趙 敏 厲永強 石貞玉（河南大學(xué)淮河醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，開封 475000）

肺癌是惡性腫瘤中發(fā)病率和死亡率增長最快的疾病之一，更是全球癌癥相關(guān)死亡的最主要原因，對人類的健康和生命構(gòu)成嚴(yán)重威脅［1］。由于肺癌起病隱匿，確診時多為中晚期，且手術(shù)、放化療后易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，縮短了患者的生存期。因此，尋找有效的診療靶點抑制肺癌的轉(zhuǎn)移是目前肺癌治療的重大課題。微小RNA（microRNA，miRNA）是長度為20～25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA，其通過與靶基因的3′非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）結(jié)合調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活、增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移［2］。大量研究證實，在包括肺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中，miRNA發(fā)揮抑癌基因或致癌基因作用［3-4］。miR-4286位于人染色體8p23.1位點，已經(jīng)證實可參與調(diào)節(jié)黑色素瘤、食管鱗癌和胰腺癌進(jìn)程［5-7］。在肺癌細(xì)胞中，miR-4286呈高表達(dá)，其高表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)［8］。然而，miR-4286在肺癌進(jìn)展中的作用機(jī)制并未完全闡明。生物信息學(xué)分析顯示叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子O4（forkhead box O4，F(xiàn)OXO4）可能是miR-4286的靶基因，作為一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，研究顯示肺癌中FOXO4表達(dá)顯著降低，抑制其表達(dá)可促進(jìn)肺癌轉(zhuǎn)移［9-10］。但miR-4286能否靶向FOXO4參與肺癌進(jìn)展尚未明確。本研究旨在揭示miR-4286和FOXO4在肺癌細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)移和凋亡中的作用，為miR-4286在肺癌臨床生物治療中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 組織來源 選擇我院收治的肺癌患者29例，其中男性17例，女性12例；年齡40～75歲。分別取其肺癌組織及與其對應(yīng)的癌旁組織，手術(shù)切除后立即放入液氮中保存，隨后放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。所有病例術(shù)前均未接受化療或放療。所有患者均簽署知情同意書，且經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 細(xì)胞株和主要試劑 肺癌細(xì)胞A549購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清購于美國Hyclone公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Pre?mix Ex TaqⅡ試劑盒購于大連寶生物工程有限公司；miRNA抑制物陰性對照（anti-miR-NC）、miR-4286抑制物（anti-miR-4286）、小干擾RNA陰性對照（si-NC）、FOXO4小干擾RNA（si-FOXO4）購于上海生工生物工程有限公司；細(xì)胞計數(shù)試劑盒（cell counting kit 8，CCK-8）、膜聯(lián)蛋白V異硫氰光素?zé)晒馑?碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于杭州貝博生物公司；Transwell小室和基質(zhì)膠購于美國Cornning公司；兔源FOXO4、P21、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase-3）、上皮細(xì)胞鈣黏蛋白（E-cadherin）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix me?talloproteinase 2，MMP-2）和磷酸甘油醛脫氫酶（glyc?eraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體購于美國Abcam公司；山羊抗兔二抗購于北京中山金橋生物科技有限公司。實驗引物由上海生工生物工程有限公司提供。FOXO4上游引物5′-CCGGCAAAAGCTCTTGGTG-3′，下 游 引 物5′-GGTCCACATATCGGCTTCTTCA-3′；GAPDH上游引物5′-TG?GTGAAGACGCCAGTGGA-3′，下游引物5′-GCACC?GTCAAGGCTGAGAAC-3′；miR-4286上游引物5′-ACACTCCAGCTGGGACCCCACTCCT-3′，下游引物5′-TACCAGGAGTGGGGTTT-3′；U6上 游 引 物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AAGGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2 方法

