祝金波，王 敏，周 林，劉毓玲

湖北省武漢市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北武漢 430050

腎細(xì)胞癌是起源于腎實(shí)質(zhì)腎小管上皮的惡性腫瘤，其中透明細(xì)胞癌是最常見(jiàn)且惡性程度最高的類(lèi)型，透明細(xì)胞癌患者極易發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者預(yù)后差[1-2]。腎細(xì)胞癌的早期癥狀不明顯，大部分患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期，腎細(xì)胞癌采用放療、化療治療效果均不佳[3]。腎細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移是一個(gè)極其復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過(guò)程，具體機(jī)制尚不清楚，目前臨床尚未發(fā)現(xiàn)能對(duì)其進(jìn)行早期診斷及預(yù)后判斷的特異性指標(biāo)，因此，尋找早期診斷及治療的靶標(biāo)是腎細(xì)胞癌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。近些年研究人員發(fā)現(xiàn)微小RNAs(miRNAs)在腎細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中具有重要的作用[4-5]。miRNAs是長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA分子，它與生物體的細(xì)胞分化、發(fā)育、增殖、凋亡等多種生物學(xué)過(guò)程關(guān)系密切[6]。多項(xiàng)研究顯示，在腎細(xì)胞癌組織中能檢測(cè)到異常表達(dá)的miRNAs，miRNAs在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中均發(fā)揮著重要的作用[7-9]。本研究分析miR-122和miR-144-3p在腎細(xì)胞癌與癌旁組織中的表達(dá)差異，及其與病理分期、臨床分期等之間的關(guān)系，旨在為腎細(xì)胞癌的早期診斷、治療、預(yù)后判斷提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2017年2月至2019年2月46例在本院泌尿外科行腎臟切除術(shù)患者的腎細(xì)胞癌組織及其癌旁組織(距癌組織5 cm以上)，并保存于液氮中。所有患者均經(jīng)術(shù)后病理確診為腎細(xì)胞癌，且癌旁組織無(wú)癌組織浸潤(rùn)。46例患者中男32例，女14例；年齡25～70歲，平均(53.2±14.6)歲。組織學(xué)類(lèi)型的分類(lèi)采用世界衛(wèi)生組織2004年腎細(xì)胞癌的病理分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，臨床分期采用2009年國(guó)際抗癌組織和美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)的臨床分期標(biāo)準(zhǔn)。TNM分期：T1期26例，T2期17例，T3期2例，T4期1例。臨床分期：Ⅰ期26例，Ⅱ期17例，Ⅲ期2例，Ⅳ期1例。本研究通過(guò)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬均簽署了知情同意書(shū)。

1.2儀器與試劑 PRISM7000實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)；UV-2006型紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)。RNA提取試劑為T(mén)rizol試劑(美國(guó)invitrogen公司)；miRNA專(zhuān)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒及miScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)；其他常規(guī)試劑均為分析純。

1.3方法

1.3.1總RNA的提取 采用液氮研磨法將組織磨成粉末，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)的步驟加入Trizol試劑提取研磨后標(biāo)本中的總RNA，使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其水平，記錄吸光度值(A260)，所提取總RNA放置于-80 ℃冰箱保存待測(cè)。

1.3.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR) 按照miScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟操作。取1 μL總RNA加入20 μL反應(yīng)體系中，在PRISM7000實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將反應(yīng)體系設(shè)置為37 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min，合成cDNA，稀釋10倍后放置于—20 ℃保存待測(cè)。以U6 snRNA作為內(nèi)參，引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。樣品目的基因相對(duì)表達(dá)水平采用ΔΔCT方法計(jì)算，其中相對(duì)表達(dá)水平=2-ΔΔCT。

1.4觀察指標(biāo) 比較miR-122和miR-144-3p在癌組織與癌旁組織中的差異。 以腎細(xì)胞癌組織中miR-122、miR-144-3p的表達(dá)水平平均值作為分界，將46例患者分為miR-122低表達(dá)和miR-122高表達(dá)、miR-144-3p低表達(dá)和miR-144-3p高表達(dá)，并分析不同年齡、性別、臨床病理特征患者中miR-122和miR-144-3p的表達(dá)情況。

