎng)基環(huán)境及育菇出菇階段生產(chǎn)參數(shù)，另一方面建議在菌種選育過(guò)程中，也要充分考慮液體菌種的技術(shù)特點(diǎn)和模式，盡量使得菌絲活性在各種環(huán)境下波動(dòng)性較小，以此獲得的液體菌種的單瓶出菇產(chǎn)量較穩(wěn)定，有利于產(chǎn)業(yè)化推廣。為提高液體菌種的單瓶出菇量，除了以上問(wèn)題以外，對(duì)于企業(yè)而言，還應(yīng)進(jìn)一步在優(yōu)質(zhì)菌種的選育上下功夫；在菌種培養(yǎng)、制作、發(fā)酵直至接種系列過(guò)程中，要嚴(yán)格執(zhí)行相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，并通過(guò)培養(yǎng)基檢測(cè)、鏡檢，保證接種、培養(yǎng)環(huán)境，杜絕污染雜菌的現(xiàn)象發(fā)生。

4 結(jié)語(yǔ)

該文結(jié)合實(shí)際中與企業(yè)的產(chǎn)學(xué)研合作，闡述了在食用菌栽培過(guò)程中，由固體接種轉(zhuǎn)變?yōu)橐后w接種過(guò)程中需要考慮的關(guān)鍵技術(shù)因素和需要具備的條件，就目前而言，面向液體菌種接種技術(shù)的專(zhuān)業(yè)性設(shè)備、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)及菌種菌絲的活性和產(chǎn)量不穩(wěn)定等因素是制約液體菌種推廣的關(guān)鍵因素，以期為食用菌液體菌種接種模式的推廣和完善高效的工廠(chǎng)化栽培技術(shù)提供良好的實(shí)踐借鑒。