劉志偉,李 欣,張慧超,孫艷瑞,安眾一

(煙臺大學土木工程學院,山東 煙臺 264005)

隨著全球能源需求的增加,石油勘探與開發(fā)加速發(fā)展,催生了以聚合物驅油為代表的第3代驅采油技術[1-2],但同時產(chǎn)生了大量含高分子聚丙烯酰胺(PAM)的廢水[3]。由于PAM加入水中可以提高溶液的黏度從而強化油田的采收率[4],因此被廣泛應用于石油開采行業(yè)[5-7]。雖然PAM毒性較低不會對環(huán)境造成巨大污染[8-11],但PAM降解過程中會產(chǎn)生較多中間體,特別是具有累積性神經(jīng)毒性并被歸類為“可能對人類致癌的物質(zhì)”的丙烯酰胺單體(AM),若不能將其妥善處置,這類含聚廢水將直接威脅受納水體周邊。因此,如何將含聚廢水徹底無害化處理變得緊迫而重要[12]。

含聚廢水的高黏度和強乳化性是處理過程中需要面對的難題[13-14]。目前可用來處理含聚廢水的方法包括物理法、化學法[15-20]、生物法[21-23]以及耦合處理手段[24]。盡管物化處理具有較高的降解效率,但處理過程中很容易產(chǎn)生有毒的AM,而且需要能源供應或藥劑投加,增加了其處理成本。生物法降解PAM已顯示出低成本、環(huán)保且不產(chǎn)生有毒底物的優(yōu)勢[25-26]。

先前的研究表明,PAM是微生物碳或氮的來源,并且PAM生物降解的代謝途徑在厭氧和好氧條件下均可發(fā)生。如果碳源充足,土壤微生物可將PAM作為唯一氮源,這表明此類微生物可以分解PAM上的酰胺基支鏈,但不能降解碳碳長鏈[27-28]。厭氧菌包括硫酸鹽還原菌[29-30]和產(chǎn)甲烷菌[31]都可以使用PAM作為氮源。有研究表明,從油田驅采廢水中獲得的微生物在培養(yǎng)時可以利用PAM作為氮源或碳源[32]。WEN等[33]從活性污泥和油污土壤中分離出了2種可以利用PAM作為唯一碳源的菌株,發(fā)現(xiàn)酰胺基可被微生物水解。同時,BAO等[32]推導了生物降解酶的作用機理:特種微生物分泌酰胺酶將氨基水解為羧基,然后通過酶的作用切斷側鏈末端的甲基[33,34]。最后,甲基被單一加氧酶催化氧化為酸,PAM鏈骨架斷裂,從不同位置形成乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸等小分子有機物[35]。

目前所有針對PAM的生物強化手段均采用PAM作為底物直接篩選降解菌,未考慮針對PAM代謝途徑中不同步驟的產(chǎn)物進行微生物篩選,所以現(xiàn)有的研究論文中獲得的復配菌劑能夠提高PAM的降解率,但總有機碳(TOC)下降率較低。現(xiàn)今使用的淀粉-碘化鎘測定PAM濃度的方法,其原理是檢測PAM溶液中酰胺基的含量,酰胺基脫落、測得數(shù)值降低,則認為PAM濃度降低[36]。然而,酰胺基脫落后形成的聚丙烯酸、長碳鏈聚合物等,則被忽視掉了。而TOC的降低,才能夠代表溶液中有機碳類物質(zhì)被礦化、轉變?yōu)镃O2和H2O。ZHANG等[26]將以PAM為底物分離到的3株菌應用于反應器中,發(fā)現(xiàn)這3種菌均具有穩(wěn)定的強化效果,但處理后的TOC去除率最高只能達到40%。SANG等[12]將以PAM為底物獲得的2株菌PAM-2和PAM-F1混合投加到厭氧折流板反應器中,以蔗糖作為共代謝底物,通過變性梯度凝膠電泳(DGGE)的分析發(fā)現(xiàn),2株菌能夠很好的存在于反應器中,對PAM和黏度的降解率分別可達89.8%和75.8%,而TOC降解率僅為32.9%。

目前所有的報道中,PAM降解菌的篩選全部以PAM作為底物,而并未針對PAM脫酰胺基后形成的長碳鏈降解菌進行篩選。針對于上述問題,本研究的2組試驗中,分別以PAM作為氮源,液體石蠟作為碳源;聚丙烯酸(PAM脫酰胺基后形成的主要長碳鏈聚合物)作為碳源,氯化銨作為氮源,篩選不同功能的降解菌群。并將兩者復配獲得功能相輔的復合菌劑,用以提高PAM的礦化率。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗材料

