沈若堅(jiān)，吳 群，郭奕超，邵文琦△，王蓓麗,2，郭 瑋,2

1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200032；2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院廈門(mén)醫(yī)院檢驗(yàn)科,福建廈門(mén) 361015

血清蛋白電泳能分離血清或體液中的不同分析物，有助于識(shí)別疾病過(guò)程相關(guān)的生物流體組分[1]。血清含有各種蛋白質(zhì)，其等電點(diǎn)均在pH值7.5以下，若置于pH值8.0以上的緩沖液電泳時(shí)均游離成負(fù)離子，再向正極移動(dòng)。由于其等電點(diǎn)、相對(duì)分子質(zhì)量和分子形狀各不相同，其電泳速度就不同，故可將血清中蛋白質(zhì)進(jìn)行區(qū)分[2]。血清蛋白電泳通常用于檢測(cè)異常增生的單克隆免疫球蛋白(M蛋白，也稱(chēng)為M-帶)以診斷和監(jiān)測(cè)骨髓瘤[3-5]，但還有其他一些用途往往被忽略[6]。血清蛋白電泳對(duì)于肝病、嚴(yán)重感染性疾病及慢性腎臟病等的診斷、鑒別診斷、病情發(fā)展的判斷有重要的意義[7]。發(fā)生肝炎時(shí)，γ帶所占比例明顯增加，肝硬化時(shí)出現(xiàn)“β-γ橋”現(xiàn)象；腎病綜合征時(shí)α2區(qū)帶所占比例明顯增加[8]。國(guó)外有許多學(xué)者對(duì)血清蛋白電泳進(jìn)行研究，有研究對(duì)第1代自動(dòng)化毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)其靈敏度、重復(fù)性都優(yōu)于瓊脂糖凝膠電泳，易于操作，適用于日常工作量較大的臨床實(shí)驗(yàn)室，但由于檢測(cè)M蛋白的特異度較低，可能會(huì)導(dǎo)致免疫固定分析的成本增加[9]。21世紀(jì)，Helena V8與Sebia Capillarys 2 Flex Piercing (C2)被廣泛應(yīng)用于各家實(shí)驗(yàn)室[10]。第2代電泳儀檢測(cè)速度較快，靈敏度較高(可檢測(cè)>0.3 g/dL M蛋白)，但特異度低于瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)總蛋白水平低或低球蛋白血癥患者的標(biāo)本常出現(xiàn)假陽(yáng)性。本研究對(duì)Sebia新一代毛細(xì)管電泳儀Sebia Capillarys 3 TERA(C3)進(jìn)行了血清蛋白電泳的性能驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 檢測(cè)儀器采用法國(guó)Sebia公司的Capillarys 3 TERA，試劑采用Sebia CAPI 3s Protein(E)6，試劑批號(hào)為PN2503，試劑盒包含700 mL緩沖液3瓶，濾器4個(gè)。

1.2檢測(cè)性能評(píng)價(jià)

1.2.1精密度驗(yàn)證 根據(jù)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局(SFDA)有關(guān)毛細(xì)管電泳儀醫(yī)療器械注冊(cè)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)，用同一批號(hào)試劑對(duì)Sebia公司提供的正常水平范圍內(nèi)定值血清蛋白質(zhì)控品(LOT:27047/01)重復(fù)檢測(cè)24次，計(jì)算批內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差(s)及變異系數(shù)(CV)；對(duì)任選的一個(gè)批號(hào)(LOT:27047/01)質(zhì)控品連續(xù)測(cè)試20 d，每天檢測(cè)1批次，檢測(cè)12根毛細(xì)管的批間s及CV。

1.2.2正確度驗(yàn)證 選用國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)臨床檢驗(yàn)中心2020年血清蛋白電泳室間質(zhì)量評(píng)價(jià)樣品(標(biāo)本編號(hào)202011、202012、202013、202014、202015)，每個(gè)水平樣品至少每天重復(fù)測(cè)定2次，連續(xù)測(cè)定5 d，記錄檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算全部檢測(cè)結(jié)果均值，判斷各項(xiàng)指標(biāo)均在給定的范圍內(nèi)。

1.2.3靈敏度驗(yàn)證 選擇M蛋白水平500 mg/dL的血清標(biāo)本，采用生理鹽水按梯度倍比稀釋?zhuān)钡窖鍢?biāo)本中的M蛋白峰不可分辨為止，記錄各梯度對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)和血清標(biāo)本水平，判斷M蛋白峰不可分辨前，最大稀釋倍數(shù)對(duì)應(yīng)的血清標(biāo)本水平是否小于或等于27 mg/dL。

1.2.4參考區(qū)間驗(yàn)證 選取隨機(jī)體檢標(biāo)本24份進(jìn)行血清蛋白電泳，剔除離群值，判斷是否均在預(yù)設(shè)參考區(qū)間之內(nèi)。

