陳驍楠，張俊峰，王長謙，張繪莉

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院心內(nèi)科，上海200011

美國心臟病學(xué)會（American Heart Association，AHA）和歐洲心臟病學(xué)會（European Society of Cardiology，ESC）的2016年臨床指南按照射血分?jǐn)?shù)＜40%、41%～49%、＞50%，將心力衰竭分為射血分?jǐn)?shù)降低的心力衰竭、射血分?jǐn)?shù)中間范圍的心力衰竭、射血分?jǐn)?shù)保留的心力衰竭（heart failure with preserved ejection fraction，HFpEF）［1-2］。HFpEF是一種復(fù)雜的異質(zhì)性疾病，好發(fā)于老年人、肥胖者、女性，常伴有高血壓、糖尿病、腎功能不全、心房顫動等基礎(chǔ)疾病，約占心力衰竭患者住院人數(shù)的50%，臨床上尚缺乏有效的治療手段［3］。構(gòu)建與臨床發(fā)病特點(diǎn)類似的動物模型，對于進(jìn)一步探索HFpEF的發(fā)生機(jī)制和防治方法具有重要的意義。本研究通過高脂飼養(yǎng)和Nω-硝基-L-精氨酸甲酯鹽酸鹽（Nω-nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride，L-NAME）誘導(dǎo)建立了一種新型小鼠HFpEF動物模型，以期為HFpEF的病理生理機(jī)制研究提供幫助。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

8周齡的SPF級雄性和雌性C57BL/6J小鼠各16只，共32只，購于江蘇集萃藥康生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（蘇）2018-0008，動物使用許可證號為SYXK（滬）2016-0016。實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院動物房，晝夜節(jié)律規(guī)律，以60%高脂飼料（江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司）和含有0.5 g/L L-NAME的飲水飼養(yǎng)。研究符合上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院動物倫理委員會要求，批件號為SH9H-2019-A416-1。

1.2 試劑與儀器

L-NAME（德國Sigma），Masson三色染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），異氟烷（深圳市瑞沃德生命科技有限公司），蘇木精、伊紅（碧云天生物技術(shù)有限公司），Vevo 3100小動物超聲成像系統(tǒng)（加拿大VisualSonics），Eppendorf 5424小型離心機(jī)（德國Eppendorf），Visitech BP-2000動物血壓計(jì)（美國Visitech System），AU5800全自動生化分析儀（美國Beckman Coulter），Axio Zoom.V16宏觀變倍熒光顯微鏡（德國ZEISS）。

1.3 造模及分組

將雄性和雌性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分成對照組和模型組，每組8只。模型組每日予以充足的60%高脂飼料飼養(yǎng)，每周更換2次含有0.5 g/L L-NAME的飲水。對照組給予普通飼料以及普通飲水喂養(yǎng)，保證食物飲水充足。造模開始時(shí)及造模后第4、8、12、16周測定小鼠體質(zhì)量。造模后第16周小鼠異氟烷氣體麻醉后，經(jīng)眼球取血，4℃、2 200×g離心15 min，取上層血清于-80℃冰箱保存。取血后頸椎脫臼法處死小鼠，分離心臟，電子天平上稱量質(zhì)量后，置于4%多聚甲醛溶液中固定。

1.4 小動物心臟超聲檢測

造模后每2周進(jìn)行1次小動物心臟超聲檢測。小鼠異氟烷持續(xù)麻醉（0.3～0.5 L/min）后，取仰臥位，同步描記心電圖。采用多普勒超聲心動圖，探頭頻率30 MHz，檢測各組小鼠左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular enddiastolic diameter，LVEDd）、舒張期左心室前壁厚度（left ventricle anterior wall thickness，LVAWd）、舒張期左心室后壁厚度（left ventricle posterior wall thickness，LVPWd）、左 室 射 血 分 數(shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）、二尖瓣口血流速度（mitral orifice flow velocity，MV）、二尖瓣舒張?jiān)缙谘魉俣确逯蹬c晚期血流速度峰值的比值（E/A比值）、二尖瓣舒張?jiān)缙谘魉俣确逯蹬c二尖瓣環(huán)舒張?jiān)缙谶\(yùn)動速度峰值的比值（E/E′比值）、左心室整體長軸應(yīng)變（global longitudinal strain，GLS）。連續(xù)測定3個(gè)心動周期，取均值。