實驗中使用的PAM種類為陰離子型,其相對分子質(zhì)量為1600×104,由勝利油田相關公司提供;聚丙烯酸鈉(SPA)購自天津科密歐化學試劑有限公司;實驗室模擬含聚廢水成分參照勝利油田出水水質(zhì)成分配制而成。

1.2 培養(yǎng)基成分

培養(yǎng)基Ⅰ成分組成(以1 L計):2 mL液體石蠟,0.3 g PAM,0.2 g KH2PO4,0.1 g CaCl2,0.1 g MgCl2,1 g NaCl,0.1 g FeCl3,0.1 g MgSO4及微量元素液(各類微量元素痕量配制成溶液)1 mL[33]。

培養(yǎng)基Ⅱ成分組成(以1 L計):1 g SPA,0.1 g NH4Cl,0.2 g KH2PO4,0.1 g CaCl2,0.1 g MgCl2,1 g NaCl,0.1 g FeCl3,0.1 g MgSO4,及微量元素液(各類微量元素痕量配制成溶液)1 mL,加入去離子水定容至1 L。

上述2種培養(yǎng)基可通過添加1.5%～2.0%瓊脂,制備成固體培養(yǎng)基。文中所述濃度均為質(zhì)量濃度。

1.3 菌種的篩選及鑒定

PAM酰胺基降解菌種的篩選:以勝利油田長期接觸PAM的土壤作為篩種來源,首先以PAM為唯一氮源的液體培養(yǎng)基作為篩選及富集培養(yǎng)基Ⅰ,將土壤稱取5～10 g,加入到100 mL無菌水中,加入玻璃珠1 g,120～150 r/min搖床震蕩1 h。取1 mL上清液加入到上述培養(yǎng)基Ⅰ內(nèi),30 ℃培養(yǎng)5 d;再取培養(yǎng)后的菌液1 mL,加入到新的100 mL培養(yǎng)基Ⅰ內(nèi),30 ℃培養(yǎng)48 h。取上述培養(yǎng)液1 mL,加入到9 mL無菌水中,采用梯度稀釋法,最終稀釋質(zhì)量濃度至10-6。取稀釋后的菌液,涂布在固體培養(yǎng)基Ⅰ表面,30 ℃培養(yǎng)48 h,獲得單菌落。分別挑取單菌落,在新的固體培養(yǎng)基表面劃線分離5次后,獲得純菌種。

PAM長碳鏈降解菌種的篩選:以長期處理含聚廢水的生物接觸氧化反應器中填料表面的生物膜作為微生物篩選的來源,首先以培養(yǎng)基Ⅱ(SPA為唯一碳源)的液體培養(yǎng)基作為篩選及富集培養(yǎng)基。將生物接觸氧化反應器內(nèi)的生物膜稱取5 g,加入到100 mL無菌水中,加入玻璃珠1 g,120 rpm搖床震蕩1 h。取上述培養(yǎng)液1 mL,加入到9 mL無菌水中,采用梯度稀釋法,最終稀釋質(zhì)量濃度至10-6。取稀釋后的菌液,涂布在固體培養(yǎng)基Ⅱ表面,30 ℃培養(yǎng)48 h,獲得單菌落。分別挑取單菌落,在新的固體培養(yǎng)基表面劃線分離5次后,獲得純菌種。

利用E.Z.N.A.SQ Tissue DNA Kit基因組DNA提取試劑盒提取功能菌株的DNA,以細菌的通用引物Primer A-27F(Primer A-27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和Primer B-1492R(5'-AAGGAGGTGATCCAG CCGCA-3')擴增16S rDNA片段進行測序比較分析。PCR反應體系:總DNA 1 μL,Primer A-27F 1 μL,Primer B-1492R 1 μL,10×Buffer 5 μL,dNTP 4 μL,Taq DNA聚合酶 0.25 μL,ddH2O 32.5 μL;以及擴增程序:94 ℃預變性5 min,94 ℃變1 min,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,循環(huán)35次后將PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程公司進行測序,之后將測序得到的16S rDNA進行Blast序列分析比對。

1.4 菌種的馴化

將篩選到的PAM酰胺基降解菌及長碳鏈降解菌分別加入到表1和表2的特異性馴化培養(yǎng)基中,放置于30 ℃的搖床中震蕩培養(yǎng)。每隔3 d移取5 mL前一個培養(yǎng)基溶液加入到下一個馴化培養(yǎng)基中,依次進行,直到降解菌在④ 號馴化培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長后停止馴化。將經(jīng)過馴化的菌種進行富集培養(yǎng)以進行下一步實驗。

