徐 勇 馬正邦 葉黃河 羅偉東 鄭沛翔 耿二朔 曹 璨 譚 政 梁智輝華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞分子生物實(shí)驗(yàn)中心武漢430030

傳統(tǒng)的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容的設(shè)計(jì)或因?qū)嶒?yàn)技術(shù)和理念問(wèn)題,多采用一個(gè)實(shí)驗(yàn)僅針對(duì)單一知識(shí)點(diǎn)與現(xiàn)象,通過(guò)側(cè)重講解實(shí)驗(yàn)原理、操作流程與實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以加深學(xué)生對(duì)這個(gè)知識(shí)點(diǎn)與現(xiàn)象的理解與認(rèn)識(shí)[1]。如華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)“流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞亞群”針對(duì)免疫細(xì)胞亞群等知識(shí)點(diǎn),“DNA Ladder檢測(cè)胸腺細(xì)胞凋亡”則針對(duì)胸腺細(xì)胞經(jīng)藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象知識(shí)點(diǎn)。而鮮有通過(guò)一個(gè)實(shí)驗(yàn)同時(shí)展示多個(gè)且相互間有聯(lián)系的知識(shí)點(diǎn)。2019年教育部教高[2019]6號(hào)文件中指出要加強(qiáng)課程體系整體設(shè)計(jì),提高課程建設(shè)規(guī)劃性、系統(tǒng)性,避免隨意性、碎片化[2]。同時(shí),受突發(fā)疫情影響,各類學(xué)校推遲學(xué)生返校,為響應(yīng)教育部“停課不停學(xué)”號(hào)召,全國(guó)高等院校均開(kāi)展了理論課網(wǎng)上直播教學(xué),并取得了顯著成效；雖然實(shí)驗(yàn)課也開(kāi)展了虛擬實(shí)驗(yàn)教學(xué)或家庭實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ?但并不能取代原實(shí)驗(yàn)課教學(xué)。在后疫情時(shí)期復(fù)學(xué)后,各地高校將面臨實(shí)驗(yàn)課補(bǔ)課與實(shí)驗(yàn)資源嚴(yán)重不足之矛盾,適當(dāng)壓縮、調(diào)整實(shí)驗(yàn)課程課時(shí)與內(nèi)容是可選手段之一。為此,本研究擬建立“五色流式細(xì)胞術(shù)同時(shí)檢測(cè)小鼠胸腺淋巴細(xì)胞亞群與細(xì)胞凋亡”的實(shí)驗(yàn)方法,用于建立“淋巴細(xì)胞亞群及其凋亡”的整合實(shí)驗(yàn),以期達(dá)到從學(xué)科內(nèi)部改進(jìn)整合與創(chuàng)新型免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容,亦可作為后疫情時(shí)期對(duì)實(shí)驗(yàn)課進(jìn)行調(diào)整壓縮的手段之一,保障“教學(xué)標(biāo)準(zhǔn)不降低,教學(xué)質(zhì)量不打折”。

1 材料與方法

1.1 材料 RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；胎牛血清(56℃,30 min滅活后使用)購(gòu)自杭州四季青公司；昆明小鼠由同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；LSR-Ⅱ流式細(xì)胞儀為BD公司產(chǎn)品,由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞工程平臺(tái)提供?？故驝D3-BV510、CD4-BV421、CD8-FITC抗體購(gòu)自Biolegend公司；細(xì)胞凋亡試劑盒(Annexin-V-APC/PI)購(gòu)自Bender Medsystems公司。

1.2 方法

1.2.1 胸腺細(xì)胞制備 取4～6周小鼠,頸椎脫位處死,無(wú)菌取胸腺,置于盛有不完全培養(yǎng)液的平皿中,洗滌去血跡、放入160目篩網(wǎng)上研磨,邊磨邊加RPMI1640培養(yǎng)液5 ml,獲取單個(gè)胸腺細(xì)胞懸液,離心沉淀后用5 ml PBS洗滌1次,加入不完全RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/ml,備用；

1.2.2 樣本管設(shè)置與編號(hào) 每個(gè)學(xué)生小組取9支流式管并編號(hào)1～9號(hào),設(shè)置空白管(1號(hào))、補(bǔ)償對(duì)照管(2～6號(hào))、Annexin-V、PI的FMO對(duì)照管(7～8號(hào))與實(shí)驗(yàn)管(9號(hào)),各管分別加入上述制備的胸腺細(xì)胞0.5 ml,加入PBS 2 ml,離心洗滌1次,去上清,90μl PBS重懸。

