孫慧琳，代媛媛，孟蘭奇，查恩輝

（錦州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 錦州 121001）

牛肉中富含的蛋白質(zhì)、氨基酸有修復(fù)組織以及提高機體抗病能力等功效。我國作為牛肉和牛肉制品的第三消費大國，近年來生產(chǎn)和銷售量逐漸升高。儲藏品質(zhì)一直是牛肉屠宰企業(yè)及生產(chǎn)企業(yè)關(guān)注的問題，儲藏溫度不同，品質(zhì)差異較大。冷藏是肉類目前最簡單易行和最經(jīng)濟的儲藏方式，冰溫儲藏消除了冰晶對食品的不良影響，包括蛋白變性以及凍害等危害，滿足消費者對綠色、方便、具有較長貨架期的冷鮮肉的需求。而影響牛肉品質(zhì)的重要指標(biāo)就包含蛋白質(zhì)氧化以及水相的變化，劉澤龍[1]通過Fenton氧化體系對蛋白進行氧化，研究發(fā)現(xiàn)，肌肉的蛋白質(zhì)氧化會影響其水合與持水能力。

蛋白質(zhì)氧化會影響肉品的加工特性、營養(yǎng)價值及風(fēng)味滋味，對肉制品品質(zhì)影響極大。蛋白質(zhì)氧化被定義為一種共價鍵修飾，能夠造成蛋白質(zhì)多肽鏈的斷裂、氨基酸側(cè)鏈被修飾以及蛋白質(zhì)分子間發(fā)生交聯(lián)聚合等一系列破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用，從而改變蛋白質(zhì)乳化、溶解、起泡、凝膠等特性[2-3]，影響肉品品質(zhì)。扶慶權(quán)等[4]研究發(fā)現(xiàn)，隨著蛋白質(zhì)氧化的程度加劇，肌細(xì)胞外圍的羰基氧化熒光信號顯著增加，表明羰基含量增加。Lund等[5]研究發(fā)現(xiàn)，一些自由基誘導(dǎo)物例如羥自由基（·OH）、過氧化自由基（HO2·）等和一些非自由基誘導(dǎo)物例如過氧化氫（H2O2）、次氯酸（HClO）和臭氧等均可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)氧化，且在不同儲藏條件下豬肉的肌球蛋白重鏈發(fā)生不同程度降解，造成總巰基含量顯著下降。

通過核磁共振（NMR）技術(shù)研究牛肉中水的遷移規(guī)律和分布狀態(tài)，弛豫時間T2可以靈敏地區(qū)分多種相態(tài)的氫質(zhì)子，并且能夠反映牛肉內(nèi)部氫質(zhì)子所處環(huán)境以及氫質(zhì)子所受的束縛力和自由度[6]。牛肉中存在3種水分狀態(tài)，其含量的變化會對牛肉的品質(zhì)產(chǎn)生影響，一般分為強結(jié)合水T2b（0.1～1 ms），弱結(jié)合水T21（1～10 ms），不易流動水T22（10～100 ms），自由水T23（100～1 000 ms）。Margit等[7]通過低場核磁共振技術(shù)檢測鮮肉在冷凍儲藏時的水相變化，研究發(fā)現(xiàn)，凍藏的時間及溫度與肉樣的持水性呈顯著相關(guān)，凍藏的溫度越高，時間越長，水分損失就越嚴(yán)重。戚軍等[8]通過低場核磁共振技術(shù)發(fā)現(xiàn)羊肉經(jīng)反復(fù)凍融后其保水性顯著下降。

目前，已有國內(nèi)外學(xué)者利用核磁共振技術(shù)檢測牛肉品質(zhì)，針對牛肉的水分遷移及蛋白質(zhì)氧化的相關(guān)性略有研究。本文利用低場核磁共振技術(shù)研究牛肉在不同儲藏溫度下水分遷移與蛋白質(zhì)氧化的相關(guān)性，目的是找到能夠快速表征蛋白質(zhì)氧化程度的檢測方法，為牛肉儲藏過程中的無損檢測提供新思路和新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

