張桂仙，高 麗，李正倫，張 米，謝 祺

云南省傳染病醫(yī)院檢驗科，云南昆明 650301

非結(jié)核分枝桿菌(NTM)是指除了結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和麻風(fēng)分枝桿菌以外的分枝桿菌[1]，機會性感染是此類菌的顯著特點。HIV感染者免疫功能低下，常合并各種機會性感染，合并NTM感染就是其中常見的合并感染之一，且已成為HIV感染者發(fā)病、就診、入院和死亡的重要原因之一[2]，快速檢測NTM有助于早期精準(zhǔn)治療HIV合并NTM感染患者?；蛐酒夹g(shù)是目前較為可靠的NTM鑒定技術(shù)，此方法可較精確地鑒別多種NTM，并可以排除卡介苗、結(jié)核分枝桿菌的影響[3]。本研究對本院2012年9月至2019年12月使用基因芯片技術(shù)進行NTM菌種鑒定的HIV感染者進行分析，探討適合本院NTM菌株鑒定的方法，以及HIV合并NTM感染的菌種分布和免疫特征。

1 資料與方法

1.1一般資料 將本院2012年9月至2019年12月收治的90例HIV合并NTM感染患者作為研究對象，分離NTM菌株90株。

1.2儀器與試劑 NTM菌種鑒定試劑由成都博奧晶芯生物有限公司生產(chǎn)；檢測儀器包括晶芯?ExtractorTM36核酸快速提取儀、BioMixerTMⅡ芯片雜交儀、Slide WasherTM8芯片洗干儀、晶芯?LuxScanTM10K-B微陣芯片掃描儀、美國ABI 7300 PCR擴增儀。CD4+T淋巴細胞檢測試劑由美國Becton-Dickinson公司生產(chǎn)；檢測儀器為美國Becton-Dickinson公司生產(chǎn)的FACSCalibur流式細胞儀。

1.3方法

1.3.1核酸提取 取1 mL菌懸液置入潔凈離心管中，12 000 r/min離心5 min，棄上清液；加入1 mL生理鹽水，渦旋振蕩混合均勻后12 000 r/min離心5 min，棄上清液；加入80 μL核酸提取液，渦旋振蕩混合均勻后轉(zhuǎn)入核酸提取管中，將核酸提取管置于晶芯?ExtractorTM36核酸快速提取儀上振蕩5 min；然后將核酸提取管置于95 ℃金屬浴5 min，5 000 r/min離心1 min。

1.3.2核酸擴增 取出PCR擴增試劑自然解凍，混勻后分別取18 μL加入每支擴增管中，然后加入2 μL核酸提取管中的核酸溶液，將擴增管放入PCR擴增儀中進行擴增。

1.3.3芯片雜交 取出雜交緩沖液，50 ℃加熱使其完全融化，充分混勻；將PCR產(chǎn)物置于PCR儀中95 ℃變性5 min；取擴增管加9 μL雜交緩沖液，再加入PCR產(chǎn)物6 μL，充分混勻，取雜交反應(yīng)混合物13.5 μL加入雜交芯片加樣孔中，置于BioMixerTMⅡ芯片雜交儀中50 ℃雜交2 h。

1.3.4洗滌、干燥及掃描 取出洗液原液20×SSC、10%SDS分別配制。洗液Ⅰ：依次將20×SSC(50 mL)、蒸餾水(440 mL)、10%SDS(10 mL)混合。洗液Ⅱ：將20×SSC(10 mL)與蒸餾水990 mL混合。開啟Slide WasherTM8芯片洗干儀進行洗滌甩干，開啟晶芯?LuxScanTM10K-B微陣芯片掃描儀進行結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定檢測，采用芯片判別系統(tǒng)進行結(jié)果判讀。

