李志江 牛江帥 李 忍 姜 鵬 鹿保鑫 張東杰 阮長青，2

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院1，大慶 163319)(北大荒現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)省級培育協(xié)同創(chuàng)新中心2，大慶 163319)(黑龍江省雜糧加工及質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心3，大慶 163319)(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院4，大慶 163319)

黑龍江省是我國重要的大豆產(chǎn)區(qū)，脂肪和蛋白質(zhì)等專用型大豆品種較多，但存在品種繁多亂雜、越區(qū)種植和混合種植等現(xiàn)象，嚴(yán)重影響了黑龍江省大豆的產(chǎn)量和質(zhì)量，導(dǎo)致品牌保護(hù)難、種植和食用安全性低等問題[1]。傳統(tǒng)的大豆品種鑒定，主要采用田間種植鑒定方法，但該方法時間長、效率低、工作量大、結(jié)果準(zhǔn)確性低，所需鑒定目標(biāo)性狀大都為數(shù)量性狀，受環(huán)境和品種同質(zhì)化影響較大，給大豆品種的準(zhǔn)確鑒定帶來一定困難[2,3]。在分子鑒定水平上，DNA指紋圖譜技術(shù)則具有高效準(zhǔn)確、不受環(huán)境條件影響和實驗操作簡單等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于植物品種真實性鑒定及純度檢測研究[2]。目前，廣泛應(yīng)用的DNA分子標(biāo)記主要包括限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、隨機擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)、擴(kuò)增酶切片段長度多態(tài)性(AFLP)、簡單序列重復(fù)長度多態(tài)性(SSR)和單核苷酸多態(tài)性(SNP)等。其中，SSR分子標(biāo)記具有數(shù)量豐富、多態(tài)性高、遺傳共顯性、譜帶擴(kuò)增穩(wěn)定、精度高、檢測時間短和技術(shù)成熟等特點，已廣泛應(yīng)用于植物品種鑒定及純度檢測的研究[4]。

目前，國內(nèi)已有學(xué)者采用SSR標(biāo)記技術(shù)鑒定大豆品種并構(gòu)建指紋圖譜，如徐海風(fēng)等[5]利用6對SSR引物對淮河以南地區(qū)26份菜用大豆品種(系)構(gòu)建指紋圖譜，將26份菜用大豆品種(系)逐一區(qū)分。高運來等[6]利用9對SSR引物，完全區(qū)分黑龍江省83份參試大豆品種并構(gòu)建了一套大豆品種的分子ID。何琳等[7]利用6對SSR引物鑒定了長江流域區(qū)域的42份參試大豆品種，并獲得唯一的分子ID。這些數(shù)據(jù)均為滿足大豆品種真實性鑒定的需求奠定了基礎(chǔ)，但采用SSR標(biāo)記并結(jié)合大豆群體關(guān)聯(lián)分析鮮有報道。本研究的目的是采用分子標(biāo)記技術(shù)，對黑龍江省75個大豆品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，并篩選與性狀關(guān)聯(lián)的SSR標(biāo)記，為大豆種質(zhì)資源真實性鑒定提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為保障黑龍江省優(yōu)質(zhì)大豆種植和食用安全提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試大豆

選用黑龍江省10個農(nóng)場和地區(qū)的75份品種為參試材料，具體信息見表1。

1.2 大豆DNA提取

取發(fā)苗至三葉一心期大豆葉片于2 mL離心管內(nèi)，-20 ℃過夜，加1 mL DNA提取液研磨成勻漿后，60 ℃水浴1 h，于12 000 r/min條件下離心5 min，取上清液備用。在上清液中加入等體積的氯仿，劇烈振蕩，再次離心取上清液。重復(fù)1次后，加入等體積的異丙醇，-20 ℃放置1 h，于12 000 r/min條件下離心5 min，棄上清液后加入500 μL 70%乙醇洗2次，風(fēng)干。加入100 μL TE緩沖液溶解，用于毛細(xì)管電泳檢測。

