施逸凡 陶 冶 石艷春 魏 鵬 北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院北京100029

病毒樣顆粒(virus-like particles,VLPs)是由1種或多種病毒結(jié)構(gòu)蛋白通過自組裝形成的納米級(jí)顆粒,在形態(tài)上類似于天然病毒,但通常不含親本病原體遺傳物質(zhì)[1]。根據(jù)其親本病毒結(jié)構(gòu),VLPs可分為2類:無包膜VLPs和包膜VLPs,無包膜VLPs通常由1個(gè)或多個(gè)可自組裝成微粒的組分構(gòu)成,且不包含任何宿主成分,包膜VLPs則是由多組分的靶向病原體和宿主膜組分形成的復(fù)雜結(jié)構(gòu),與病原體形態(tài)相似[2]。由于此種結(jié)構(gòu)特點(diǎn),VLPs具有同天然病毒類似的抗原展示方式和高免疫原性,并具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、生物相容性高、顆粒均一性好、顆粒載體裝載率大、不含病毒基因、安全性高等優(yōu)勢(shì)。

作為新型納米生物材料,VLPs的應(yīng)用范圍因其自身性能特點(diǎn)不斷拓展,在生物醫(yī)學(xué)特別是疫苗研發(fā)領(lǐng)域尤其突出,疫苗研發(fā)也是VLPs最早及最廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域之一。VLPs不僅可整合同源或異源多聚體抗原,且與真實(shí)病毒結(jié)構(gòu)相似,可有效實(shí)現(xiàn)抗原提呈進(jìn)而誘導(dǎo)獲得性免疫治療策略。此外,采用不含遺傳物質(zhì)的VLPs生產(chǎn)的疫苗相較于減毒疫苗安全性更高。因此,VLPs為疫苗開發(fā)及生產(chǎn)提供了新思路和新方法,在新型亞單位疫苗制備中極具潛力。目前,多種VLPs制備的疫苗已獲批上市,如HBV疫苗(Engerix-BV?、Enivac HBV?等)、H1N1疫苗(Inflexal?V)、HPV疫苗(Gardasil?、Cervarix?)等[3]。本文綜述VLPs疫苗的設(shè)計(jì)和應(yīng)用原理,對(duì)其在免疫防治中的應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行重點(diǎn)梳理,并對(duì)其在突發(fā)傳染病如新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)等防控中的應(yīng)用前景進(jìn)行展望。

1 VLPs的制備及表達(dá)系統(tǒng)

VLPs的制備過程一般包括以下步驟:病毒結(jié)構(gòu)基因構(gòu)建與克隆、宿主表達(dá)系統(tǒng)選擇、分離純化、分析鑒定等[4]。VLPs常用表達(dá)系統(tǒng)包括大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等(表1)[5]。采用以上表達(dá)系統(tǒng)制備的VLPs在生物相容性、熱穩(wěn)定性、靶向性、免疫原性等方面表現(xiàn)良好,在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域備受關(guān)注[3]。目前已有100余種VLPs被制備及鑒定,圖1為其中4種來源于不同病毒種屬的VLPs晶體結(jié)構(gòu)。

2 VLPs疫苗的構(gòu)建與應(yīng)用原理

一種新疫苗的開發(fā)通常需要15～20年及數(shù)十億美元的持續(xù)投入,過去40年間,為更容易和低成本設(shè)計(jì)新抗原和佐劑并將其納入新的疫苗配方,包括VLPs疫苗技術(shù)在內(nèi)的多種新技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生[9]。傳統(tǒng)疫苗如減毒疫苗、化學(xué)滅活疫苗、類毒素等亞單位疫苗均存在不同程度的缺陷。減毒病毒在免疫功能低下的受試者體內(nèi)可能會(huì)重新激活毒力狀態(tài),或具有嚴(yán)重副作用；化學(xué)滅活疫苗或亞單位疫苗在安全性上有所提高,但免疫原性較低僅能刺激較弱的免疫反應(yīng),無法獲得終身免疫,需多次注射[10]。因此,VLPs疫苗高效的抗原呈遞方式受到廣泛關(guān)注,有望解決長(zhǎng)期存在的疫苗安全性與免疫原性問題。