1.2.3 流式抗體稀釋、混合與分裝 由于流式抗體用量非常微量(0.25～1μl)且昂貴,為方便學(xué)生精確加樣,減少取樣過(guò)程中的損耗,參照抗鼠CD3、CD4、CD8熒光抗體說(shuō)明書(shū)推薦用量或滴定用量,計(jì)算實(shí)驗(yàn)所需總量,按照稀釋后10μl/樣本抗體使用量,用PBS分別稀釋后分裝至小EP管中,10μl/管,備用；抗鼠CD3/CD4/CD8混合熒光抗體則需先將3種熒光抗體混合后,再用PBS稀釋后并分裝,10μl/管,備用。

1.2.4 T細(xì)胞亞群免疫熒光染色 1號(hào)管加10μl PBS,2～4號(hào)分別加入抗鼠CD3、CD4、CD8熒光抗體10μl,5～6號(hào)加10μl PBS,7～9號(hào)加入抗鼠CD3/CD4/CD8混合熒光抗體10μl,4℃ 孵育30 min后,加PBS 2 ml,洗滌1次(1 500 r/min,6 min),去上清。

1.2.5 細(xì)胞凋亡染色(Annexin-V-APC/PI) 用100μl結(jié)合緩沖液懸浮各管細(xì)胞,5號(hào)、7號(hào)、9號(hào)管加入5μl Annexin-V-FITC,混勻,避光室溫孵育10 min后,6號(hào)、8號(hào)、9號(hào)再加5μl PI,混勻,避光室溫作用10 min。最后各管補(bǔ)充結(jié)合液300μl,1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 按流式細(xì)胞儀操作常規(guī),由實(shí)驗(yàn)教師依次調(diào)節(jié)空白管、補(bǔ)充對(duì)照管、FMO對(duì)照的各參數(shù)并設(shè)置好熒光補(bǔ)償,應(yīng)用LSR-Ⅱ型流式細(xì)胞儀FACSdiva軟件獲取20 000～50 000個(gè)細(xì)胞,并進(jìn)行結(jié)果分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的檢測(cè)與分析過(guò)程由實(shí)驗(yàn)老師邊操作邊簡(jiǎn)單講解,同學(xué)觀摩。

2.2 流式數(shù)據(jù)分析

2.2.1 胸腺T細(xì)胞及其亞群分析方法 胸腺T細(xì)胞及其亞群數(shù)據(jù)分析作圖方法如圖1A～C所示,參照補(bǔ)償對(duì)照、FMO對(duì)照管的熒光信號(hào)進(jìn)行界定,并顯示T細(xì)胞及其亞群所占比例。

2.2.2 胸腺T細(xì)胞及其亞群細(xì)胞凋亡數(shù)據(jù)分析方法 胸腺T細(xì)胞及其亞群細(xì)胞凋亡的分析作圖方法如圖1A～H所示,參考FMO對(duì)照管信號(hào)進(jìn)行界定,并顯示CD3+細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+CD8+T細(xì)胞、CD4-CD8-細(xì)胞凋亡比例。

3 新方法在醫(yī)學(xué)免疫學(xué)整合實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用與比較

通過(guò)招募征集到華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)班志愿者,嘗試開(kāi)設(shè)了整合實(shí)驗(yàn)課“小鼠胸腺T淋巴細(xì)胞亞群及其凋亡檢測(cè)”,按傳統(tǒng)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)課方式進(jìn)行小范圍授課,并與傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)課進(jìn)行了比較(表1)。

4 討論

圖1 五色流式細(xì)胞術(shù)同時(shí)檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群及其凋亡的結(jié)果分析Fig.1 Analysis of lymphocyte subsets and their apoptosis simultaneously detected by five-color flow cytometry

表1 新整合實(shí)驗(yàn)與兩個(gè)傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)的比較Tab.1 Comparison between new integration experiment and two traditional experiments