表1 酰胺基降解菌特異性馴化培養(yǎng)基

表2 碳鏈降解菌特異性馴化培養(yǎng)基

1.5 菌種性能及降解效果測定

配制500 mg/L的模擬PAM溶液并進行高溫高壓滅菌,在PAM溶液中接種經(jīng)深度馴化的酰胺基降解菌、C—C長鏈降解菌以及2種菌進行組合的混合菌作為菌液。將菌液放置于搖床中進行恒溫培養(yǎng),觀察細菌的生長情況,并采用淀粉-碘化鎘法測定PAM的濃度。

1.6 功能菌復配方法

將馴化完成的單株菌按照S組與G組兩兩組合、三三組合和全部混合的方式進行復配,共9組。每種菌液離心濃縮至OD600=1，分別取1 mL加入到500 mg/L的PAM溶液中,其他營養(yǎng)成分還包括(g/L):0.1 KH2PO4,1 NaHCO3,0.1 MgSO4,0.1 CaCl2,1 NaCl,微量元素母液1 mL。

1.7 FT-IR圖譜分析

采用紅外圖譜法檢測PAM及其生物降解產(chǎn)物的結構,考察不同時期的基團變化。樣品分析前需均先經(jīng)過24 h真空冷凍干燥處理,用光譜純KBr制作壓片測定,采用傅里葉-紅外光譜儀進行分析。

2 結果分析與討論

2.1 降解菌的分離與鑒定

在含有PAM和SPA的固體培養(yǎng)基上劃線純化后共獲得23株單菌,16S rDNA測序分析后,將基因序列提交到NCBI GenBank進行比對分析,發(fā)現(xiàn)23株菌分別屬于的4個不同的菌屬,其中能夠高效降解酰胺基的菌種有2株,分別命名為S-1(Ochrobactrumanthropi,相似度99%)、S-2(Acinetobactervenetianus,相似度99%);高效降解長碳鏈的菌有2株,分別命名為G-1(Pseudochrobatrumsp.,相似度100%)、G-2(Bacilluscereus,相似度100%)。其中,G-2所屬的芽孢桿菌有大量研究數(shù)據(jù)表明可應用于PAM的降解,而其他3種菌尚未有應用于PAM的降解的報道[33]。

2.2 酰胺基降解菌的降解效果

分別取1 mL馴化前后的S-1、S-2菌液加入到經(jīng)高溫高壓滅菌后的PAM基本培養(yǎng)基中,將其放置于搖床中30 ℃恒溫震蕩培養(yǎng),每隔4 h取樣進行檢測,共培養(yǎng)120 h。圖1(a)和圖1(b)為馴化前后S-1、S-2的生長曲線和PAM降解效果,可以看出,生長曲線符合微生物生長繁殖的S型曲線規(guī)律,并且馴化后的S-1、S-2降解菌的生長情況要優(yōu)于馴化之前,降解PAM的效果也更強。馴化之前S-1、S-2降解菌對500 mg/L的PAM溶液的降解率為37.28%和42.14%,經(jīng)過馴化之后,提高到了46.7%和51.54%,說明經(jīng)過馴化顯著提高了降解菌在PAM溶液中的生存能力。

圖1 馴化前后S-1、S-2的生長曲線和PAM降解效果

2.3 C—C長鏈降解菌的降解效果

分別取1 mL馴化前后的G-1和G-2菌液加入到經(jīng)高溫高壓滅菌后的不加外加碳源的SPA液體培養(yǎng)基中,將其放置于搖床中30 ℃恒溫震蕩培養(yǎng),每隔4 h取樣進行檢測,共培養(yǎng)120 h。圖2(a)和圖2(b)為馴化前后G-1、G-2的生長曲線和COD去除情況,可以看出,生長曲線符合微生物生長繁殖的S型曲線規(guī)律,并且隨著降解菌的生長,COD去除率也在逐步提高,最終趨于穩(wěn)定,說明G-1、G-2這2種降解菌能夠以SPA作為唯一碳源進行生長繁殖,從而可以推出這2種降解菌對PAM的長鏈態(tài)的碳有去除效果。