VLPs發(fā)揮免疫原性基于其粒徑大小與立體結(jié)構(gòu)的特性。VLPs與病原體大小相似(20～200 nm),可有效進(jìn)入淋巴管并引流至淋巴結(jié),從而傳送至相關(guān)的免疫細(xì)胞群體及其細(xì)胞間隔[11-12]。VLPs具有與病原體相似的幾何構(gòu)象和高度重復(fù)顯示的抗原表位,這種抗原表位既可以是未經(jīng)修飾的1種或多種同源病原體抗原,也可以是通過基因融合或化學(xué)結(jié)合方式進(jìn)行修飾表達(dá)的異源抗原或表位肽[6,11]。靈活多樣的抗原表達(dá)方式使VLPs既可作為預(yù)防性疫苗,通過表達(dá)外源性免疫原性分子誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生對(duì)特定病原體的獲得性免疫,又可作為治療性疫苗,通過誘導(dǎo)針對(duì)機(jī)體內(nèi)源性分子的特異性抗體產(chǎn)生在癌癥、自身免疫性疾病等治療中發(fā)揮優(yōu)勢(shì)作用[3]。

圖1 不同病毒種屬的VLPs晶體結(jié)構(gòu)[7-8]Fig.1 Crystal structures of VLPs of different virus species[7-8]

表1 制備VLPs的不同表達(dá)系統(tǒng)比較[1-2，4，6]Tab.1 Comparison of different expression systems for VLPs preparation[1-2，4，6]

接種VLPs疫苗后可通過多種潛在方式刺激固有和適應(yīng)性免疫應(yīng)答。VLPs疫苗既可直接誘導(dǎo)B細(xì)胞免疫球蛋白受體交聯(lián)和B細(xì)胞激活,也可作為外源性抗原被樹突狀細(xì)胞(dendritic cell,DCs)等專職抗原提呈細(xì)胞的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor,PRR)識(shí)別并攝取,通過MHCⅡ類分子提呈給CD4+T細(xì)胞活化產(chǎn)生濾泡輔助性T細(xì)胞(helper T cell,Tfh),從而誘導(dǎo)特異性效應(yīng)B細(xì)胞活化和體液免疫,也可通過MHCⅠ類分子以“交叉呈遞”形式呈遞給CD8+T細(xì)胞,誘導(dǎo)機(jī)體特異性細(xì)胞免疫保護(hù)機(jī)體(圖2)[1,13]。這種“交叉呈遞”的抗原提呈方式使VLPs疫苗相較于傳統(tǒng)疫苗具有明顯優(yōu)勢(shì),通常情況下滅活疫苗或亞單位疫苗作為外源性抗原無法感染細(xì)胞或在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)抗原,對(duì)CD8+T細(xì)胞的激活能力較差[13]。此外,某些VLPs通過包裹核酸作為佐劑,可通過病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMP)作用于細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的Toll樣受體的配體,進(jìn)一步增強(qiáng)免疫應(yīng)答[11]。

3 VLPs疫苗在疾病預(yù)防與治療中的應(yīng)用

基于上述原理及VLPs在疫苗領(lǐng)域的明顯優(yōu)勢(shì),目前已有針對(duì)HBV、HPV、HEV、瘧疾、流感的VLPs疫苗相繼獲批上市,同時(shí)針對(duì)多種病毒、疾病的預(yù)防性疫苗和治療性疫苗處于臨床試驗(yàn)階段。

圖2 基于VLP疫苗誘導(dǎo)先天和適應(yīng)性免疫原理示意圖Fig.2 Schematic diagram showing potential ways the VLP-based vaccine can stimulate innate and adaptive immune responses