1.5 血壓和血脂指標(biāo)檢測

按Visitech BP-2000動物血壓計(jì)說明書操作，采用尾動脈測壓法測量小鼠收縮壓（systolic blood pressure，SBP）和舒張壓（diastolic blood pressure，DBP），重復(fù)測量3次，取均值。

按AU5800全自動生化分析儀說明書操作，檢測小鼠血清中三酰甘油（triacylglycerol，TAG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白膽固醇（highdensity lipoprotein cholesterol，HDL-Ch）和低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-Ch）。

1.6 心肌組織病理學(xué)檢查

取小鼠心肌組織塊，于4%多聚甲醛溶液中固定，常規(guī)梯度乙醇脫水，使用二甲苯滲透，石蠟固定包埋，制成厚度4μm的組織切片。常規(guī)脫蠟至水，梯度乙醇脫水，蘇木精染色3 min，自來水沖洗。1%鹽酸乙醇溶液分化10 s，0.2%氨水沖洗返藍(lán)30 s，自來水沖洗，伊紅復(fù)染3 min，使用梯度乙醇切片脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。按Masson三色染色試劑盒說明書進(jìn)行染色。使用Axio Zoom.V16宏觀變倍熒光顯微鏡觀察小鼠心肌組織切片病理變化。每個(gè)樣本20倍鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野，通過Image J軟件進(jìn)行定量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.0軟件處理。定量數(shù)據(jù)以x±s表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，3組及以上組間比較采用單因素方差分析圖基（tukey）事后檢驗(yàn)法。P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型小鼠的體質(zhì)量變化

雄性小鼠自造模后第4周起體質(zhì)量較同性別對照組明顯上升（P＜0.05）；雌性模型組小鼠體質(zhì)量增加緩慢，第8周起雌性模型組小鼠體質(zhì)量才明顯高于雌性對照組（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

表1 HFpEF模型小鼠體質(zhì)量的變化情況Tab 1 Changes in body weight in the HFpEF mice

2.2 血脂水平的變化

造模后第16周時(shí)，與同性別對照組相比，模型組TAG、TC、HDL-Ch、LDL-Ch水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。此外，雄性模型組小鼠的TC、HDL-Ch的水平高于雌性模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 HFpEF模型小鼠造模后第16周的血脂指標(biāo)情況Tab 2 Changes in blood lipid profiles in the HFpEF mice at the 16th week after modeling

2.3 血壓變化

造模后第16周測量小鼠SBP和DBP，發(fā)現(xiàn)與同性別對照組相比，模型組的SBP和DBP水平顯著升高（表3）。雌性模型組小鼠的DBP水平高于雄性模型組。

表3 HFpEF模型小鼠造模后第16周的血壓情況Tab 3 Changes in blood pressure in the HFpEF mice at the 16th week after modeling

2.4 心臟質(zhì)量的變化

造模后第16周時(shí)雄性小鼠與同性別對照組相比，心臟質(zhì)量明顯增加，但是心臟質(zhì)量與體質(zhì)量的比值出現(xiàn)了一定程度的降低（表4）。雌性模型組小鼠與同性別對照組相比，心臟質(zhì)量和心臟質(zhì)量與體質(zhì)量的比值均出現(xiàn)了明顯上升。

表4 HFpEF模型小鼠造模后第16周的心臟質(zhì)量情況Tab 4 Changes in heart weight in the HFpEF mice at the 16th week after modeling