圖2 馴化前后G-1、G-2的生長曲線和COD去除情況

2.4 2類降解菌制備復配菌劑的降解效果

在本實驗中,選用勝利油田長期接觸含聚廢水的土壤來篩選酰胺基降解菌,采用生物接觸氧化反應器中已長期降解含聚廢水的生物膜篩選長碳鏈降解菌。2種降解菌的篩選來源不同,有利于菌株間更好的協(xié)同作用,提高降解效率。從圖3來看,最佳混合菌劑的降解效果明顯高于單一細菌。PAM的去除率大大提高,有利于降低PAM的分子質(zhì)量,降解C—C長鏈將大大降低含聚廢水的黏度。此外,混合菌劑對PAM的降解效果呈現(xiàn)多種狀態(tài),或增強或減弱,這是菌種間存在的協(xié)同以及競爭所導致,從而影響了菌種對PAM的降解效果。其中S-2&G-2混合菌劑對PAM的降解效果最為顯著,能達到69%,說明S-2和G-2之前存在著良好的協(xié)同關系,而S-1&S-2&G-2混合菌劑對PAM的降解效果較單菌種而言降低了,只有35%,說明這3種菌劑之間存在著競爭關系。此外,本實驗也對混合菌劑對含PAM廢水黏度的降低效果進行了探究,研究發(fā)現(xiàn),S-2&G-2混合菌劑仍然是最優(yōu)的降解菌組,實驗室配制的500 mg/L的PAM模擬廢水黏度在1.61 mPa·s(14 ℃下水的黏度為1.17 mPa·s),如圖4,經(jīng)過84 h降解,黏度下降至1.24 mPa·s,與水的黏度十分接近,從側面顯示出混合菌劑對PAM有顯著的降解效果。圖5為混合菌劑對不同濃度PAM溶液TOC的降解效果,PAM質(zhì)量濃度越低,去除率越高,針對100 mg/L PAM溶液的TOC去除率可達60%以上,遠高于已有報道[26]。

A.S-1&G-1，B.S-1&G-2，C.S-2&G-1，D.S-2&G-2，E.S-1&G-1&G-2，F(xiàn).S-2&G-1&G-2，G.S-2&G-1，H.S-1&G-2，I.S-1&S-2&G-1&G-2。

圖4 S-2和G-2混合菌劑對降低含聚合物廢水黏度的影響

圖5 S-2和G-2混合菌劑對不同濃度PAM溶液TOC的降解效果

2.5 FT-IR圖譜分析

S-2&G-2混合菌劑降解PAM樣品的紅外圖譜如圖6所示,對比降解前后的PAM紅外光譜可以發(fā)現(xiàn)經(jīng)過復配菌劑降解之后,PAM的結構發(fā)生了很大的變化,紅外光譜中原有的一部分特征吸收峰消失,同時出現(xiàn)了新的特征吸收峰,如位于3300～3500 cm-1區(qū)域內(nèi)游離的-NH2的特征吸收峰消失變?yōu)?OH的尖銳吸收帶,2929 cm-1處的亞甲基反對稱吸收峰消失,同時位于1666 cm-1處的羰基(C=O)的特征吸收峰消失,說明降解菌可以利用PAM上的碳作為生長繁殖的碳源,并且于1000～1475 cm-1區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)新的特征吸收峰,此處出現(xiàn)的新的特征吸收峰屬于醇類;位于1408 cm-1處的C-N特征吸收峰消失,說明氨基從主鏈脫落,而在650～1000 cm-1區(qū)域內(nèi)新出現(xiàn)芳香烴類化合物的特征吸收峰,從而進一步證明:復合菌劑能夠降解PAM并利用其長鏈態(tài)的碳以及酰胺基作為自身生長發(fā)育的碳源和氮源;實驗結果與鄭忠環(huán)等[37]的研究結果相符合,WEN等[33]的研究也表明,生物降解能夠將PAM側鏈上的氨基斷裂下來,成為微生物生長繁殖不可或缺的氮源。

圖6 PAM降解前后的紅外光譜

3 結 論

(1)經(jīng)16S rDNA鑒定,從勝利油田含聚污泥中篩選出的4種PAM降解菌S-1、S-2、G-1、G-2分別屬于人蒼白桿菌(Ochrobactrumanthropi),威尼斯不動桿菌(Acinetobactervenetianus),假蒼白桿菌(Pseudochrobatrumsp.)和蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)。

(2)降解菌經(jīng)過馴化培養(yǎng),生長情況與對PAM的降解能力優(yōu)于馴化培養(yǎng)之前。2類降解菌復配成復配菌劑,其中S-2&G-2復配菌劑對PAM的降解效果最為顯著,降解率能達到69%;混合菌劑對含聚廢水的黏度的降低也有較好的效果,經(jīng)過84 h降解,最優(yōu)復配菌劑能夠將含聚廢水的黏度從1.61 mPa·s降至1.24 mPa·s(14 ℃下水的黏度為1.17 mPa·s),同時,混合菌劑對于TOC也有較強的去除作用,對于質(zhì)量濃度為300 mg/L以內(nèi)的PAM溶液的TOC去除率能達到50%以上。這表明復配菌劑可以降解PAM的碳鏈使其分子質(zhì)量下降,并將部分長碳鏈礦化。

(3)對復配菌劑降解PAM前后的紅外圖譜進行分析顯示,降解菌能夠降解并利用PAM的氨基和碳作為生長繁殖的氮源和碳源。