1.2.5線性范圍驗(yàn)證 根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)EP6-A操作指南，使用溶液(A)清蛋白(Alb)溶液(52.0 g/L)和溶液(B)γ球蛋白溶液(31.0 g/L)，按不同比例混合(100% A溶液+0% B溶液，90% A溶液+10% B溶液等......0% A溶液+100% B溶液)得到共11份不同水平的Alb和γ球蛋白混合物，每份混合物檢測(cè)Alb百分比3次，取均值，判斷理論值與實(shí)測(cè)值的線性。

1.2.6交叉污染驗(yàn)證 將樣品與蒸餾水共24份標(biāo)本交替安放在試管架上，計(jì)算平均值、最大誤差及相對(duì)誤差，若最大相對(duì)誤差≤ 5.2%，則交叉污染驗(yàn)證通過(guò)。

1.2.7儀器性能評(píng)價(jià) 計(jì)算實(shí)驗(yàn)室電泳崗位每日檢測(cè)標(biāo)本量、花費(fèi)人力數(shù)量、毛細(xì)管電泳儀數(shù)量、轉(zhuǎn)移標(biāo)本的時(shí)間及頻次，評(píng)估優(yōu)化血清蛋白電泳檢測(cè)流程。同時(shí)檢測(cè)80份標(biāo)本，比較C3與C2的檢測(cè)速率與檢測(cè)時(shí)間。

由于C2每份標(biāo)本需要人力推送(1 s)，而本實(shí)驗(yàn)室有4臺(tái)毛細(xì)管電泳儀，從第1臺(tái)走到第2臺(tái)用時(shí)1 s，到第3臺(tái)用時(shí)1.5 s，到第4臺(tái)用時(shí)2 s。每天需要檢測(cè)3 000份標(biāo)本，共計(jì)375架。每臺(tái)儀器滿(mǎn)負(fù)荷8架。每30分鐘共檢測(cè)約160份標(biāo)本。

由于新儀器沒(méi)有上述問(wèn)題。去除標(biāo)本插在架子上的時(shí)間，最后測(cè)算C3比C2節(jié)約多少時(shí)間。

2 結(jié) 果

2.1精密度驗(yàn)證 C3進(jìn)行血清蛋白電泳的批內(nèi)CV：Alb區(qū)帶<2%，α1球蛋白(α1)、α2球蛋白(α2)、β1球蛋白(β1)、β2球蛋白(β2)、γ球蛋白(γ)區(qū)帶<10%；批間CV：Alb區(qū)帶<2%，α1、α2、β1、β2、γ區(qū)帶<10%，均小于廠家提供的CV。見(jiàn)表1。

2.2正確度驗(yàn)證 正確度驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)表2，各項(xiàng)指標(biāo)均符合要求，正確度驗(yàn)證合格。

2.3靈敏度驗(yàn)證 血清蛋白電泳可見(jiàn)M蛋白尖峰的最大稀釋倍數(shù)為16倍，相應(yīng)標(biāo)本水平為16 mg/dL，最終患者標(biāo)本水平≤27 mg/dL且仍能明顯觀察到單克隆跡象，符合要求。

2.4參考區(qū)間驗(yàn)證 24份體檢標(biāo)本，剔除離群值后，檢測(cè)標(biāo)本均在預(yù)設(shè)參考區(qū)間之內(nèi)，符合參考區(qū)間驗(yàn)證要求。

表1 C3血清蛋白電泳的重復(fù)性、中間精密度驗(yàn)證結(jié)果

表2 正確度驗(yàn)證結(jié)果(%)

標(biāo)本編號(hào)β均值靶值允許范圍γ均值靶值允許范圍2020119.08.86.2～11.411.611.58.6～14.420201210.510.37.2～13.412.712.89.6～16.02020139.58.86.2～11.411.011.38.5～14.12020148.88.66.0～11.211.610.88.1～13.520201513.012.78.9～16.511.011.88.9～14.8

2.5線性范圍驗(yàn)證 從混合物中得到的每個(gè)區(qū)帶百分比與理論上每個(gè)區(qū)帶百分比完全符合，且使用CAPI 3 PROTEIN6程序可以根據(jù)線性檢測(cè)到任何變化，相關(guān)系數(shù)(r)=0.999 0，斜率為0.999 9，截距為-0.317 9。見(jiàn)表3。

表3 線性范圍驗(yàn)證結(jié)果(%)

續(xù)表3 線性范圍驗(yàn)證結(jié)果(%)

2.6交叉污染驗(yàn)證 樣品結(jié)果最大相對(duì)誤差≤5.2%，無(wú)交叉污染，見(jiàn)表4。

表4 交叉污染驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果(%)

2.7儀器性能評(píng)價(jià) 檢測(cè)流程變化結(jié)果見(jiàn)表5。C3的檢測(cè)速率約為每臺(tái)72份/h，C2的檢測(cè)速率約為每臺(tái)64份/h；同時(shí)檢測(cè)80份血清標(biāo)本，C3 TERA用時(shí)58 min 57 s，C2用時(shí)59 min 45 s；前7架血清標(biāo)本檢測(cè)速率：C2>C3，前10架血清標(biāo)本檢測(cè)速率：C2