牛背最長肌，購于錦州鮮肉批發(fā)市場。三氯乙酸、鹽酸乙醇、氧化鎂、氯化鈉（分析純（AR）），購于珠海麗珠試劑股份有限公司；磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、乙酸乙酯、磷酸鈉（均為AR），購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司；五水合硫酸銅、磷酸二氫鈉、四水合酒石酸鉀鈉、EDTA、DTNB（均為AR），購于南京化學(xué)試劑有限公司；鹽酸胍、DNPH、尿素、十二烷基硫酸鈉（SDS）、牛血清蛋白（均為AR），購于成都市科龍化工試劑廠。

1.1.2 儀器與設(shè)備

BCD-258WLDPN冰箱，購于漢莎科學(xué)儀器有限公司；JJ5000A電子天平，購于華瑞科學(xué)儀器有限公司；UV-1800紫外分光光度計，購于上海譜元儀器有限公司；NMI20核磁共振成像儀，購于上海紐邁科技有限公司；JIDI-16D高速離心機，購于上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

選取宰后24 h內(nèi)的牛背最長肌，去除筋膜后沿肌原纖維方向切成10 g左右肉塊，使用PE保鮮膜包裝后分別放置于避光的4℃冷藏室及-2℃冰溫室，于包裝后0、2、4、6、8、10 d取樣測定各指標(biāo)。

1.2.2 蛋白質(zhì)的測定

1.2.2.1 肌原纖維蛋白的提取

將牛肉剔除脂肪后切碎，稱取10.0 g肉樣加入隔離緩沖溶液，冰浴條件下勻漿30 s。勻漿后離心15 min（5 000 r/min），棄掉上層清液。重復(fù)上述步驟兩次。將得到的肌原纖維顆粒用0.1 mol/L氯化鈉洗提3次，在最后1次離心前用4層紗布過濾，用0.1 mol/L的鹽酸將pH調(diào)到6.0[9]。得到的沉淀為肌原纖維蛋白，密閉后置于冰上保藏，在24 h內(nèi)用完。

1.2.2.2 蛋白含量的測定

將牛血清蛋白配制成10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL加水至1 mL，加入雙縮脲試劑至5 mL，渦旋后室溫靜置20 min，于540 nm波長下測定溶液吸光度，重復(fù)3次，結(jié)果取平均值[10]。經(jīng)計算，回歸方程y=0.049 1x+0.004 2，R2=0.999 7。

1.2.2.3 羰基含量的測定

將肌原纖維蛋白用0.1 mol/L的磷酸緩沖液稀釋為2 mg/mL的肌原纖維蛋白溶液，取1 mL肌原纖維蛋白質(zhì)溶液，加入1 mL DNPH溶液，空白對照則加入1 mL 2 mol/L鹽酸溶液，在室溫下暗室靜置1 h。加入1 mL TCA溶液，離心5 min（13 000 r/min），收集沉淀，用體積比為1∶1的乙酸乙酯-乙醇混合溶液充分洗滌并離心3次，去除殘留的試劑。溶劑揮發(fā)后，加入3 mL 6 mol/L鹽酸胍溶液，38℃下水浴15 min后離心5 min（13 000 r/min），取上清液于370 nm波長下測定溶液吸光度[11]。采用摩爾消光系數(shù)22 000 L/(mol·cm)計算羰基含量。

式中：A370為370 nm下的吸光度；106為摩爾基礎(chǔ)單位；C為測得的蛋白濃度（mg/mL）。

1.2.2.4 巰基含量的測定

準(zhǔn)確吸取0.5 mL肌原纖維蛋白質(zhì)溶液放入玻璃試管中，而空白對照則加入0.5 mL 0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液，然后加入2.0 mL尿素-SDS溶液、0.5 mL DTNB試劑。渦旋后暗室靜置10 min，于412 nm波長處測定樣品吸光度[12]。使用摩爾消光系數(shù)13 600 L/(mol·cm)來計算蛋白中總巰基含量。