1.2.1 RT-qPCR檢 測miR-4286和FOXO4 mRNA的表達(dá)Trizol法檢測肺癌組織、癌旁組織中總RNA，將提取的總RNA溶解于RNase-free水，紫外分光光度計檢測RNA濃度和純度。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA后，按照SYBR Pre?mix Ex TaqⅡ試劑盒說明書對miR-4286和FOXO4進(jìn)行PCR擴(kuò)增。miR-4286的檢測以U6為內(nèi)參，F(xiàn)OXO4 mRNA的檢測以GAPDH為內(nèi)參。2-ΔΔCt法計算miR-4286和FOXO4 mRNA的相對表達(dá)水平。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和實驗分組 將A549細(xì)胞分為anti-miR-NC組（轉(zhuǎn)染anti-miR-NC）和anti-miR-4286組（轉(zhuǎn)染anti-miR-4286）。采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)肺癌A549細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前1 d，將A549細(xì)胞以2×105個/孔的密度接種于6孔板，按照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000說明書將anti-miR-NC、anti-miR-4286分別轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h，檢測轉(zhuǎn)染效果合格后進(jìn)行其他指標(biāo)檢測。為證實miR-4286是通過調(diào)控FOXO4進(jìn)而影響A549細(xì)胞的增殖、遷移侵襲能力和凋亡，將A549細(xì)胞分為anti-miR-4286+si-NC組（共轉(zhuǎn)染anti-miR-4286和si-NC）和anti-miR-4286+si-FOXO4組（共轉(zhuǎn)染anti-miR-4286和si-FOXO4），轉(zhuǎn)染48 h檢測轉(zhuǎn)染效果合格后檢測細(xì)胞的增殖、遷移侵襲能力及凋亡變化。

1.2.3 CCK-8法檢測細(xì)胞存活 將1×104個A549細(xì)胞接種于96孔板，根據(jù)實驗分組進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)箱孵育48 h，向各孔內(nèi)加入10μl CCK-8試劑，繼續(xù)孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm處各孔的吸光度值，計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=（實驗組OD-空白組OD）/（對照組OD-空白組OD）。

1.2.4 克隆形成實驗檢測細(xì)胞克隆形成能力 收集轉(zhuǎn)染48 h的anti-miR-NC組、anti-miR-4286組、an?ti-miR-4286+si-NC組 和anti-miR-4286+si-FOXO4組A549細(xì)胞，胰酶消化后，取2×103個細(xì)胞均勻分散鋪于6孔板，細(xì)胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)7 d，當(dāng)出現(xiàn)肉眼可見的集落時，棄去培養(yǎng)基，PBS緩沖液洗滌細(xì)胞1次，依次加入多聚甲醛和結(jié)晶紫染液進(jìn)行固定和染色，PBS緩沖液沖洗3次，常溫晾干后，顯微鏡下統(tǒng)計大于50個細(xì)胞的集落數(shù)。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集轉(zhuǎn)染48 h的anti-miR-NC組、anti-miR-4286組、anti-miR-4286+si-NC組和anti-miR-4286+si-FOXO4組A549細(xì)胞，胰酶消化后，PBS洗滌細(xì)胞2次，離心后加入適量結(jié)合緩沖液制備細(xì)胞濃度為1×106個/ml的單細(xì)胞懸液。取100μl細(xì)胞懸液加入流式管，按照Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒分別加入5μl Annexin V-FITC和5μl PI，避光孵育15 min，補加結(jié)合緩沖液至500μl，混勻后1 h上機(jī)檢測各組A549細(xì)胞凋亡情況。

1.2.6 Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移和侵襲 侵襲實驗：將基質(zhì)膠均勻平鋪于Transwell小室上室膜，備用。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h消化后，采用無血清培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液。取200μl接種于Transwell上室，24孔板下室僅加入500μl含20%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，將含有Transwell小室的24孔板置于培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室，輕輕擦去上室膜未過膜細(xì)胞后，依次采用多聚甲醛、結(jié)晶紫進(jìn)行固定和染色，將Transwell小室倒置于顯微鏡下觀察細(xì)胞過膜情況，隨機(jī)選取5個視野進(jìn)行計數(shù)和拍照，以其均值表示侵襲細(xì)胞數(shù)目。遷移實驗采用未包被基質(zhì)膠的Transwell小室，其他步驟同上。