表1 黑龍江省10個農(nóng)場和地區(qū)的75份品種試樣信息

表2 SSR引物信息表

1.3 PCR擴(kuò)增及毛細(xì)管電泳檢測

從已發(fā)表文獻(xiàn)中選出多態(tài)指數(shù)高的SSR標(biāo)記引物，分布在15條染色體上的18對引物(如表2)。18對SSR標(biāo)記引物序列來源于Soybase(https://soybase.org/dlpages/)，由檢測公司完成PCR擴(kuò)增及毛細(xì)管電泳檢測。正式實驗前，隨機選取6個樣本對引物進(jìn)行預(yù)實驗，通過瓊脂糖電泳確定是否有目的擴(kuò)增產(chǎn)物，從而確定引物是否可用。

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.1 SSR毛細(xì)管電泳有效特異峰的判定方法

擴(kuò)增中容易出現(xiàn)影子峰干擾的問題，而影子峰是由Taq酶和SSR的特性決定的，基本上難以克服。雜合基因型的二倍體在理想情況下應(yīng)該是擴(kuò)增出2條等高的峰，但由于受擴(kuò)增條件、加樣的隨機誤差、DNA模板質(zhì)量及DNA濃度等因素的影響，致使擴(kuò)增出的兩峰不等高。對于雜合型的二倍體有效特異峰的判斷，采用小峰面積如果不及大峰面積的60%則判定為雜帶的標(biāo)準(zhǔn)，對于通過優(yōu)化擴(kuò)增條件的方法難以改善，以及無法判讀的位點進(jìn)行舍棄。

1.4.2 標(biāo)記基因型的數(shù)據(jù)分析

通過PowerMarker V3.0得到每個SSR分子標(biāo)記的多樣性信息[8]，如多態(tài)性百分比、最小等位基因頻率/位點、等位基因數(shù)/位點、有效等位基因數(shù)/位點、等位基因型數(shù)/位點、基因多樣性/位點、多態(tài)性信息含量/位點和多樣性指數(shù)/位點等，基于位點多樣性信息的平均水平來評估群體遺傳多樣性。

1.4.3 群體關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)分析

利用Structure V2.3.4軟件進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析[9]。參數(shù)設(shè)置為：K值選取1～10，重復(fù)次數(shù)為5；將MCMC(Markov chain monte carlo)開始時的不作數(shù)迭代設(shè)為100 000次，再將不作數(shù)迭代后的MCMC設(shè)為1 000 000次，其余參數(shù)采用軟件默認(rèn)的設(shè)置。根據(jù)lnP(D)計算ΔK，依據(jù)ΔK值選擇一個合適的K值，并得到該K值對應(yīng)的Q矩陣。將Clump軟件分析的結(jié)果傳遞給Distruct軟件生成Q值條形堆積圖。然后利用Tassel V2.1軟件[10]將基因型數(shù)據(jù)生成親緣關(guān)系矩陣(K矩陣)，結(jié)合等位變異數(shù)據(jù)、基因型數(shù)據(jù)、各個環(huán)境的表型值、Q矩陣，利用混合線性模型MLM(Mixed linear model)進(jìn)行性狀和標(biāo)記之間的關(guān)聯(lián)分析，并計算標(biāo)記位點在P<0.05和P<0.01時對表型變異的貢獻(xiàn)率(R2)。在已獲得關(guān)聯(lián)位點的基礎(chǔ)上，再進(jìn)行優(yōu)異等位變異的發(fā)掘，通過對SSR位點等位變異表型效應(yīng)計算，最終獲得與表型性狀顯著關(guān)聯(lián)的位點。最后通過PowerMarker V3.0計算基于等位基因頻率的遺傳距離，采用鄰位相連(Neighbor-Joining, NJ)法進(jìn)行聚類分析，并輸出聚類樹[11]。