表5 C3與C2檢測(cè)效率比較

表6 C3與C2血清蛋白電泳檢測(cè)時(shí)間比較

3 討 論

毛細(xì)管電泳是一種非常適用于臨床分離蛋白質(zhì)的技術(shù)。與臨床常用的色譜方法相比，主要優(yōu)點(diǎn)是分離效率更高，所需的樣品體積更小。毛細(xì)管電泳的臨床應(yīng)用廣泛，LATOSINSKA等[11]在研究毛細(xì)管電泳時(shí)發(fā)現(xiàn)，其與質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)合檢測(cè)對(duì)于泌尿系統(tǒng)疾病的診斷具有較高的靈敏度。多篇文獻(xiàn)報(bào)道，血清蛋白電泳的使用有助于常見(jiàn)疾病的篩查[12-13]。因此，由于檢測(cè)靈敏度較高，毛細(xì)管電泳儀在國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室的日常檢測(cè)中變得更加重要。

目前，CLSI沒(méi)有明確應(yīng)用于毛細(xì)管血清蛋白電泳的性能驗(yàn)證方案，國(guó)內(nèi)外也鮮有對(duì)于毛細(xì)管血清蛋白電泳的性能評(píng)價(jià)。劉素蘭等[14]曾對(duì)Sebia電泳儀及其配套試劑測(cè)定血清蛋白進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)用毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行血清蛋白電泳操作簡(jiǎn)便、圖譜清晰、分辨率高、重復(fù)性好、結(jié)果準(zhǔn)確。本研究對(duì)C3血清蛋白電泳進(jìn)行性能評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，C3檢測(cè)血清蛋白電泳具有良好的精密度、正確度、靈敏度、參考區(qū)間、線性范圍，無(wú)交叉污染，檢測(cè)性能符合臨床要求，對(duì)于異常增生的M蛋白的檢測(cè)靈敏度更高，最低檢測(cè)水平< 27 mg/dL。

與C2相比，C3的檢測(cè)優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在大批量血清標(biāo)本的檢測(cè)速度更快(每批次檢測(cè)12份血清標(biāo)本，每臺(tái)1 h可檢測(cè)約72份血清標(biāo)本)，檢測(cè)自動(dòng)化程度更高，檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確。由于C2每份標(biāo)本需要人力推送(1 s)，而本實(shí)驗(yàn)室有4臺(tái)毛細(xì)管電泳儀，從第1臺(tái)走到第2臺(tái)用時(shí)1 s，到第3臺(tái)用時(shí)1.5 s，到第4臺(tái)用時(shí)2 s，而C3具備靈活組合的聯(lián)機(jī)與自動(dòng)進(jìn)樣裝置，一臺(tái)進(jìn)樣器可配備多臺(tái)電泳儀器，因此僅需將標(biāo)本放置于進(jìn)樣裝置上即可，有效降低了人力成本。由于C3檢測(cè)大批量標(biāo)本時(shí)檢測(cè)速度較快，可減少相應(yīng)檢測(cè)人力與標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)頻次，檢測(cè)人員可在相同時(shí)間內(nèi)檢測(cè)更多標(biāo)本。除此以外，與舊系統(tǒng)相比，C3軟件的更新使操作人員一次性能瀏覽更多標(biāo)本，C3檢測(cè)系統(tǒng)更高的靈敏度及特異度使分析假陽(yáng)性率降低，分析疑難標(biāo)本更準(zhǔn)確。C3故障發(fā)生率低于C2。對(duì)于每日需要檢測(cè)大批量標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)室，C3能發(fā)揮最大的優(yōu)勢(shì)，功能方面優(yōu)化了開(kāi)機(jī)、關(guān)機(jī)、維護(hù)保養(yǎng)等功能，可以設(shè)定自動(dòng)開(kāi)關(guān)機(jī)，自動(dòng)定時(shí)保養(yǎng)等功能。

本研究不同于以往毛細(xì)管血清蛋白電泳性能評(píng)價(jià)的一點(diǎn)是全部性能驗(yàn)證項(xiàng)目的檢測(cè)都針對(duì)同一根毛細(xì)管，因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果更可靠。但本研究由于未引入多臺(tái)C3電泳儀，只能對(duì)一臺(tái)單機(jī)配一臺(tái)進(jìn)樣器的電泳流水線進(jìn)行檢測(cè)速度的評(píng)價(jià)，后續(xù)會(huì)在此基礎(chǔ)上對(duì)兩聯(lián)機(jī)配一臺(tái)進(jìn)樣器、三聯(lián)機(jī)配一臺(tái)進(jìn)樣器的電泳流水線進(jìn)行性能評(píng)估。