畢聰，鄭如文，杜海泳，張俊華，江志強(qiáng)，何逸禧，廖彥，陳秀麗，彭維，姚宏亮，劉宏

1. 廣州白云山光華制藥股份有限公司，廣東廣州510285

2. 中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/廣東省中藥上市后質(zhì)量與藥效再評(píng)價(jià)工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510275

3. 廣東省生物資源應(yīng)用研究所，廣東廣州510260

小柴胡顆粒系廣州白云山光華制藥股份有限公司生產(chǎn)的名優(yōu)中藥品種，由柴胡、黃芩、半夏（姜制）、黨參、生姜、甘草、大棗等七味藥材組成，具有解表散熱、疏肝和胃功效，用于外感病、邪犯少陽(yáng)證［1］。小柴胡顆粒在治療病毒性傳染病方面具有顯著療效：2003 年被列入廣東省抗擊“非典”專用藥物［2-3］；2009 年用于抗擊全球“甲型流感”［4］；2013 年被廣東省衛(wèi)健委列入“登革熱診療指引”；2020 年被列入《廣東省新型冠狀病毒肺炎中醫(yī)藥治療方案（試行第二版）》［5］。然而，小柴胡顆粒作用靶點(diǎn)有哪些？其作用機(jī)制尚有待系統(tǒng)挖掘。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)以系統(tǒng)生物學(xué)和生物信息學(xué)為基礎(chǔ)，融合多向藥理學(xué)、計(jì)算生物學(xué)、網(wǎng)絡(luò)分析、分子對(duì)接［6］等多學(xué)科內(nèi)容，通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬構(gòu)建“藥物-靶點(diǎn)-通路-疾病”多層次網(wǎng)絡(luò)，整體探尋藥物與疾病間的關(guān)聯(lián)［7］。這與中藥整體作用的特點(diǎn)相契合，有利于解決中藥活性成分快速篩選、藥效靶點(diǎn)預(yù)測(cè)、配伍內(nèi)涵解析等關(guān)鍵問(wèn)題［8-10］，加速了中藥現(xiàn)代化、國(guó)際化進(jìn)程。

本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，通過(guò)篩選小柴胡顆粒的活性成分與作用靶點(diǎn)，分析作用靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行GO 功能、KEGG 通路富集，構(gòu)建小柴胡顆?；钚猿煞?靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，解析小柴胡顆粒的潛在作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 活性成分及作用靶點(diǎn)篩選

采用中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)（TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）分析平臺(tái)［11］，分別以“北柴胡”“黃芩”“甘草”“黨參”“大棗”“生姜”“半夏”為關(guān)鍵詞，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB） ≥30%、化合物類藥性（druglike，DL）≥0.18 為篩選條件［11-12］，獲取各味藥材化學(xué)成分及靶點(diǎn)。通過(guò)UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www. uniprot. org/）將篩選出的作用靶點(diǎn)蛋白翻譯成相應(yīng)基因，所有靶點(diǎn)設(shè)置為“Homo sapiens（人類）”。將所得化學(xué)成分與靶點(diǎn)相應(yīng)基因?qū)隒ytoscape 3.7.0（https：//cytoscape. org//），結(jié)合“Network Analysis”選擇度值（degree）≥10 的成分作為主要活性成分，各成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)為潛在作用靶點(diǎn)。

1.2 靶蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及hub基因篩選

利用STRING 平臺(tái)（https：//string-db. org/）［13］構(gòu)建小柴胡顆粒作用靶蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)模型，將蛋白種類設(shè)置為“Homo sapiens（人類）”進(jìn)行操作，最低相互作用得分設(shè)為中等置信度“medium confidence（0.4）”，其余保持默認(rèn)設(shè)置。下載PPI網(wǎng)絡(luò)模型“TSV”數(shù)據(jù)，導(dǎo)入Cytoscape3.7.0，進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)可視化分析。采用“cytoHubba”功能的“最大集團(tuán)中心性（maximal clique centrality，MCC）”算法分析，選擇得分前10的基因作為hub基因。

1.3 GO功能富集、KEGG通路分析

將靶點(diǎn)相應(yīng)基因?qū)隒ytoscape 3.7.0 中“ClueGO”［14］及“CluePedia”插件，更新數(shù)據(jù)庫(kù)，種類設(shè)置為“homo sapiens（人類）”，設(shè)置閾值P＜0.05，其他參數(shù)保持默認(rèn)，分別對(duì)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO （gene ontology） 功 能 富 集 分 析、KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）信號(hào)通路分析，并使用GraphPad可視化。