3.1 基于VLPs的乙肝病毒疫苗 1981年,研究者利用從感染者血液中純化出的乙肝表面抗原顆粒構(gòu)建了第一代基于VLPs的血漿源乙型肝炎疫苗,如Heptavax-B?[10]。隨后,幾家疫苗制造商采用重組DNA技術(shù)在轉(zhuǎn)染酵母(Saccharomyces cerevisiae,Pichia pastoris,Hansenula polymorpha)中高效表達(dá)HBsAgS,使酵母源乙型肝炎疫苗得到發(fā)展為“第二代”乙型肝炎疫苗。二代疫苗克服了一代疫苗受血漿供應(yīng)的限制和安全性缺陷問題,并在世界范圍內(nèi)顯著降低了HBV的發(fā)病率[14]。三代疫苗Bio-Hep-BTM等則是一種酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞來源的重組Pre-S1/Pre-S2/S乙型肝炎疫苗,可按不同比例表達(dá)HBsAgS、HBsAgM、HBsAgL并形成VLPs。與傳統(tǒng)真核酵母細(xì)胞來源的疫苗相比,該疫苗具有高度免疫原性,可在較低劑量以更快的速度誘導(dǎo)產(chǎn)生更高的乙型肝炎病毒血清保護(hù)率,并具有更高的抗HBs水平。研究表明,該疫苗在干預(yù)持續(xù)性乙肝病毒感染方面也可能有效[15]。同時(shí),HBsAg顆粒表現(xiàn)出接受和呈遞外源抗原序列的良好能力,可作為嵌合抗原VLPs平臺(tái)用于構(gòu)建預(yù)防或治療脊髓灰質(zhì)炎、瘧疾、HIV、登革熱等疾病的疫苗[14]。

3.2 基于VLPs的人乳頭瘤病毒疫苗 人乳頭瘤病毒(HPV)是一種極為常見的性傳播病毒,其高危Ⅱ型(如HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59)被認(rèn)為是生殖系統(tǒng)癌癥(如宮頸癌、外陰癌、陰道癌、陰莖癌和肛門癌)及部分頭頸部癌癥的主要病因[16]。目前FDA已批準(zhǔn)3種基于VLPs的HPV疫苗,分別是二價(jià)疫苗(Cervarix?,葛蘭素史克公司)、四價(jià)疫苗(Gardasil?,默沙東公司)及九價(jià)疫苗(Gardasil9?,默沙東公司),均采用純化的L1蛋白制備[16]。2006年,第一種HPV疫苗Gardasil?在美國(guó)獲批,該疫苗由HPV 6型、11型、16型和18型的主要衣殼蛋白L1自組裝而成,用于預(yù)防宮頸癌、生殖系統(tǒng)癌前病變和生殖器疣。2014年,四價(jià)Gardasil?被九價(jià)Gardasil9?所取代,增加覆蓋了HPV 31型、33型、45型、52型和58型,具有更高的L1抗原載量和更多的佐劑[17]。針對(duì)世界范圍內(nèi)優(yōu)勢(shì)流行株的二價(jià)Cervarix?(16型、18型)于2007年獲批,是3種疫苗中抗原濃度最低,且含有1種增強(qiáng)免疫原性的高級(jí)佐劑AS04,可刺激機(jī)體產(chǎn)生更高血清中和抗體應(yīng)答率及更持久的抗體反應(yīng)[18]。此外,多種以E1、E2、E6和E7癌蛋白為靶點(diǎn)的HPV治療性疫苗也已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段[16]。

3.3 基于VLPs的戊肝病毒疫苗 一次昆蟲細(xì)胞表達(dá)的HEV衣殼蛋白重組肽可保護(hù)靈長(zhǎng)類動(dòng)物免受急性肝炎侵襲的研究證實(shí),衣殼蛋白中存在中和表位,為重組HEV疫苗的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)[19]。2011年,萬泰生物制藥有限公司研發(fā)的基于VLPs的戊型肝炎疫苗益可寧?在中國(guó)獲批用于人體,疫苗基于大腸桿菌表達(dá)的氨基酸序列p239(與HEV衣殼蛋白pORF2的aa 368-606對(duì)應(yīng))[19]。實(shí)驗(yàn)證明,益可寧?不僅在中國(guó)16～65歲的患者中具有良好的安全性及有效性,也在65歲以上人群中具有免疫原性及良好的耐受性[20]。