式中：A412為412 nm下的吸光度；106為摩爾基礎(chǔ)單位；C為測得的蛋白濃度（mg/mL）。

1.2.3 pH的測定

將肉樣切成肉糜，稱取5.0 g，放入盛有45 mL蒸餾水的錐形瓶中，混勻后振蕩30 min，之后用pH計測定。重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.2.4 儲藏?fù)p失率的測定

稱量儲藏前肉樣質(zhì)量（m1），分別進行冷藏、凍藏，到期取出肉樣后，于室溫下解凍，用濾紙吸凈多余水分后稱重（m2），計算儲藏?fù)p失率。

1.2.5 水相遷移的測定

將2組肉樣分別分割為1.0 g，體積約為10 mm×10 mm×20 mm后放入直徑為15 mm、長為200 mm的低場核磁專用管內(nèi)，排除內(nèi)部空氣后用保鮮膜封閉包裝。將核磁管放入低場核磁共振儀中檢測。磁體溫度為32℃，質(zhì)子共振頻率為21 MHz[13]。選擇CPMG脈沖序列，參數(shù)設(shè)定為：SF1=22 MHz、O1=911.887 4 kHz、P1=15μs、P2=30μs、τ=150μs、TD=90 016、Echo Cnt=3 000、NS=8、TR=1 000、RG1=30、RG2=3。每組樣品做3個平行試驗，每個平行重復(fù)測定3次。用Multi Exp Inv Analysis軟件進行CPMG指數(shù)衰減曲線反演。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

采用EXCEL 2017分析pH、儲藏?fù)p失率等指標(biāo)的平均值和變化規(guī)律，繪制折線圖，每個樣品平行測定3次。數(shù)據(jù)處理用SPSS 13.0軟件進行方差分析（ANOVA），通過Pearson相關(guān)系數(shù)分析NMR與羰基、巰基的相關(guān)性，顯著水平設(shè)為α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 儲藏期間牛肉蛋白羰基及巰基含量的變化

肌肉中所含的賴氨酸、脯氨酸等能被直接氧化形成羰基；烷氧自由基（CO·）與烷基過氧化物（COOH）通過α-酰胺化途徑導(dǎo)致多肽骨架鏈β-斷裂；賴氨酸易與還原糖反應(yīng)生成羰基衍生物[14]，三種方式均可使羰基含量增多，所以可以通過測量羰基來衡量蛋白質(zhì)氧化程度。儲藏期間牛肉蛋白質(zhì)中羰基的含量變化如圖1所示。由圖1可知，新鮮牛肉的羰基含量為0.62 nmol/mg Prot，隨著儲藏時間的延長，冷藏組和冰溫組蛋白的羰基含量均呈現(xiàn)增長趨勢，但氧化速度冷藏組大于冰溫組。儲藏至10 d時，冷藏組及冰溫組的羰基含量分別為1.29 nmol/mg Prot和0.98 nmol/mg Prot。李茜[15]研究發(fā)現(xiàn)，托盤包裝的牛肉冷藏10 d，羰基含量由1.35 nmol/mg Prot增長到2.60 nmol/mg Prot，冰溫儲藏10 d羰基含量由1.35 nmol/mg Prot增長到1.50 nmol/mg Prot。結(jié)果表明冷藏條件儲藏的牛肉其羰基含量增加程度大于冰溫儲藏條件，該結(jié)論與本試驗結(jié)果相符。

圖1 不同儲藏溫度下牛肉蛋白質(zhì)羰基含量的變化Fig.1 Changes of beef carbonyl contents at different storage temperatures

蛋白質(zhì)分子中的蛋氨酸含有的硫原子易被氧化生成二硫鍵導(dǎo)致巰基含量降低；半胱氨酸被氧化成磺酸、亞磺酸、次磺酸，蛋氨酸被氧化成亞砜和砜[16]，也可導(dǎo)致巰基含量降低，所以可以通過測量巰基含量來衡量蛋白質(zhì)氧化程度。儲藏期間，牛肉蛋白質(zhì)中巰基含量變化如圖2所示。新鮮牛肉的巰基含量為79.92 nmol/mg Prot，在儲藏過程中巰基含量總體呈現(xiàn)下降趨勢。冰溫組在儲藏過程中巰基變化較為平穩(wěn)，在儲藏10 d后降為73.71 nmol/mg Prot，巰基含量損失約7%；冷藏組的巰基含量在儲藏前期（0～6 d）變化不大，表明在儲藏前期冷藏條件下的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，儲藏6 d之后，冷藏組巰基含量下降趨勢增大，說明此時蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)劇烈變化，最終在10 d時降為70.73 nmol/mg Prot，巰基含量損失約11%。