1.2.7 Western blot檢測FOXO4、P21、Caspase-3、Ecadherin和MMP-2蛋白的表達(dá) 采用RIPA分別提取anti-miR-NC組、anti-miR-4286組、anti-miR-4286+si-NC組 和anti-miR-4286+si-FOXO4組A549細(xì) 胞 的總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度。沸水浴3 min變性細(xì)胞蛋白，配制濃縮膠和分離膠，以每泳道30μg蛋白樣品上樣，隨后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。結(jié)束后，常規(guī)濕法將分離細(xì)胞蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。將膜置于5%的牛血清蛋白溶液中室溫條件封閉1 h，洗膜后，將膜置于稀釋的一抗溶液室溫孵育2 h，洗膜，將膜置于稀釋的二抗溶液中室溫孵育1 h，洗膜后，于暗室進(jìn)行化學(xué)發(fā)光盒顯色。以GAPDH為內(nèi)參，采用Image J分析軟件分析各條帶的灰度值，以目的蛋白灰度值和GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白相對表達(dá)量。

1.2.8 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-4286和FOXO4的靶向關(guān)系 采用TargetScan在線分析軟件預(yù)測miR-4286的靶基因，發(fā)現(xiàn)FOXO4是miR-4286的潛在功能性靶基因之一，推測miR-4286能靶向調(diào)控FOXO4表達(dá)，并進(jìn)行雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C。構(gòu)建含有FOXO4-3′UTR序列的野生型熒光素酶報告質(zhì)粒（WT-FOXO4）及含有FOXO4-3′-UTR突變序列的突變型熒光素酶報告質(zhì)粒（MUT-FOXO4），質(zhì)粒構(gòu)建由上海吉瑪公司完成。將A549細(xì)胞接種至6孔板，利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000將WT-FOXO4、MUT-FOXO4分別與miR-NC、miR-4286 mimics共轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞，6 h后更換為完全細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后檢測各組細(xì)胞熒光素酶活性變化。為驗證miR-4286對FOXO4的調(diào)控作用，以miR-NC、miR-4286 mimics、anti-miR-NC、anti-miR-4286分別轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h裂解細(xì)胞按照Western blot步驟檢測FOXO4蛋白的表達(dá)變化。

2 結(jié)果

2.1 miR-4286、FOXO4在肺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)RT-qPCR檢測肺癌組織和癌旁組織中miR-4286和FOXO4 mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示，肺癌組織中miR-4286的表達(dá)較癌旁組織顯著升高，F(xiàn)OXO4 mRNA的表達(dá)較癌旁組織顯著降低（P＜0.05）。見表1。

表1 miR-4286、FOXO4在肺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)（±s）Tab.1 Expressions of miR-4286 and FOXO4 in lung can-cer and paracancerous tissues（±s）

表1 miR-4286、FOXO4在肺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)（±s）Tab.1 Expressions of miR-4286 and FOXO4 in lung can-cer and paracancerous tissues（±s）

Note：1）P＜0.05，compared with paracancerous tissue group.

FOXO4 mRNA 1.01±0.10 0.22±0.021）41.717＜0.001 Groups Paracancerous tissue Lung cancer tissue n 29 29 t P miR-4286 0.99±0.10 2.35±0.211）31.488＜0.001

2.2 抑制miR-4286對肺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響見圖1，轉(zhuǎn)染anti-miR-4286抑制miR-4286表達(dá)后，A549細(xì)胞中P21和Caspase-3蛋白表達(dá)顯著升高，細(xì)胞存活率從（100.12±10.06）%降為（47.95±4.68）%，克隆形成數(shù)從162±15.31降為76±7.15，細(xì)胞凋亡率從（7.65±0.83）%升高為（23.21±2.26）%（P＜0.05）。

