徐維春, 侯文意, 賴維, 鄭躍

1.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院粵東醫(yī)院,廣東 梅州 514700；2.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院皮膚科，廣東 廣州 510620

皮膚光老化(慢性光損傷)是由于長(zhǎng)期暴露于紫外線輻射所引起的皮膚損害，不僅影響容貌，還可造成皮膚完整性及免疫系統(tǒng)的損害，引發(fā)光線性肉芽腫等多種光相關(guān)疾病，甚至可導(dǎo)致基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌和惡性黑素瘤等皮膚腫瘤[1]，但具體機(jī)制目前未明。有研究發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶D(cathepsin D)在慢性光損傷皮膚中的表達(dá)減少[2]，cathepsin D凝膠可以增加角質(zhì)層中組織蛋白酶D的含量，修復(fù)重復(fù)光損傷皮膚的表皮屏障[3]，但在皮膚慢性光損傷過(guò)程中，cathepsin D上游非編碼RNA(non-coding RNA， ncRNA)調(diào)控機(jī)制，以及如何能更穩(wěn)定、高效、特異地調(diào)控cathepsin D來(lái)防止皮膚慢性光損傷的發(fā)生，目前仍不清楚。本研究篩查慢性光損傷皮膚細(xì)胞中對(duì)cathepsin D具有調(diào)控作用的長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, LncRNAs)，并探討其在皮膚光老化機(jī)制中的作用，為進(jìn)一步揭示皮膚光老化中非編碼RNA的網(wǎng)絡(luò)作用機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 皮膚成纖維細(xì)胞 來(lái)自中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院泌尿外科3例兒童(5～7歲)包皮環(huán)切術(shù)后包皮組織。本研究通過(guò)中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)[2016]2- 44)，患兒家屬均簽署知情同意書(shū)。

1.1.2 試劑和儀器 DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液(PBS)、青-鏈霉素(美國(guó)Gibco公司)，細(xì)胞衰老半乳糖苷酶(SA-β-Gal)試劑盒(美國(guó)Cell signaling technology公司)，細(xì)胞凋亡試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司),RNA檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Agilent Technologies公司)，核酸純化試劑盒(北京艾德科技有限公司)，二代測(cè)序 RNA 文庫(kù)制備試劑盒(美國(guó)Beckman Coulter公司)。UVA紫外線照射儀(Sigma SS-03A，燈管為Philips UVATLl0RS，波長(zhǎng)320～400 nm)、UVA照射計(jì)(上海希格瑪高科技有限公司)，NanoPhotometer?分光光度計(jì)(美國(guó)IMPLEN公司)，熒光定量?jī)x Qubit?3.0 Flurometer。

1.2 方法

1.2.1 原代皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng) 取兒童包皮，參照文獻(xiàn)[4]分離培養(yǎng)皮膚成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)至第3代凍存，取細(xì)胞復(fù)蘇后10代以內(nèi)的細(xì)胞行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 建立皮膚成纖維細(xì)胞慢性光損傷模型 細(xì)胞分為UVA照射組(連續(xù))和空白對(duì)照組(不照射),將3～6代成纖維細(xì)胞按1×106/皿接種于直徑6 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿，待細(xì)胞長(zhǎng)到70%融合時(shí)，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌2次后，加2 mL PBS。參照文獻(xiàn)[4-6]，將UVA照射組細(xì)胞置于UVA輻照儀下，細(xì)胞距離光源15 cm，平均照射功率為12.7 mW/cm2，設(shè)置單次照射時(shí)間為780 s，照射劑量為9.9 J/cm2，照射結(jié)束后PBS洗滌1次，加入2 mL的DMEM培養(yǎng)基，每24 h照射1次，連續(xù)照射14 d。空白對(duì)照組細(xì)胞加入PBS后置于超凈臺(tái)避光，在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)14 d。