2.2 儲藏期間牛肉pH的變化

儲藏期間牛肉pH的變化如圖3所示。牛肉的pH在儲藏前期（0～2 d）呈現(xiàn)下降趨勢，是由于新鮮牛肉排酸不徹底，尸僵未結(jié)束，乳酸持續(xù)積累導(dǎo)致牛肉在儲藏前48 h pH下降，48 h后出現(xiàn)自身解僵，pH上升。在冷藏4 d條件下pH上升是由于隨著儲藏時間的延長，乳酸逐漸被降解且牛肉表面的微生物活動加快，并在酶的作用下使蛋白質(zhì)分解為氨、氨基酸等堿性物質(zhì)[17]，從而使得牛肉pH上升。當(dāng)肉類pH＞6.7即為變質(zhì)，冷藏10 d的牛肉pH已達(dá)到6.78，此時牛肉已腐敗變質(zhì)，蛋白質(zhì)不斷被分解生成的堿性物質(zhì)使pH增大。冰溫儲藏牛肉在0～4 d時pH下降，在4～10 d時pH上升，在第10天時pH達(dá)到6.05，變化趨勢與冷藏牛肉一致，但變化較為平緩，原因是低溫抑制有害微生物及病原菌的生命活動且在冰溫條件下牛肉細(xì)胞穩(wěn)定性高，理化性質(zhì)改變速度較慢，所以不易腐敗變質(zhì)。

圖3 不同儲藏溫度下牛肉pH的變化Fig.3 Changes of beef pH at different storage temperatures

2.3 儲藏期間牛肉損失率的變化

儲藏期間牛肉損失率的變化如圖4所示。在儲藏4 d時，冷藏條件下的牛肉比冰溫條件下的牛肉儲藏?fù)p失高1.4倍。在第10天時冰溫組、冷藏組的儲藏?fù)p失率分別為3.14%和4.31%?？赡苁怯捎诶洳亟M牛肉相較于冰溫組，微生物生命活動相對旺盛，蛋白質(zhì)變性速度加快，使牛肉細(xì)胞系水力降低，進而導(dǎo)致水分含量降低，而冰溫組能很好地抑制微生物活動，從而降低了儲藏?fù)p失率。牛肉中的水主要包含自由水、結(jié)合水和不易流動水，自由水最易損失，而儲藏牛肉與新鮮牛肉相比損失的可能是自由水，且細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)如氨基酸、核苷酸等風(fēng)味成分和營養(yǎng)物質(zhì)也會隨著水分流失[18]。

圖4 不同儲藏溫度下牛肉儲藏?fù)p失率的變化Fig.4 Changes of beef storage loss rates under different storage temperatures

2.4 儲藏期間牛肉中水分的存在狀態(tài)及遷移規(guī)律

牛肉在不同儲藏溫度下水分分布的情況見圖5和圖6，一共出現(xiàn)4個波峰，第1個波峰出現(xiàn)在0.1～1 ms之間為強結(jié)合水（T2b），第2個波峰出現(xiàn)在1.0～5.0 ms之間為弱結(jié)合水（T21），結(jié)合水與牛肉緊密相連，以致儲藏期間變化趨勢不顯著。第3個波峰在24～76 ms之間為不易流動水（T22），且第3個波峰面積占總體達(dá)到85%以上。第4個波峰在150～230之間為自由水（T23）。隨著儲藏時間的延長，4個波峰發(fā)生變化，說明不同狀態(tài)水分發(fā)生了遷移或轉(zhuǎn)變，由于T22減小，說明不易流動水逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樽杂伤?/p>