3.4 基于VLPs的瘧疾疫苗 2015年,基于VLPs的瘧疾疫苗RTS,S/AS01獲批,成為當(dāng)時(shí)世界上最先進(jìn)的抗惡性瘧原蟲瘧疾候選疫苗[21]。RTS,S/AS01以乙型肝炎表面抗原為基質(zhì)載體,從惡性瘧原蟲的環(huán)孢子體(CS)蛋白中獲得抗原表位,并聯(lián)合應(yīng)用AS01作為佐劑[14]。該疫苗在撒哈拉以南非洲流行地區(qū)兒童中有效率高達(dá)50%,但對(duì)首次感染者缺乏顯著療效,仍有改善空間[22]。而英國(guó)詹納研究所研發(fā)的R21由CS多肽-乙型肝炎表面抗原(HBsAg)融合蛋白形成VLPs,與RTS、S相比具有更高的免疫原性[23]。

3.5 基于VLPs的流感疫苗 基于VLPs的流感疫苗是由流感病毒免疫原性激活物(血凝素HA和神經(jīng)氨酸苷酶NA)其一或兩者共同組成,以目前上市的Inflexal?(Crucell Berna Biotech公司)為例,與基于DNA的流感疫苗相比,其優(yōu)勢(shì)在于構(gòu)架中含有參與宿主流感感染保護(hù)的NA。2009年抗擊H1N1病毒的經(jīng)驗(yàn)表明,基于傳統(tǒng)技術(shù)的流感疫苗生產(chǎn)工藝復(fù)雜且生產(chǎn)周期較長(zhǎng),疫苗制備和供應(yīng)推遲導(dǎo)致H1N1病毒蔓延而基于VLPs的流感疫苗在研發(fā)過程中生產(chǎn)簡(jiǎn)易快速[24]。目前臨床研究階段的VLPs流感疫苗主要為三價(jià)疫苗(甲型流感病毒H1N1型、H3N2型、乙型流感病毒的1個(gè)分支)和四價(jià)疫苗(甲型流感病毒H1N1型、H3N2型和乙型流感病毒的2個(gè)分支),未來將開發(fā)包含多種HA和NA亞型蛋白的VLPs疫苗,如多價(jià)HA亞型(H5.H7.H9)VLP疫苗[25]。

3.6 其他臨床試驗(yàn)階段VLPs疫苗概述 VLPs疫苗除可應(yīng)用于HBV、HPV、HEV、瘧疾、流感等預(yù)防外,多種基于VLPs的預(yù)防性或治療性疫苗已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段,主要針對(duì)諾如病毒、基孔肯雅病毒、BK多瘤病毒、人類細(xì)小病毒B19等,同時(shí)針對(duì)阿爾茲海默癥、惡性腫瘤(黑色素瘤、乳腺癌)、尼古丁依賴、高血壓等疾病治療與病情控制的多種VLPs疫苗也已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段(表2)。

4 VLPs疫苗在新發(fā)傳染病疫苗中的應(yīng)用

VLPs疫苗開發(fā)周期較短的特點(diǎn)在新發(fā)傳染病的防治中具有極大潛力。如2020年3月11日被世界衛(wèi)生組織宣布為大流行的COVID-19疫苗研發(fā)中,盡管目前尚未有新冠疫苗獲批上市,但林金鐘、徐穎潔等通過以不同比例配比經(jīng)修飾的含有S、M和E基因的mRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞,獲得了具有明顯冠狀病毒特征的VLPs,且可明顯觀察到該VLPs可成功表達(dá)新型冠狀病毒的特征性抗原S糖蛋白,且以三聚體形式密集排布于VLP表面,為制備有效COVID-19 VLPs疫苗創(chuàng)造了條件[42-43]。與此同時(shí),諾瓦瓦克斯醫(yī)藥公司(Novavax)宣布開發(fā)了1種基于新型冠狀病毒S糖蛋白和該公司專有佐劑Matrix-M的VLPs疫苗,并已進(jìn)入動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段[44]。2020年3月16日,上海市科委在新聞發(fā)布會(huì)上表示,小鼠在VLPs疫苗的免疫實(shí)驗(yàn)已產(chǎn)生特異性抗體,后續(xù)研究將繼續(xù)在上海巴斯德研究所進(jìn)行。