2 結(jié)果與分析

由于SSR擴(kuò)增中容易出現(xiàn)影子峰干擾以及非特異峰的問題，需要對有效特異峰進(jìn)行判定。以Satt233標(biāo)記的結(jié)果為例，在圖1a中，箭頭所指的峰為有效特異峰；圖1b中，箭頭所指的2個峰面積接近，且小峰面積超過大峰面積的60%，視為有效特異峰。

表3 42個大豆品種二進(jìn)制身份證

圖1 SSR擴(kuò)增片段有效特異峰型的判定

2.2 大豆品種指紋編碼的構(gòu)建

根據(jù)毛細(xì)管電泳檢測結(jié)果，對每個SSR分子標(biāo)記有效譜帶的“有”或“無”采用“1”或“0”進(jìn)行系統(tǒng)記錄，構(gòu)建大豆品種的二進(jìn)制指紋編碼。構(gòu)建了10個單一SSR標(biāo)記區(qū)分42個大豆品種的身份證(表3)，其中Satt100和Sat_128的鑒別能力最強，分別能夠鑒定出7個品種。個別品種能夠被多個標(biāo)記鑒定出來，如北億901和6 088。另33個大豆品種需多個SSR標(biāo)記共同區(qū)分。

2.3 群體遺傳多樣性分析

采用18個SSR分子標(biāo)記對75份大豆品種進(jìn)行多樣性分析，各位點等位變異的數(shù)目從3(Satt387)～12個(Satt100)，平均每個位點等位變異數(shù)為7.333個。各位點多態(tài)信息量(PIC)從0.146(Sat_084)～0.675(Satt442)，平均多態(tài)信息含量為0.405(表4)。其中，PIC可以用來衡量基因變異程度的高低，一般認(rèn)為，當(dāng)PIC<0.25 時，為低度多態(tài)性信息引物，當(dāng)0.250.50 時為高度多態(tài)性信息引物。因此，Satt514、Satt100、Satt442、Satt369、Sat_222和Satt295為高度多態(tài)性信息引物。

表4 大豆遺傳多樣性分析統(tǒng)計表

表5 相關(guān)性狀與標(biāo)記關(guān)聯(lián)情況

2.4 群體結(jié)構(gòu)分析

通過Structure軟件對75份大豆品種的種群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，最顯著的ΔK變化出現(xiàn)在K從2～3時，峰值出現(xiàn)在K為3時(圖2a)。根據(jù)確定的K值和Clump合并的Q矩陣，經(jīng)Cluster軟件分類后生成Q值條形堆積圖。不同的序號區(qū)域表示不同的“血統(tǒng)”，或意味著該大豆來源于不同的祖先群體。結(jié)果顯示，本研究的大豆群體大體上可以分為3個亞群，而種群內(nèi)部，品種間存在著基因頻率的差異(圖2b)。

圖2 大豆群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

2.5 性狀的位點關(guān)聯(lián)分析

在群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果中，選取K=3的10個重復(fù)中P值較大的Q矩陣進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。利用Tassel V2.1軟件，采用混合線性模型(MLM)對18個SSR標(biāo)記與4個大豆相關(guān)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果顯示，共鑒定出與性狀顯著關(guān)聯(lián)的5個SSR標(biāo)記，涉及了4個SSR標(biāo)記(表5)。其中，2個SSR標(biāo)記(Satt175和Satt100)與脂肪存在顯著關(guān)聯(lián)，標(biāo)記主要分布于6和7號染色體上；2個SSR標(biāo)記(Satt514和Satt294)與百粒重存在顯著關(guān)聯(lián)，標(biāo)記主要分布于4和17號染色體上，其中Satt294與百粒重和水分均存在顯著關(guān)聯(lián)。不同大豆品種在百粒重、蛋白質(zhì)、水分和脂肪性狀上的平均值為(18.94±1.74) g、34.67%±0.93%、10.24%±0.78%和18.2%±0.55%，變異系數(shù)分別為0.159、0.046、0.132和0.053。