2.5 左心室舒張功能的變化

自造模后第8周起，多普勒超聲心動圖顯示雌性或雄性模型組E/A比值、E/E′比值、GLS均較同性別對照組升高，提示左心室舒張功能明顯降低，但LVEF始終保持穩(wěn)定（圖1）。第16周時(shí)仍可以觀察到上述心臟超聲檢測指標(biāo)的變化趨勢。此外，與雌性模型組小鼠比較，雄性模型組小鼠的E/E′比值升高更加明顯。

圖1 HFpEF模型小鼠LVEF和左心室舒張功能的超聲心動圖改變Fig 1 Echocardiography changes in LVEF and left ventricular diastolic function in the HFpEF mice

2.6 左心室結(jié)構(gòu)的變化

與同性別對照組相比，模型組小鼠的舒張期LVAWd明顯增厚（P=0.002，P=0.000），但舒張期LVPWd以及LVEDd與同性別對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2）。

2.7 心臟組織的病理改變

病理組織學(xué)結(jié)果顯示：對照組心肌纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，排列規(guī)則，分界清晰，間質(zhì)未見明顯異常，未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤；模型組小鼠心肌細(xì)胞呈現(xiàn)不同程度的變性和肥大，可見局灶性壞死，肌纖維間隙增加、纖維化增加（圖3A、C），并有炎癥細(xì)胞浸潤（圖3B、D）。

3 討論

HFpEF的發(fā)生與年齡、高血壓、糖尿病、血脂異常等多種危險(xiǎn)因素和臨床疾病相關(guān)，病理生理變化復(fù)雜多樣，可能通過內(nèi)皮功能障礙、心臟神經(jīng)體液調(diào)節(jié)異常和系統(tǒng)性炎癥等多個(gè)機(jī)制，影響左心室結(jié)構(gòu)和舒張功能［4-5］。由于HFpEF的上述特殊性，目前缺乏公認(rèn)的、能代表HFpEF臨床特點(diǎn)的動物模型。

圖2 HFpEF小鼠造模后第16周的左心室重構(gòu)情況Fig 2 Left ventricular remodeling in the HFpEF mice at 16 weeks after modeling

圖3 HFpEF小鼠造模后第16周后心肌組織的病理組織學(xué)變化Fig 3 Pathological characteristics in cardiomyocytes of the HFpEF mice at 16 weeks after modeling

HFpEF研究中常用的動物模型主要有壓力負(fù)荷型模型、缺血型模型和復(fù)合型模型。壓力負(fù)荷型HFpEF模型主要通過主動脈縮窄手術(shù)、自發(fā)性高血壓大鼠誘導(dǎo)、繼發(fā)性高血壓大鼠模型或鹽敏感型大鼠誘導(dǎo)，使心臟后負(fù)荷增加，心肌細(xì)胞肥大、纖維化，導(dǎo)致心肌細(xì)胞舒張功能降低［6-8］。缺血型HFpEF模型主要通過冠狀動脈外慢性收縮、冠狀動脈內(nèi)慢性狹窄和藥物等方法造成心肌慢性缺血，模擬慢性心肌缺血引起的HFpEF［9-11］。復(fù)合型HFpEF模型則綜合了高血壓、血脂異常、糖尿病等多種病理機(jī)制。由于HFpEF往往和多種臨床并發(fā)癥并存，這種復(fù)合型模型更能模擬HFpEF的臨床病理特點(diǎn)［12-13］。雖然，不同類型的HFpEF模型具有不同的發(fā)病機(jī)制和研究針對性，但是復(fù)合模型聯(lián)合了2種以上臨床因素，更貼近HFpEF的臨床特征，可能更具有代表性和普適性，是HFpEF模型的主要發(fā)展方向。