在COVID-19大流行前,世界范圍內(nèi)曾出現(xiàn)過2種可引起人類死亡的冠狀病毒SARS-CoV和MERSCoV,分別導(dǎo)致嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)和中東呼吸綜合征(MERS)爆發(fā)。針對(duì)同屬冠狀病毒的疫苗開發(fā)中,VLPs疫苗同樣扮演重要角色。2015年,Novavax成功表達(dá)出含有三聚體S蛋白的MERSCoV VLPs,將其與Matrix-M佐劑聯(lián)用在小鼠和轉(zhuǎn)基因牛中成功誘導(dǎo)出中和抗體,并證明通過將免疫牛血清單次注射給未免疫小鼠可產(chǎn)生對(duì)MERS-CoV的完全保護(hù)作用[44]。2016年,研究者將犬細(xì)小病毒VP2結(jié)構(gòu)蛋白基因與MERS冠狀病毒受體結(jié)合域蛋白融合自組裝成嵌合VLPs,可激活小鼠特異性體液和細(xì)胞免疫反應(yīng),表明基于MERS-CoV受體結(jié)合域的VLPs疫苗在潛在暴發(fā)情況下是有潛力的預(yù)防手段[45]。

5 VLPs應(yīng)用前景與展望

在疫苗開發(fā)領(lǐng)域,盡管VLPs疫苗具有下游生產(chǎn)成本較高、純化和分離過程層析樹脂較貴等需進(jìn)一步改進(jìn)的問題,但其優(yōu)勢(shì)顯而易見[46]。VLPs疫苗的應(yīng)用有望解決目前新型疫苗生產(chǎn)周期較長(zhǎng)、開發(fā)成本較高、熱穩(wěn)定性較差、需高成本冷鏈儲(chǔ)存和運(yùn)輸、部分疫苗免疫原性較低需多次注射等問題,并拓展了黏膜疫苗、口服疫苗的構(gòu)建方式[3,5]。同時(shí),VLPs作為一種新型納米材料在多個(gè)領(lǐng)域也被廣泛應(yīng)用。在分子載體方面,相較于其他運(yùn)載手段,VLPs在穩(wěn)定性、分子大小及跨膜運(yùn)輸?shù)确矫姹憩F(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)[49]；VLPs對(duì)目標(biāo)宿主細(xì)胞的天然親和力特性已被用于如基因治療、靶向給藥等細(xì)胞靶向應(yīng)用[3]；在生物成像方面,VLPs與熒光染料或其他探針進(jìn)行生物偶聯(lián)也展現(xiàn)出較好的生物相容性,并可用于揭示病毒感染機(jī)制等基礎(chǔ)研究[2,47]。

表2 臨床研究階段VLPs疫苗Tab.2 VLPs vaccines in clinical development

近年突發(fā)高致病性病毒逐漸呈長(zhǎng)期存在和不斷突變進(jìn)化的趨勢(shì),值得疫苗開發(fā)領(lǐng)域人員關(guān)注。就冠狀病毒來看,SARS-CoV在爆發(fā)后消失無蹤,但MERS-CoV從2019年1月至2020年1月仍有221例病例出現(xiàn),目前新型冠狀病毒也逐漸呈現(xiàn)出與人類長(zhǎng)期共存的可能性[48]。在這種情況下,新型疫苗的開發(fā)在突發(fā)傳染病的防控中至關(guān)重要。VLPs疫苗在流感疫苗和冠狀病毒疫苗開發(fā)中的成功案例為其在突發(fā)傳染病預(yù)防中發(fā)揮更加重要的作用提供了有力證明,有理由將VLPs疫苗作為突發(fā)傳染病疫苗設(shè)計(jì)的優(yōu)先策略。