1.3.5CD4+T淋巴細胞檢測 使用含有乙二胺四乙酸二鉀或乙二胺四乙酸三鉀的真空采血管采集抗凝血標(biāo)本2 mL。取20 μL抗體(CD4/CD3/CD8/CD45)加入檢測管中，并加入患者標(biāo)本50 μL，混勻避光15 min，之后加450 μL紅細胞裂解液混勻，避光15 min后，打開FACSCalibur流式細胞儀，運行程序，進行CD4+T淋巴細胞計數(shù)。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用Excel2007統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)庫建立和數(shù)據(jù)錄入，采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1不同年齡HIV合并NTM感染患者性別情況比較 90例HIV合并NTM感染患者中男69例(76.67%)，女21例(23.33%)?！?0歲年齡組男女比例比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，其余各年齡組男性明顯多于女性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同年齡HIV合并NTM感染患者性別情況比較(n=90)

2.2NTM菌種鑒定結(jié)果 90株NTM經(jīng)基因芯片技術(shù)檢測為鳥分枝桿菌73株[81.11%(73/90)]，堪薩斯分枝桿菌6株[6.67%(6/90)]，龜膿分枝桿菌4株[4.44%(4/90)]，戈登分枝桿菌2株[2.22%(2/90)]，偶然分枝桿菌2株[2.22%(2/90)]，瘰疬分枝桿菌2株[2.22%(2/90)]，淺黃分枝桿菌1株[1.11%(1/90)]。在標(biāo)本類型中，痰液最多，占67.78%；糞便次之，占16.67%；灌洗液再次之，占3.33%；骨髓、尿液、腹水、血液、腦脊液標(biāo)本均占1.11%。見表2。

表2 90株NTM標(biāo)本類型及菌種分布情況

2.3CD4+T淋巴細胞檢測結(jié)果 CD4+T淋巴細胞<50個/μL的患者多為鳥分枝桿菌感染，占總?cè)藬?shù)的42.22%；堪薩斯分枝桿菌占4.44%。CD4+T淋巴細胞為50～<200個/μL的患者感染鳥分枝桿菌也居多，占總?cè)藬?shù)的28.89%。見表3。

表3 CD4+T淋巴細胞檢測結(jié)果

3 討 論

近年來，隨著HIV感染發(fā)病率的增加，HIV合并NTM感染的發(fā)病率也呈現(xiàn)快速上升趨勢[4-5]，嚴(yán)重威脅著HIV感染者的健康。由于NTM感染患者的相關(guān)臨床癥狀、體征及影像學(xué)表現(xiàn)等缺乏典型性，導(dǎo)致其容易被誤診為結(jié)核分枝桿菌感染，且病死率高[6]。羅氏培養(yǎng)是結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但用時較長，不利于早期快速診斷；萋尼抗酸染色具有快速、經(jīng)濟、簡便等優(yōu)點，且報告及時，當(dāng)天可取，但抗酸染色陽性是分枝桿菌屬獨有的特點，也不能作為結(jié)核分枝桿菌鑒定的絕對指征，只能作為初步提示，故臨床急需一種快速、經(jīng)濟、高效的檢測方法。基因芯片技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的一種新方法，是目前較為可靠的分子層面的NTM鑒定技術(shù)，此方法可較為精確地鑒別多種NTM，可用于結(jié)核病和非結(jié)核病的輔助診斷[7]。