本研究的HFpEF模型屬于復(fù)合型，主要聯(lián)合了LNAME和含60%脂肪的高脂飼料，誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)高血壓、高血脂等癥狀，從而誘發(fā)HFpEF形成。已有研究［14］表明高糖和高脂飲食會對小鼠的心臟收縮和舒張功能產(chǎn)生損害，與心血管疾病的發(fā)生相關(guān)。L-NAME是一氧化氮合酶競爭性抑制劑，阻礙內(nèi)皮舒張因子一氧化氮生成，是誘導(dǎo)高血壓動物模型的經(jīng)典藥物。L-NAME采用腹腔內(nèi)注射或溶于飲水中飼喂均可使實(shí)驗(yàn)動物血壓升高，同時(shí)會伴有心臟指數(shù)、小動脈管徑、心肌細(xì)胞直徑、管壁厚度的明顯改變［15-16］。我們將L-NAME（0.5 g/L）溶于飲水中，采用飼喂法，使小鼠穩(wěn)定地受到刺激，保持血壓持續(xù)穩(wěn)定升高，同時(shí)結(jié)合高脂飼料飼喂造模。小鼠無論性別，均可在造模后第8周時(shí)出現(xiàn)左心室舒張功能降低；多普勒超聲心動圖示E/A比值、E/E′比值明顯升高，且LVEF無明顯變化。造模后第16周時(shí)，左心室舒張功能進(jìn)一步降低，且出現(xiàn)了明顯的左心室室壁肥厚、心肌細(xì)胞肥大和心肌間質(zhì)纖維化，但未見LVEF和LVEDd明顯變化。本模型不僅模擬了高血壓、高血脂的疾病狀況，而且成模時(shí)間為第8周，可穩(wěn)定持續(xù)至第16周，基本符合高齡這一臨床特點(diǎn)。除了病因模擬，第16周時(shí)小動物心臟超聲和病理組織學(xué)結(jié)果均證實(shí)了左心室舒張功能障礙和心室重構(gòu)的特點(diǎn)，且左心室收縮功能和LVEDd無明顯變化，進(jìn)一步證實(shí)了本模型的可靠性、穩(wěn)定性和可持續(xù)性。

應(yīng)用L-NAME和高脂雙重刺激誘導(dǎo)HFpEF的造模過程中，雄性和雌性小鼠的成模時(shí)間趨勢基本一致，但是，雄性和雌性小鼠對L-NAME和高脂的雙重刺激的反應(yīng)，具有一定的性別差異。雄性C57BL/6J小鼠高脂飲食后可引起快速的體質(zhì)量增加，雌性C57BL/6J小鼠的體質(zhì)量增加緩慢，不易產(chǎn)生明顯的肥胖。血壓方面，雌性模型組的DBP明顯高于雄性模型組。這些提示在HFpEF的發(fā)生過程中，雄性和雌性的致病驅(qū)動因素可能存在著一定的性別差別。這一現(xiàn)象有助于研究者根據(jù)研究目的和側(cè)重點(diǎn)不同，有針對性地選擇雌性或雄性小鼠進(jìn)行造模。

有學(xué)者［12］應(yīng)用高脂飼料喂養(yǎng)自發(fā)高血壓大鼠構(gòu)建高血壓和高血脂HFpEF大鼠模型，但該模型成模時(shí)間至少23周，歷時(shí)較長，造模費(fèi)用偏高。在高血壓模型的基礎(chǔ)上尾靜脈注射鏈脲佐霉素（streptozocin，STZ），建立高血壓糖尿病模型，或者高糖高脂飼料聯(lián)合STZ注射，建立高血糖高血脂模型，均可產(chǎn)生HFpEF的病理特點(diǎn)［13-14］。但是上述2種模型HFpEF持續(xù)時(shí)間較短，易出現(xiàn)左心室擴(kuò)大和射血分?jǐn)?shù)降低，若用于HFpEF方面的研究，必須嚴(yán)格把握造模的條件和時(shí)間。

綜上所述，采用高脂飲食和L-NAME雙重干預(yù)的方法，可以在雄性和雌性小鼠中成功誘導(dǎo)HFpEF。模型穩(wěn)定持續(xù)時(shí)間長，在研究HFpEF或者左心室舒張功能障礙方面具有良好的應(yīng)用前景；而且雄性和雌性小鼠的HFpEF成模特點(diǎn)具有性別差異，有助于學(xué)者們根據(jù)研究目的和方向有針對性地進(jìn)行模型選擇。