3 討論

目前，雖然利用SNP進(jìn)行基因分型的研究較多，且在基因組上SNP比SSR數(shù)量多，但是與SNP相比，SSR的突變頻率會高于SNP且蘊含的信息也更豐富。所以目前SSR廣泛的用于基礎(chǔ)和應(yīng)用研究領(lǐng)域中[13]。關(guān)于大豆遺傳多樣性的研究很多[6,7,14-17]。在本研究中，選取的18對多態(tài)性較高的SSR引物中10個單一SSR標(biāo)記可區(qū)分42個品種，明顯低于高運來等[6]篩選出的9對引物和徐冬雪等[14]篩選出的3對引物所鑒別出來的品種數(shù)量，說明本研究中所涉及75個品種的遺傳多樣性相對較低。

為進(jìn)一步揭示該研究群體大豆的群體分化與親緣關(guān)系，基于Nei’s遺傳距離利用鄰位連接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建了圖3的系統(tǒng)發(fā)育樹。對比基于Structure軟件和 NJ聚類2種方法進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果，2種方法均顯示75份大豆基因型基本上可以分為3個群體，但是2種方法分出的3個亞群組成上有所差異。造成這種差異的主要原因是兩者分類的依據(jù)不同，相比之下，基于數(shù)學(xué)模型的群體遺傳結(jié)構(gòu)分類比基于材料間的遺傳距離的聚類分析更加精確[18]。而群體結(jié)構(gòu)劃分不合理時，極易造成標(biāo)記與性狀之間的偽關(guān)聯(lián)[19]。本研究中利用Structure軟件將材料分為了3個群體，這樣可以更加精確地進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。

關(guān)聯(lián)分析是目前國際植物基因組學(xué)研究中發(fā)掘作物優(yōu)異基因的重要方法之一，是利用隨機且均勻分布于基因組的標(biāo)記信息來估計群體內(nèi)部個體間的遺傳關(guān)系，并作統(tǒng)計假設(shè)檢驗進(jìn)行基于群體的關(guān)聯(lián)分析[19]。該分析不需要構(gòu)建群體和遺傳圖譜，省去了大量的工作，同時也可以通過該方法發(fā)現(xiàn)優(yōu)異基因，為遺傳育種提供依據(jù)[18]。本實驗用Tassel V2.1軟件采用MLM混合模型對18個SSR標(biāo)記與4個大豆農(nóng)藝性狀進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。MLM 混合模型較好地控制了一般線性模型(General linear model，GLM )的錯誤，降低了假陽性的概率[19]。本研究中發(fā)現(xiàn)了4個與性狀相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記，Satt175、Satt100、Satt514和Satt294。王海濱[20]利用已定位的6對與大豆蛋白質(zhì)和脂肪含量相關(guān)的SSR標(biāo)記對180份大豆材料進(jìn)行高油檢測時，發(fā)現(xiàn)Satt100檢測符合度可以達(dá)到87.80%，與本研究結(jié)果一致。

圖3 基于Nei’s遺傳距離繪制的NJ樹

4 結(jié)論

通過SSR分子標(biāo)記技術(shù)對黑龍江省75份大豆品種進(jìn)行遺傳多樣性、群體遺傳結(jié)構(gòu)以及性狀與分子標(biāo)記關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果顯示，各位點等位變異的數(shù)目變化從3(Satt387)～12個(Satt100)，平均每個位點等位變異數(shù)為7.333個，各位點多態(tài)信息量變化從0.146(Sat_084)～0.675(Satt442)，平均多態(tài)信息含量為0.405。并初步構(gòu)建了10個單一SSR標(biāo)記鑒定42份大豆品種(系)的DNA指紋圖譜。群體結(jié)構(gòu)分析將該研究群體分為3個亞群。通過關(guān)聯(lián)分析共鑒定到與脂肪、百粒重和水分等性狀相關(guān)的4個SSR標(biāo)記，分別為Satt175、Satt100、Satt514和Satt294。最終基于Nei's(1973)遺傳距離，構(gòu)建了75份材料的系統(tǒng)進(jìn)化樹，明確品種間親緣關(guān)系遠(yuǎn)近。