1.4 活性成分—靶點(diǎn)—通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將活性成分及靶點(diǎn)相應(yīng)基因?qū)隒ytoscape3.7.0，繪制活性成分—靶點(diǎn)—通路網(wǎng)絡(luò)圖［15］。每個(gè)節(jié)點(diǎn)（node）是基因、化合物或通路，節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間的連接（Edge）代表這些生物分子之間的相互關(guān)系。選擇度值和介數(shù)作為評(píng)價(jià)節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中重要性的拓?fù)鋮?shù)。度值（degree）表示網(wǎng)絡(luò)圖中節(jié)點(diǎn)之間的連接數(shù)目，度值越大說(shuō)明該化合物與多個(gè)靶點(diǎn)有關(guān)聯(lián)；介數(shù)（edge betweenness）是網(wǎng)絡(luò)中所有最短路徑中經(jīng)過(guò)該節(jié)點(diǎn)的路徑的數(shù)目與最短路徑總數(shù)的比值。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 活性成分及作用靶點(diǎn)篩選

通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)，在OB≥30%、DL≥0.18條件下共篩選出165 個(gè)化學(xué)成分和248 個(gè)作用靶點(diǎn)，結(jié)合Cytoscape 中“Network Analysis”所得各成分degree 值，最終篩選出82 個(gè)主要活性成分以及242 個(gè)潛在作用靶點(diǎn)， 結(jié)果見(jiàn)表1和表2。

由表1可知，小柴胡顆粒中關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)數(shù)量靠前的成分主要為槲皮素、山奈酚、木犀草素、漢黃芩素、柚皮素、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、黃芩素和黃芩苷等黃酮類成分，以及豆甾醇、β-谷甾醇等甾醇類成分，提示這些成分可能是小柴胡顆粒發(fā)揮療效的主要活性成分。由表2可知，小柴胡顆粒中關(guān)聯(lián)化合物數(shù)量靠前的靶點(diǎn)有PTGS2、AR、NOS2、PRSS1、PPARG、ESR1 等，這些靶點(diǎn)主要與細(xì)胞生長(zhǎng)、免疫、炎癥、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激等生物過(guò)程相關(guān)。

表1 小柴胡顆粒主要活性成分Table 1 The main active compounds of XCHG

續(xù)表

續(xù)表

2.2 靶蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)及hub基因

將242 個(gè)潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，隱藏獨(dú)立無(wú)連接的蛋白。應(yīng)用Cytoscape可視化PPI 網(wǎng)絡(luò)（圖1）并計(jì)算Hub 基因（圖2）。PPI 網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的顏色和大小代表度值的大小，邊的顏色和粗細(xì)代表蛋白之間作用關(guān)系的緊密性。圖3所示為排名前10的Hub基因，分別是VEGFA、JUN、 MAPK3、 AKT1、 MMP9、 IL6、 ALB、PTGS2、CXCL8、CASP3，結(jié)果提示這些靶點(diǎn)可能為小柴胡顆粒發(fā)揮作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

2.3 GO功能富集分析

按照生物過(guò)程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellular components，CC）和分子功能（molecular function，MF）的分類對(duì)小柴胡顆粒的242個(gè)潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行功能富集分析，列出顯著性最高的10 條作用靶點(diǎn)（圖3～5）。結(jié)果表明，潛在作用靶點(diǎn)在生物過(guò)程上，主要富集于response to organic substance（有機(jī)物反應(yīng)）、response to oxygencontaining compound（含氧化合物反應(yīng)）等，涉及對(duì)有機(jī)物、含氧化合物、化學(xué)刺激的應(yīng)答；在細(xì)胞組分上，主要富集于membrane raft （膜筏）、membrane microdomain（膜微區(qū)）、membrane region（膜區(qū)）等，涉及調(diào)控細(xì)胞膜筏、膜微區(qū)、質(zhì)膜區(qū)、突觸膜等；在分子功能上，主要富集于G protein-coupled amine receptor activity（G 蛋白偶聯(lián)胺受體活性）、ligand-activated transcription factor activity（配體激活轉(zhuǎn)錄因子活性）等，涉及G蛋白偶聯(lián)胺受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、核受體活性、腎上腺素受體活性等。對(duì)富集結(jié)果進(jìn)行功能分組（圖6）發(fā)現(xiàn)，小柴胡顆粒潛在作用靶點(diǎn)的GO 功能主要涉及調(diào)控種群增殖、有機(jī)物反應(yīng)、藥物作用、細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)、穩(wěn)態(tài)等。