圖1 抑制miR-4286對肺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響Fig.1 Effect of inhibiting miR-4286 on proliferation and apoptosis of lung cancer cells

2.3 抑制miR-4286對肺癌細(xì)胞遷移、侵襲的影響 見圖2，轉(zhuǎn)染anti-miR-4286抑制miR-4286表達(dá)后，A549細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)顯著增加，MMP-2蛋白的表達(dá)顯著降低，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)顯著降低（P＜0.05）。

圖2 抑制miR-4286對肺癌細(xì)胞遷移、侵襲及E-cadherin、MMP-2蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effect of inhibiting miR-4286 on lung cancer cell migration，invasion，and expression of E-cadherin and MMP-2 proteins

2.4 miR-4286靶向、調(diào)控FOXO4表達(dá)TargetScan預(yù)測miR-4286的靶基因結(jié)果顯示，miR-4286和FOXO4的3′-UTR區(qū)域存在部分連續(xù)互補的核苷酸序列，見圖3A。雙熒光素酶報告實驗驗證miR-4286和FOXO4的靶向關(guān)系發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-4286表達(dá)可降低轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-FOXO4的A549細(xì)胞的熒光素酶活性（P＜0.05）；而上調(diào)miR-4286表達(dá)對轉(zhuǎn)染MUTFOXO4的A549細(xì)胞的熒光素酶活性無顯著影響（圖3B），Western blot結(jié)果顯示上調(diào)miR-4286表達(dá)后A549細(xì)胞FOXO4在mRNA和蛋白水平的表達(dá)顯著降低；抑制miR-4286表達(dá)后A549細(xì)胞FOXO4蛋白的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），見圖3C。

圖3 miR-4286靶向調(diào)控FOXO4Fig.3 miR-4286 targets regulated FOXO4

2.5 抑制FOXO4能逆轉(zhuǎn)抑制miR-4286對肺癌細(xì)胞增殖、凋亡的作用 見圖4，與anti-miR-4286和si-NC共轉(zhuǎn)染組比較，anti-miR-4286和si-FOXO4共轉(zhuǎn)染組A549細(xì)胞FOXO4、P21和Caspase-3蛋白表達(dá)顯著降低，細(xì)胞存活率從（48.23±4.61）%升高為（86.91±8.58）%，克隆形成數(shù)從77±7.15升高為137±12.94，細(xì)胞凋亡率從（23.11±2.18）%降為（11.34±1.26）%（P＜0.05）。抑制FOXO4表達(dá)可逆轉(zhuǎn)抑制miR-4286對肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

圖4 抑制FOXO4能逆轉(zhuǎn)抑制miR-4286對肺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響Fig.4 Inhibiting FOXO4 can reverse effects of inhibition of miR-4286 on lung cancer cell proliferation and apoptosis

2.6 抑制FOXO4能逆轉(zhuǎn)抑制miR-4286對肺癌細(xì)胞遷移、侵襲的作用 見圖5，與anti-miR-4286和si-NC共轉(zhuǎn)染組比較，anti-miR-4286和si-FOXO4共轉(zhuǎn)染組A549細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)顯著降低，MMP-2蛋白表達(dá)顯著升高，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)顯著增加（P＜0.05）。提示抑制FOXO4表達(dá)可逆轉(zhuǎn)抑制miR-4286對肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

圖5 抑制FOXO4能逆轉(zhuǎn)抑制miR-4286肺癌細(xì)胞遷移、侵襲及E-cadherin、MMP-2蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Inhibiting FOXO4 can reverse effects of inhibiting miR-4286 on lung cancer cell migration，invasion，and E-cadherin，MMP-2 protein expression