1.2.3 β-半乳糖苷酶染色檢測(cè)細(xì)胞老化率 末次UVA照射后48 h去除DMEM培養(yǎng)基，PBS洗滌1次，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞老化。顯微鏡下觀察結(jié)果，老化細(xì)胞胞質(zhì)被染成藍(lán)色，每皿至少計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 末次UVA照射后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞為1×106/mL。每組取1 mL細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌3次后細(xì)胞重懸于200 μL結(jié)合緩沖液。加入10 μL膜聯(lián)蛋白V異硫氰酸熒光素及10 μL碘化丙錠，4 ℃反應(yīng)30 min。加入300 μL結(jié)合緩沖液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率(早期凋亡率+晚期凋亡率)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.2.5 表達(dá)基因譜建庫(kù) 對(duì)UVA照射組和空白對(duì)照組細(xì)胞，分別使用RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，將全部基因完整轉(zhuǎn)錄為總RNA，使用分光光度計(jì)檢測(cè)樣品的純度和粗濃度，隨后熒光定量檢測(cè)RNA樣品準(zhǔn)確濃度，RNA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)RNA樣品完整性。上述檢測(cè)合格后，對(duì)照組及UVA照射組使用DNase Ⅰ處理，去除rRNA以富集mRNA和non-coding RNA，富集的mRNA和non-coding RNA隨機(jī)打斷成短片段(200～500 bp), 以打斷后的短片段為模板，用六堿基隨機(jī)引物合成cDNA第一鏈，在合成cDNA第二鏈時(shí)，用dUTP替代dTTP, 然后合成的cDNA經(jīng)過(guò)末端修復(fù)、加A、加測(cè)序接頭后，加入U(xiǎn)NG(Uracil-N-Glycosylase) 降解第二鏈，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小選擇后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后建好的測(cè)序文庫(kù)用Illumina 測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.2.6 差異表達(dá)LncRNA檢測(cè) 參照Audic S.等[7]基于測(cè)序的差異基因檢測(cè)方法檢測(cè)差異表達(dá)的LncRNA基因。將得到的P值進(jìn)行多重假設(shè)檢驗(yàn)校正，通過(guò)控制 FDR 來(lái)決定P值的閾值。

1.2.7 LncRNA功能注釋分析 采用Gene Ontology(GO) database (http:∥www.geneontology.org)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)的LncRNA進(jìn)行注釋分析，提取可調(diào)控cathpeisn D的LncRNA。

1.2.8 LncRNA-miRNA調(diào)控檢測(cè) 用miRanda (http:∥www.microrna.org/)和TargetScan (http:∥www.targetscan.org/)生物學(xué)軟件對(duì)慢性紫外線損傷細(xì)胞miR4298進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證，并對(duì)LncRNAs可靶向作用的miRNA預(yù)測(cè)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件，UVA照射組與空白對(duì)照組間細(xì)胞活性、細(xì)胞老化率、凋亡率比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 皮膚成纖維細(xì)胞慢性光損傷模型的建立

UVA照射組細(xì)胞體積變大，細(xì)胞內(nèi)顆粒增多，出現(xiàn)慢性光損傷表型(圖1)。CCK8檢測(cè)結(jié)果顯示UVA照射組細(xì)胞活性[(60.02±5.13)%]明顯低于對(duì)照組[(89.06±4.21)%]，t=2.31,P<0.05。 β半乳糖苷酶染色結(jié)果顯示，UVA照射組細(xì)胞老化率[(85.24±4.21)%]高于對(duì)照組[(8.16±1.62)%]，t=3.22,P<0.05，見(jiàn)圖2。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率結(jié)果顯示，UVA照射組細(xì)胞凋亡率[(26.04±7.42)%]高于對(duì)照組[(11.31±4.95)%]，t=3.54,P<0.05，見(jiàn)圖3。

圖1 UVA照射組細(xì)胞(1A)與對(duì)照組細(xì)胞(1B)相比，體積變大，細(xì)胞內(nèi)顆粒增多，胞質(zhì)藍(lán)染，出現(xiàn)慢性光損傷表型Fig.1 Compared with the control group (1B), UVA group (1A) cells had larger volume, more intracellular granules, blue staining of cytoplasm, and chronic light damage phenotype.

圖2 UVA照射組細(xì)胞(2A)較對(duì)照組細(xì)胞(2B)β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性率增高Fig.2 The positive rate of β-galactosidase staining in UVA group (2A) was higher than that in control group (2B).

圖3 流式細(xì)胞檢測(cè)示UVA照射組(3A)細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組細(xì)胞(3B)增高Fig.3 Flow cytometry showed that the apoptosis rate of UVA group (3A) was higher than that of control group (3B).

2.2 可調(diào)控cathepsin D的差異表達(dá)LncRNAs

應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)篩選慢性光損傷成纖維細(xì)胞與相應(yīng)對(duì)照組之間差異表達(dá)的LncRNA，進(jìn)而篩查出可調(diào)控cathepsin D且存在差異表達(dá)的LncRNA共有25個(gè)，其中表達(dá)差異較明顯的是Lnc-CTSD、Lnc-TNNI1和Lnc-RP11-706015.1.1-3,詳見(jiàn)表1。

表1 可調(diào)控cathepsin D的差異表達(dá)LncRNAsTab.1 LncRNAs of differential expression of regulated cathepsin D

2.3 LncRNAs通過(guò)靶向結(jié)合miR4298發(fā)揮調(diào)控作用

通過(guò)miRanda和TargetScan分析發(fā)現(xiàn)在慢性紫外線損傷細(xì)胞中， LncRNA-CTSD、Lnc-TNNI以及Lnc-RP11均通過(guò)與miR4298靶向結(jié)合發(fā)揮下游調(diào)控作用(表2)。

表2 慢性紫外線皮膚損傷細(xì)胞hsa-miR- 4298海綿吸附的LncRNAsTab.2 LncRNAs of adsorption of cells hsa-miR- 4298 sponges from chronic ultraviolet skin injury