表2 小柴胡顆粒主要作用靶點(diǎn)（關(guān)聯(lián)化合物數(shù)量≥10）Table 2 The main targets of XCHG（Number of related compounds≥10）

2.4 KEGG通路注釋分析

采用Cytoscape 對(duì)小柴胡顆粒的242 個(gè)作用靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路分析，列出前20條通路（圖7）。結(jié)果表明，20 條關(guān)鍵作用通路中50%與抗病毒密切相關(guān)， 包括human cytomegalovirus infection（人巨細(xì)胞病毒感染）、influenza A（甲型流感）、Epstein-Barr virus infection（EB 病毒感染）等；其他作用通路主要包括免疫及炎癥相關(guān)通路，例如PI3K-Akt pathway（磷脂酰肌醇3 激酶-蛋白激酶B信號(hào)通路）、MAPK pathway（絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路）、TNF pathway（腫瘤壞死因子信號(hào)通路）等，凋亡相關(guān)通路apoptosis（細(xì)胞凋亡）等，抗腫瘤相關(guān)通路pathways in cancer（癌癥通路）等，提示小柴胡顆粒具有廣泛的抗病毒功能，其機(jī)制可能與調(diào)控免疫炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、抗腫瘤等方面有關(guān)。

圖1 小柴胡顆粒潛在作用靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）圖Fig.1 The protein-protein interaction network of XCHG

圖2 靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)中Hub基因Fig.2 The Hub genes in the protein-protein interaction network

2.5 小柴胡顆?；钚猿煞帧悬c(diǎn)—通路網(wǎng)絡(luò)圖

將82 個(gè)活性成分、242 個(gè)潛在作用靶點(diǎn)基因、前10 條KEGG 通路導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0，構(gòu)建小柴胡顆?；钚猿煞帧悬c(diǎn)—通路網(wǎng)絡(luò)（見(jiàn)圖8）。其中，粉色代表活性成分，藍(lán)色代表作用靶點(diǎn)，綠色代表通路。節(jié)點(diǎn)的大小代表度值（degree）大小，邊的粗細(xì)與深淺代表介數(shù)（edge betweenness）大小。

3 討 論

前期藥理研究表明，小柴胡顆粒能在解熱抗炎［16-17］、調(diào)節(jié)免疫［18-20］、抗過(guò)敏、鎮(zhèn)痛［21-22］等方面發(fā)揮作用，具有顯著的抗病毒功效，同時(shí)能改善肝炎和肝纖維化、保護(hù)胃黏膜、促進(jìn)腸蠕動(dòng)。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)小柴胡顆粒主要活性成分有槲皮素、山奈酚、木犀草素、柚皮素、漢黃芩素、黃芩素、黃芩苷等黃酮類成分以及豆甾醇等甾醇類化合物，參與種群增殖、有機(jī)物反應(yīng)、藥物作用、細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)和穩(wěn)態(tài)等生物過(guò)程；小柴胡顆粒關(guān)鍵靶點(diǎn)包括VEGFA、JUN、MAPK3、AKT1、 MMP9、 IL6、 ALB、 PTGS2、 CXCL8、CASP3，主要通過(guò)調(diào)控human cytomegalovirus infection、influenza A、Epstein-Barr virus infection 等抗病毒相關(guān)通路， PI3K-Akt signaling pathway、MAPK signaling pathway、TNF signaling pathway 等炎癥、免疫相關(guān)通路，apoptosis 等凋亡相關(guān)通路，以及Pathway in cancer 等抗腫瘤通路，發(fā)揮解熱抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抗病毒等作用。

圖3 小柴胡顆粒潛在作用靶點(diǎn)的生物過(guò)程富集分析Fig.3 Biological process anlysis of potential targets of XCHG