3 討論

腫瘤轉(zhuǎn)移是一個多步驟、多基因參與，并受精確調(diào)控的過程。闡明肺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋找有效抑制肺癌轉(zhuǎn)移的靶基因?qū)Ψ伟┗颊叩木珳?zhǔn)治療意義重大。

miR-4286已被證實是腫瘤進(jìn)展的重要參與者。KOMINA等［5］研究發(fā)現(xiàn)黑色素瘤中miR-4286表達(dá)顯著增加，轉(zhuǎn)染miR-4286抑制劑后黑色素瘤細(xì)胞凋亡率增加2.6倍，細(xì)胞增殖活力下降1.7倍。LI等［11］指出miR-4286在前列腺癌中呈高表達(dá)，下調(diào)miR-4286可抑制前列腺癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。ZHANG等［6］研究表明，miR-4286高表達(dá)通過激活蛋白酪氨酸激酶2/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與激活子3（JAK2/STAT3）信號通路顯著增加細(xì)胞活力以及遷移、侵襲能力，促進(jìn)食管癌發(fā)生發(fā)展。本研究顯示，肺癌組織中miR-4286表達(dá)顯著升高，抑制miR-4286可促進(jìn)A549細(xì)胞P21和Caspase-3蛋白表達(dá)，降低細(xì)胞增殖、遷移侵襲能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。黏附和侵襲在腫瘤轉(zhuǎn)移中起重要作用，E-cadherin是一種典型的鈣黏蛋白，其下調(diào)導(dǎo)致上皮細(xì)胞特征的喪失和間充質(zhì)表型的獲得，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖、運動和侵襲，并可能導(dǎo)致癌癥進(jìn)展［12］。MMP-2是破壞是腫瘤侵襲屏障的關(guān)鍵蛋白酶，其表達(dá)增加與腫瘤的轉(zhuǎn)移潛能增加有關(guān)［13］。因此，抑制miR-4286可能通過抑制A549細(xì)胞MMP-2表達(dá)，促進(jìn)E-cadherin表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮抗肺癌轉(zhuǎn)移作用。既往研究顯示，miR-4286過表達(dá)在肺癌細(xì)胞中具有腫瘤啟動子作用，抑制miR-4286表達(dá)除可抑制細(xì)胞活力、增殖和遷移以及促進(jìn)細(xì)胞凋亡外，還可誘導(dǎo)細(xì)胞周期G1期阻滯，與本研究類似［14-15］。以上研究表明，miR-4286在肺癌中發(fā)揮癌基因作用，抑制miR-4286可有效抑制肺癌進(jìn)展。

FOX轉(zhuǎn)錄因子是一個大的進(jìn)化保守的轉(zhuǎn)錄調(diào)控家族，具有高度保守的雙翼螺旋DNA結(jié)合域。研究顯示FOXO4具有誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、凋亡和DNA損傷修復(fù)的功能，是人類腫瘤的理想抑癌因子［16］。FOXO4表達(dá)缺失是膀胱癌預(yù)后不良的危險因素［17］。在結(jié)腸癌和胃癌中上調(diào)FOXO4可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移［18-19］。在肺癌中FOXO4表達(dá)缺失是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)生的重要原因之一，miR-150通過靶向FOXO4促肺癌轉(zhuǎn)移［20］。本研究顯示肺癌組織中FOXO4表達(dá)顯著降低，與miR-4286的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示，F(xiàn)OXO4是miR-4286的功能性靶基因。外源性miR-4286模擬物或抑制物轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞可分別抑制或促進(jìn)FOXO4蛋白表達(dá)。進(jìn)一步研究顯示抑制FOXO4表達(dá)可逆轉(zhuǎn)抑制miR-4286對A549細(xì)胞增殖、遷移侵襲及凋亡的影響。提示miR-4286/FOXO4分子軸參與肺癌發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-4286/FOXO4分子軸在肺癌中表達(dá)失調(diào)。抑制miR-4286通過上調(diào)FOXO4抑制肺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，靶向抑制miR-4286可能是轉(zhuǎn)移性肺癌的潛在治療策略。