表1 RT-qPCR特異性引物

2 結(jié) 果

2.1癌組織和癌旁組織中miR-122和miR-144-3p的表達(dá)情況 miR-122和miR-144-3p在腎細(xì)胞癌患者癌組織和癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)水平見(jiàn)表2，miR-122和miR-144-3p在腎細(xì)胞癌患者癌組織中的相對(duì)表達(dá)水平均明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 miR-122和miR-144-3p表達(dá)水平比較

2.2不同特征患者 miR-122在癌組織中的表達(dá)情況 不同年齡、性別患者miR-122低表達(dá)和miR-122高表達(dá)百分率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。不同TNM分期、臨床分期患者miR-122低表達(dá)和miR-122高表達(dá)百分率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 不同特征患者 miR-122在癌組織中的表達(dá)情況[n(%)]

2.3不同特征患者miR-144-3p在癌組織中的表達(dá)情況 不同年齡、性別患者miR-144-3p低表達(dá)和miR-144-3p高表達(dá)百分率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。不同TNM分期、臨床分期患者miR-144-3p低表達(dá)和miR-144-3p高表達(dá)百分率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 不同特征患者miR-144-3p在癌組織中的表達(dá)情況[n(%)]

續(xù)表4 不同特征患者miR-144-3p在癌組織中的表達(dá)情況[n(%)]

3 討 論

腎細(xì)胞癌是我國(guó)目前發(fā)病率增長(zhǎng)最快的惡性腫瘤之一，其起病較隱匿，早期臨床癥狀不明顯，因此早期診斷困難，且患者預(yù)后不佳，存活患者生活質(zhì)量差。近年來(lái)，生物標(biāo)志物的研究成為熱點(diǎn)，為了改進(jìn)臨床診斷策略，提高疾病的治療效果，篩選新的腎細(xì)胞癌生物標(biāo)志物作為治療靶點(diǎn)引起了重視。已有研究顯示，miRNAs以多種信號(hào)途徑參與了腎細(xì)胞癌的調(diào)控[10-12]。有研究表明，miRNA在腎細(xì)胞癌和其他人類(lèi)惡性腫瘤中起著重要作用，腎細(xì)胞癌組織中也存在miRNA表達(dá)的異常[13-14]，本研究對(duì)新的腎細(xì)胞癌標(biāo)志物miR-122和miR-144-3p在腎細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義進(jìn)行探討，以期為腎細(xì)胞癌的臨床診斷提供新的思路和參考。

以往研究顯示，盡管大部分miRNAs在腎細(xì)胞癌中表達(dá)下調(diào)[15-16]，但是還是存在一些miRNAs的表達(dá)上調(diào)，如在腎細(xì)胞癌中miR-122的表達(dá)水平明顯上調(diào)[17]。作為一種特異性miRNAs，miR-122在脂肪和膽固醇代謝中發(fā)揮著重要作用。研究顯示，與癌旁組織相比，腎細(xì)胞癌組織中的miR-122表達(dá)上調(diào)，并且腎細(xì)胞癌組織中的miR-122水平與預(yù)后密切相關(guān)[18-21]。miRNA參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多種生理過(guò)程，miR-144位于染色體17q11.2，具有miR-144-3p和miR-144-5p兩種形式[22]。miR-144-3p可參與多種癌細(xì)胞的增殖、分化過(guò)程，能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞和膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移，發(fā)揮促癌基因的作用[23-25]。邱彬[26]的研究顯示，在裸鼠體內(nèi)miR-144-3p能促進(jìn)腎細(xì)胞癌的腫瘤形成和生長(zhǎng)，在腎細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。樓寧[27]的研究也顯示，miR-144-3p在腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平明顯高于正常組織。

本研究結(jié)果顯示，miR-122和miR-144-3p在腎細(xì)胞癌患者癌組織中的相對(duì)表達(dá)水平均明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。腎細(xì)胞癌組織中miR-122和miR-144-3p表達(dá)水平的高低與TNM分期、臨床分期關(guān)系密切，提示miR-122和miR-144-3p可能在腎細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

本研究為miR-122和miR-144-3p在腎細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展中的機(jī)制研究提供了新的思路和參考，miR-122和miR-144-3p有望成為腎細(xì)胞癌早期診斷和預(yù)后判斷的新標(biāo)志物。