圖5 冰溫條件下牛肉水分分布圖Fig.5 Water distributions of beef in ice temperature

圖6 冷藏條件下牛肉水分分布圖Fig.6 Water distributions of beef in cold storage

牛肉在不同儲藏溫度下橫向弛豫時間T2峰面積比的變化如表1所示。兩種儲藏溫度下T22、T2b和T21弛豫時間的峰面積均呈現(xiàn)下降趨勢，T23弛豫時間的峰面積呈現(xiàn)上升趨勢，即牛肉中不易流動水及結(jié)合水含量降低，自由水含量增加。由此可知，在儲藏期間牛肉內(nèi)3種狀態(tài)水分發(fā)生轉(zhuǎn)移，一部分不易流動水轉(zhuǎn)變?yōu)樽杂伤?。由圖5～6可知，隨著儲藏時間的延長，-2℃條件下的牛肉T22、T23峰面積變化小于4℃條件，表明牛肉在冰溫條件下有著較高的持水性[19]，間接表示冰溫條件的保鮮效果優(yōu)于冷藏。

表1 不同儲藏溫度下牛肉橫向弛豫時間T2峰面積比的變化Table 1 Changes in T2 transverse relaxation times of beef under different storage temperatures

2.5 相關(guān)性分析

表2為通過Pearson法得出的牛肉在冰溫儲藏過程中水分遷移與蛋白質(zhì)氧化之間的相關(guān)性。在-2℃條件下，T22與羰基含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與巰基含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；T23與羰基含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與巰基含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。

表3為通過Pearson法得出的牛肉在冷藏過程中水分遷移與蛋白質(zhì)氧化之間的相關(guān)性。4℃條件下，T2b與巰基含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），T21與羰基含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），T22與羰基含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），T22與巰基含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），T23與羰基含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。

表2 牛肉冰溫儲藏期間水分遷移與蛋白質(zhì)指標(biāo)間的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis between beef water migrations and protein indices during ice temperature storage

表3 牛肉冷藏期間水分遷移與蛋白質(zhì)指標(biāo)間的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis between beef water migrations and protein indices during cold storage

新鮮牛肉的含水量為70%～75%，在儲藏期間最易流失的部分為自由水。80%的自由水存在于肌原纖維和肌絲間，由肌纖維給予肌肉持水性。由于氧化后的肌原纖維橫向緊縮，導(dǎo)致肌細(xì)胞徑向減小且胞間距增加，從而使肌肉內(nèi)水分?jǐn)U散到肌纖維的空隙中，由于空隙中水分與肌肉的結(jié)合力不強，易被排除導(dǎo)致水分流失[20]。通過相關(guān)性分析得知，蛋白質(zhì)氧化與橫向弛豫時間T2呈現(xiàn)良好的相關(guān)性，可以通過低場核磁共振弛豫時間T2表征蛋白質(zhì)的變化，且兩種儲藏溫度下T22與羰基的相關(guān)性最佳，與巰基也表現(xiàn)出較好的相關(guān)性，因此用來表征蛋白質(zhì)氧化程度效果最好。

3 結(jié)論

（1）隨著儲藏時間的延長，牛肉的pH、儲藏?fù)p失率以及羰基含量上升，而巰基含量下降，冷藏第10天時牛肉pH達(dá)到6.78，已腐敗變質(zhì)。

（2）根據(jù)橫向弛豫時間T2結(jié)果表明，結(jié)合水（T2b、T21）以及不易流動水（T22）含量下降，自由水（T23）含量升高。通過相關(guān)性分析得出，冰溫條件下T22與羰基含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與巰基含量呈現(xiàn)顯著正相關(guān)（P＜0.05）；T23與羰基含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與巰基含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。冷藏條件下T2b與巰基含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），T21與羰基含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），T22與羰基含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），T22與巰基含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），T23與羰基含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。

（3）牛肉蛋白質(zhì)氧化與水分遷移有良好的相關(guān)性，可以通過低場核磁共振弛豫時間T2表征蛋白質(zhì)的變化，且T22用來表征蛋白質(zhì)氧化程度效果最好。