參·考·文·獻(xiàn)

[1]Writing committee members,ACC/AHA task force members.2016 ACC/AHA/HFSA Focused Update on New Pharmacological Therapy for Heart Failure:an update of the 2013 ACCF/AHA guideline for the management of heart failure.A report of the American College of Cardiology/American Heart Association task force on clinical practice guidelines and the Heart Failure Society of America[J].Circulation,2016,134(13):e282-e293.

[2]Ponikowski P,Voors AA,Anker SD,et al.2016 ESC Guidelines for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure:the task force for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure of the European Society of Cardiology(ESC).Developed with the special contribution of the Heart Failure Association(HFA)of the ESC[J].Eur Heart J,2016,37(27):2129-2200.

[3]Dunlay SM,Roger VL,Redfield MM.Epidemiology of heart failure with preserved ejection fraction[J].Nat Rev Cardiol,2017,14(10):591-602.

[4]Lam CSP,Voors AA,de Boer RA,et al.Heart failure with preserved ejection fraction:from mechanisms to therapies[J].Eur Heart J,2018,39(30):2780-2792.

[5]林昊,潘建安,張俊峰,等.糖尿病、高血壓和心房顫動不同治療方案對射血分?jǐn)?shù)保留心力衰竭發(fā)生的影響[J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2020,40(10):1402-1407.

[6]Doris PA.Genetics of hypertension:an assessment of progress in the spontaneously hypertensive rat[J].Physiol Genomics,2017,49(11):601-617.

[7]Methawasin M,Strom JG,Slater RE,et al.Experimentally increasing the compliance of titin through RNA binding motif-20(RBM20)inhibition improves diastolic function in a mouse model of heart failure with preserved ejection fraction[J].Circulation,2016,134(15):1085-1099.

[8]Primessnig U,Sch?nleitner P,H?ll A,et al.Novel pathomechanisms of cardiomyocyte dysfunction in a model of heart failure with preserved ejection fraction[J].Eur J Heart Fail,2016,18(8):987-997.

[9]Chilian WM,Mass HJ,Williams SE,et al.Microvascular occlusions promote coronary collateral growth[J].Am J Physiol,1990,258(4 Pt 2):H1103-H1111.

[10]傅發(fā)源,陳良龍.一種新的大鼠冠狀動脈微栓塞模型[J].中國心血管病研究雜志,2004(4):296-299.

[11]沈成興,梁春,陳良龍,等.經(jīng)冠狀動脈內(nèi)注射月桂酸鈉構(gòu)建大鼠冠狀動脈微栓塞模型[J].中國動脈硬化雜志,2005,13(4):447-450.

[12]趙勝楠,何黎黎,李自強(qiáng),等.高血壓合并高脂血癥大鼠模型的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2018,28(2):33-39,89.

[13]Trachanas K,Sideris S,Aggeli C,et al.Diabetic cardiomyopathy:from pathophysiology to treatment[J].Hellenic J Cardiol,2014,55(5):411-421.

[14]Carbone S,Mauro AG,Mezzaroma E,et al.A high-sugar and high-fat diet impairs cardiac systolic and diastolic function in mice[J].Int J Cardiol,2015,198:66-69.

[15]Ocsan RJ,Lai YN,Prabhu KV,et al.Chronic NG-nitro-l-arginine methyl ester(L-NAME)administration in C57BL/6J mice induces a sustained decrease in c-kit positive cells during development of cardiac hypertrophy[J].J Physiol Pharmacol,2013,64(6):727-736.

[16]KopincováJ,PúzserováA,BernátováI.L-NAME in the cardiovascular system:nitric oxide synthase activator?[J].Pharmacol Rep,2012,64(3):511-520.