3 討論

近年來(lái)，借助轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)手段，非編碼RNA，包括LncRNA以及miRNA，作為一種新興的治療技術(shù)已邁進(jìn)臨床試驗(yàn)階段。利用miRNA、LncRNA及circRNA等非編碼RNA來(lái)調(diào)控cathepsins基因的表達(dá)，是目前最熱門(mén)和最有應(yīng)用前景的技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于基因功能調(diào)控和疾病干預(yù)等方面的研究，有些甚至已被利用開(kāi)發(fā)出治療藥物。2014年，Grammatikakis等[8]指出，LncRNAs表達(dá)變化是細(xì)胞衰老分子標(biāo)志的里程碑。鄭躍等[9]前期研究發(fā)現(xiàn)在皮膚光老化成纖維細(xì)胞中，有2 261個(gè)LncRNA有差異表達(dá)，并建立了光老化相關(guān) LncRNA差異表達(dá)庫(kù)等。

cathepsin D是一種與表皮分化有關(guān)的蛋白質(zhì)，在反復(fù)紫外線照射后皮膚損傷和皮膚屏障變化中起重要作用。cathepsins是溶酶體內(nèi)最重要的蛋白水解酶家族之一，研究證實(shí)家族中的cathepsin D在溶酶體內(nèi)含量最豐富(溶酶體內(nèi)濃度高達(dá)1 mM)，cathepsin B 和cathepsin L酶原轉(zhuǎn)化為活性酶均有賴于cathepsin D催化，因此，cathepsin D 被稱為溶酶體“管家酶”。近年來(lái)的多項(xiàng)研究都已經(jīng)證明了cathepsin D家族在各器官系統(tǒng)細(xì)胞的自噬及水解過(guò)程中的重要作用。2015年Ma等[10]發(fā)現(xiàn)cathepsin D直接參與并調(diào)控細(xì)胞自噬，進(jìn)而調(diào)控AGEs在溶酶體內(nèi)的降解，且AGEs 在溶酶體酸性環(huán)境中變性后更易與蛋白水解酶的肽鍵結(jié)合被降解[4]。本研究發(fā)現(xiàn)光老化細(xì)胞中Lnc-CTSD、Lnc-TNNI和Lnc-RP11表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)基因與cathepsin D基因編碼序列非常接近，提示Lnc-CTSD、Lnc-TNNI和Lnc-RP11可能是UVA損傷皮膚組織蛋白酶表達(dá)變化的上游調(diào)節(jié)因子。

miR4298是一種人源microRNA，其已經(jīng)用于開(kāi)發(fā)臨床疾病治療評(píng)估及預(yù)后試劑盒[5-6]。劉玉芳等[11]前期在進(jìn)行光老化LncRNAs調(diào)控cathepsins研究時(shí)還發(fā)現(xiàn)，光老化特異性LncRNAs需要與microRNA結(jié)合，發(fā)揮下游效應(yīng)，并發(fā)現(xiàn)靶向結(jié)合的microRNA-hsa-miR- 4298。hsa-miR- 4298是一種人源microRNA，已經(jīng)被用于開(kāi)發(fā)臨床疾病治療評(píng)估及預(yù)后試劑盒。An等[5]研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中表達(dá)的hsa-miR- 4298是胃癌預(yù)后的標(biāo)志。Chen等[6]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中表達(dá)的hsa-miR- 4298是腫瘤治療耐藥性及預(yù)后的標(biāo)志之一。本研究通過(guò)信息學(xué)篩查，發(fā)現(xiàn)可調(diào)控cathepsin D的Lnc-CTSD、Lnc-TNNI和Lnc-RP11具有一個(gè)共同的靶向結(jié)合miroRNA：hsa-miR- 4298。提示hsa-miR- 4298可能通過(guò)結(jié)合Lnc-CTSD、Lnc-TNNI和Lnc-RP11調(diào)控cathepsin D參與皮膚慢性光損傷發(fā)生，但具體調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，反復(fù)UVA照射可上調(diào)皮膚成纖維細(xì)胞中cathepsin D的調(diào)控LncRNAs，Lnc-CTSD、Lnc-TNNI1和Lnc-RP11-706015.1.1-3均通過(guò)與miR4298靶向結(jié)合發(fā)揮作用，可能通過(guò)microRNA-LncRNA-cathepsin D機(jī)制參與皮膚光老化發(fā)生。相信隨著 LncRNA、microRNA、cathepsin D與光老化機(jī)制的闡明，可更好地為研發(fā)更新、更穩(wěn)定、靶向性更強(qiáng)的皮膚光老化及日光相關(guān)性皮膚病(包括皮膚腫瘤)相關(guān)的分子標(biāo)記物靶點(diǎn)提供依據(jù)，并能據(jù)此開(kāi)發(fā)小分子藥物用于光老化及相關(guān)皮膚病的預(yù)防和治療，為其診斷和治療提供新契機(jī)。