圖4 小柴胡顆粒潛在作用靶點(diǎn)的細(xì)胞組分富集分析Fig.4 Cellular components anlysis of potential targets of XCHG

圖5 小柴胡顆粒潛在作用靶點(diǎn)的分子功能富集分析Fig.5 Molecular function anlysis of potential targets of XCHG

圖6 小柴胡顆粒GO功能富集分類圖Fig.6 Classification map of GO enrichment of XCHG

圖7 小柴胡顆粒潛在靶點(diǎn)的KEGG通路結(jié)果圖Fig.7 The KEGG pathways of potential targets of XCHG

抑制病毒感染方面，PI3K-Akt 信號(hào)通路與病毒內(nèi)吞作用、病毒復(fù)制過(guò)程密切相關(guān)［23］。Liu等［24］研究發(fā)現(xiàn)阻斷PI3K-Akt信號(hào)通路可以抑制病毒RNA 的合成與蛋白表達(dá)。Mizutani 等［25］發(fā)現(xiàn)JNK 和PI3K-Akt 信號(hào)通路對(duì)SARS（非典型性肺炎）病毒在Vero E6 細(xì)胞中建立持久性感染具有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，小柴胡顆?？赡芡ㄟ^(guò)調(diào)控PTEN、AKT 等關(guān)鍵基因的表達(dá)，調(diào)控PI3K-Akt 信號(hào)通路（圖9），從而進(jìn)一步調(diào)控病毒入侵宿主細(xì)胞及自我復(fù)制等一系列生物活動(dòng)。調(diào)節(jié)炎癥與免疫方面，SARS-CoV-2（新型冠狀病毒）可過(guò)度激活免疫系統(tǒng)，引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，小柴胡顆?？赡芡ㄟ^(guò)調(diào)控PI3K-Akt、MAPK、IL-17、TNF 等信號(hào)通路中的AKT、ERK、p38、NFκB、IKK 等關(guān)鍵基因以及抑制IL-1β、IFN-γ、IL-6、MMP-9等細(xì)胞因子，有效抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)控免疫應(yīng)答（圖9～11）。其中，IL-6、IL-1 可抑制病毒感染所致高熱，IL-8、MCP-1 與單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的趨化作用相關(guān)，IKKα 可影響T 細(xì)胞的免疫應(yīng)答，p38 與樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子相關(guān)。此外，IL-6、IL-8、MCP-1 急劇上升被認(rèn)為是SARS 感染出現(xiàn)重癥的征兆，小柴胡顆粒對(duì)這些靶點(diǎn)的潛在作用可能會(huì)降低患者的重癥率［26］。調(diào)控細(xì)胞凋亡方面，病毒在入侵的不同階段可抑制或促進(jìn)細(xì)胞凋亡，以實(shí)現(xiàn)病毒的大量增殖或侵染傳播。本研究發(fā)現(xiàn)，小柴胡顆粒可能通過(guò)調(diào)控PI3K-Akt、Apoptosis 等信號(hào)通路的CASP-3-7-8-9、Bcl-2、BAX、Fas-L 等關(guān)鍵基因來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡過(guò)程（圖12）。

圖8 小柴胡顆?；钚猿煞帧悬c(diǎn)—通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig.8 The active compound-target-pathway network of XCHG

圖9 小柴胡顆粒在PI3K-AKT信號(hào)通路中的作用靶點(diǎn)Fig.9 The targets of XCHG in PI3K-Akt signaling pathway

圖10 小柴胡顆粒在TNF信號(hào)通路中的作用靶點(diǎn)Fig.10 The targets of XCHG in TNF signaling pathway

圖11 小柴胡顆粒在MAPK信號(hào)通路中的作用靶點(diǎn)Fig.11 The targets of XCHG in MAPK signaling pathway

圖12 小柴胡顆粒在Apoptosis通路中的作用靶點(diǎn)Fig.12 The targets of XCHG in apoptosis

綜上所述，本研究明確了小柴胡顆粒在抑制病毒復(fù)制與入侵方面的作用優(yōu)勢(shì)，并解析了其調(diào)控機(jī)體炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、細(xì)胞凋亡、抗腫瘤的關(guān)鍵靶點(diǎn)及通路，這與小柴胡顆粒解表散熱、舒肝和胃的功效相契合，為其藥理機(jī)制解析及臨床合理用藥提供了依據(jù)。