流式細(xì)胞術(shù)是應(yīng)用流式細(xì)胞儀,對(duì)處于快速、呈直線流動(dòng)狀態(tài)中的單列細(xì)胞或顆粒性物質(zhì)進(jìn)行逐個(gè)、多參數(shù)、定性/定量分析或分選的一種檢測(cè)技術(shù),經(jīng)過(guò)約半個(gè)世紀(jì)的發(fā)展,已成為現(xiàn)代生命科學(xué)研究和臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)不可或缺的重要技術(shù),并且已廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)理論研究、臨床實(shí)踐和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中[3-4]。淋巴細(xì)胞分類及其亞群、細(xì)胞凋亡均為免疫學(xué)中重要的教學(xué)內(nèi)容與知識(shí)點(diǎn)。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞分化群(CD分子)將淋巴細(xì)胞進(jìn)行分類、分亞群是簡(jiǎn)便、快捷、敏感、精確的重要技術(shù)手段[4]。細(xì)胞凋亡是生物體內(nèi)一種普遍存在的現(xiàn)象,它貫穿于機(jī)體的整個(gè)生命過(guò)程,從胚胎形成、新舊細(xì)胞交替,前T淋巴細(xì)胞清除,到某些組織的正常退化、萎縮與增生及腫瘤細(xì)胞的抑制等過(guò)程[4]。細(xì)胞凋亡檢測(cè)主要是利用細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)特點(diǎn)和生化特征來(lái)進(jìn)行的。細(xì)胞凋亡的典型形態(tài)學(xué)可通過(guò)光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡和電子顯微鏡觀察。利用細(xì)胞凋亡時(shí)染色質(zhì)或DNA斷裂的生化特征,運(yùn)用電泳技術(shù)可檢測(cè)到核染色體DNA片段化的“梯狀”電泳圖譜即DNA Ladder[5]。利用流式細(xì)胞分析術(shù),通過(guò)凋亡細(xì)胞磷脂酰絲氨酸(PS)膜翻轉(zhuǎn)原理檢測(cè)細(xì)胞凋亡是目前凋亡細(xì)胞檢測(cè)最為常用的技術(shù)方法之一,如Annexin-V/PI、Annexin-V/7-AAD雙染法等。

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院在醫(yī)學(xué)本科生和研究生免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)課程中開(kāi)設(shè)了“流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞亞群”和“DNA Ladder檢測(cè)胸腺細(xì)胞凋亡”兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)所建立的“五色流式細(xì)胞術(shù)同時(shí)檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群及其凋亡”方法,通過(guò)其實(shí)驗(yàn)過(guò)程、分析方法與結(jié)果解讀,不僅可清楚地顯示胸腺細(xì)胞中CD4-CD8-T細(xì)胞、CD4+CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞的比例,也能觀察到生理狀況下細(xì)胞在發(fā)育過(guò)程中經(jīng)過(guò)“陽(yáng)性選擇/陰性選擇”所經(jīng)歷的細(xì)胞凋亡事件,完全適用于將淋巴細(xì)胞亞群與細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)整合為一個(gè)實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容。

本團(tuán)隊(duì)還通過(guò)模擬開(kāi)設(shè)新整合實(shí)驗(yàn)課“小鼠胸腺T淋巴細(xì)胞亞群及其凋亡檢測(cè)”并與傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)課進(jìn)行了比較。新整合實(shí)驗(yàn)課所用課時(shí)只有3個(gè)學(xué)時(shí),與分別開(kāi)設(shè)的兩個(gè)傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)比較減少了3個(gè)學(xué)時(shí)；其所涉及的知識(shí)點(diǎn)與現(xiàn)象多達(dá)6個(gè),明顯多于分別開(kāi)設(shè)傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn),且相互間也不再是單一的、孤立的、片面的,而是相互間有聯(lián)系的、整體的、多個(gè)知識(shí)點(diǎn)與現(xiàn)象。

綜上所述,該新方法的建立非常有利于加強(qiáng)課程體系整合設(shè)計(jì)與創(chuàng)新,是立足學(xué)科內(nèi)部對(duì)相關(guān)性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行整合與創(chuàng)新的較好嘗試；亦可作為后疫情時(shí)期對(duì)實(shí)驗(yàn)課進(jìn)行壓縮、調(diào)整的手段之一,減少實(shí)驗(yàn)課補(bǔ)課的壓力,保障“教學(xué)標(biāo)準(zhǔn)不降低,教學(xué)質(zhì)量不打折”,助力創(chuàng)新型人才培養(yǎng)。