本研究檢測的90例患者中，男性明顯多于女性(69/21,3.29∶1.00)，這可能與就診的患者以男性為主有關(guān)；30～<60歲中青年患者占較大比例(82.22%)，說明中青年HIV感染者是NTM的高發(fā)人群，發(fā)病人群趨于年輕化，已成為HIV合并NTM感染的高危人群。檢測的標(biāo)本類型主要以痰液為主67.78%(61/90)，HIV合并NTM感染臨床上以肺部感染最常見，這也是本研究中檢出NTM的標(biāo)本中痰液標(biāo)本所占比例較高的原因；糞便標(biāo)本次之，占16.67%(15/90)，腸道感染較肺部以外的其他部位感染更常見，并且均為鳥分枝桿菌感染，其他肺外標(biāo)本也有檢出NTM，但所占比例較低。本研究發(fā)現(xiàn)HIV合并NTM感染中，最多見的是鳥分枝桿菌感染[81.11%(73/90)]，其次是堪薩斯分枝桿菌感染[6.67%(6/90)]。在《伯杰細菌鑒定手冊》中，鳥分枝桿菌復(fù)合群和堪薩斯分枝桿菌均屬于緩慢生長分枝桿菌。在臨床治療上，鳥分枝桿菌感染需要抗菌藥物治療，治療時間長而且任務(wù)艱巨，堪薩斯分枝桿菌感染在治療效果上最好[8]，因此，臨床非常急需能快速、準(zhǔn)確鑒定出NTM的方法，以利于臨床醫(yī)師及時對患者確診，并采取針對性的治療方案。本院現(xiàn)使用的基因芯片菌種鑒定技術(shù)可檢測17種分枝桿菌，包括結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、鳥分枝桿菌、土分枝桿菌、草分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、偶然分枝桿菌、戈登分枝桿菌、淺黃分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、金色分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、不產(chǎn)色分枝桿菌、龜膿分枝桿菌等。各種體液標(biāo)本直接涂片，經(jīng)萋尼抗酸染色法檢測陽性或分枝桿菌培養(yǎng)陽性的標(biāo)本均可采用基因芯片技術(shù)進行鑒定，該技術(shù)從標(biāo)本采集到得出結(jié)果僅需2 d，大大縮短了檢測時間[9]。

艾滋病(AIDS)又稱獲得性免疫缺陷綜合征，是一種危害極大的傳染病，由HIV感染引起。CD4+T淋巴細胞是HIV感染最主要的靶細胞，HIV感染人體后，出現(xiàn)CD4+T淋巴細胞進行性減少，細胞免疫功能受損[10]，機體免疫力降低，免疫細胞亞群異?；罨?，誘導(dǎo)機體各器官或系統(tǒng)損傷，最終由于繼發(fā)感染導(dǎo)致患者死亡[11-12]。NTM被認為是HIV感染者常見的機會性感染病原體，尤其是CD4+T 淋巴細胞<50個/μL的患者更容易合并NTM感染[13]，鳥分枝桿菌感染通常發(fā)生于CD4+T 淋巴細胞<50個/μL的HIV感染者中[14]。本研究中CD4+T 淋巴細胞<50個/μL的患者感染鳥分枝桿菌最多，占總?cè)藬?shù)的42.22%；CD4+T淋巴細胞為50～<100個/μL的患者感染鳥分枝桿菌也居多，占總?cè)藬?shù)的15.56%；CD4+T淋巴細胞為100～<200個/μL的患者感染鳥分枝桿菌再次之，占總?cè)藬?shù)的13.33%；CD4+T淋巴細胞≥200個/μL的患者感染鳥分枝桿菌占總?cè)藬?shù)的10.00%。由此可見，隨著HIV感染者免疫力降低，感染鳥分枝桿菌的概率增加。早診斷和早治療可以修復(fù)HIV感染者受損的免疫功能，減少或避免機會性感染的發(fā)生，降低治療成本，提高生活質(zhì)量。

最常見的NTM是鳥分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、龜膿分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、偶然分枝桿菌，而NTM感染菌種和流行率隨地理位置變化而變化[15]。本院治療的HIV合并NTM感染患者中，最多見的是鳥分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、龜膿分枝桿菌、戈登分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、偶然分枝桿菌及淺黃分枝桿菌，在菌種和流行率上有一些特征。HIV感染率上升也促進了NTM感染率的升高，從而使人們越來越重視HIV合并NTM感染，NTM感染正在成為HIV感染患者發(fā)生肺內(nèi)外疾病的重要因素，能夠早期識別并治療NTM感染引起的疾病，有利于降低HIV合并NTM感染的發(fā)病率和病死率，減輕社會經(jīng)濟負擔(dān)[16]。

鳥分枝桿菌是本院HIV合并NTM感染的主要菌種。基因芯片技術(shù)能夠快速對NTM進行鑒定，是值得推廣的檢測NTM感染的方法。