柏華美，黃梓軒，郭敏，鮑聆然，沈波

(杭州師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 311121)

文獻(xiàn)著錄格式：柏華美，黃梓軒，郭敏，等.OsWD40過(guò)表達(dá)水稻在鹽脅迫下的生理響應(yīng)[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021，62(6)：1076-1079.

DOI：10.16178/j.issn.0528-9017.20210607

土壤鹽堿化是一個(gè)日益嚴(yán)重的全球性問(wèn)題，其所造成的作物產(chǎn)量的損失對(duì)全球農(nóng)業(yè)的威脅越來(lái)越大[1]。土壤中鹽分過(guò)多阻礙了作物的生長(zhǎng)，引起發(fā)育變化和代謝的適應(yīng)，表現(xiàn)為細(xì)胞膜損傷、Na+和Cl-積累導(dǎo)致的離子失衡、脂質(zhì)過(guò)氧化增強(qiáng)，活性氧如超氧自由基、過(guò)氧化氫和羥基自由基的產(chǎn)生增加[2]。水稻是鹽敏感作物，鹽脅迫也是制約水稻生產(chǎn)的主要逆境脅迫因子之一。多年以來(lái)，學(xué)者圍繞水稻耐鹽品種的評(píng)價(jià)及選育、農(nóng)藝栽培措施、細(xì)胞信號(hào)響應(yīng)機(jī)制、脅迫生理及相關(guān)基因的挖掘進(jìn)行了廣泛的研究，解析了水稻耐鹽的內(nèi)在機(jī)理[2-6]。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷成熟及新的耐鹽基因的不斷發(fā)現(xiàn)，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得耐鹽植株日趨成熟，加快了水稻耐鹽種質(zhì)改良的進(jìn)程。Liu等[7]利用100 mmol NaCl處理轉(zhuǎn)OsVP1和OsNHX1基因水稻幼苗3周后，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)OsVP1和OsNHX1基因明顯促進(jìn)了水稻根系生長(zhǎng)、水分吸收和葉水勢(shì)，存活率分別為85.3%和100%，遠(yuǎn)高于野生型水稻的38.7%；而且，過(guò)量表達(dá)OsNHX1的轉(zhuǎn)基因水稻可以在200 mmol NaCl脅迫下存活[8]。研究顯示，轉(zhuǎn)AtNHX1水稻植株在300 mmol高濃度NaCl處理下，能夠正常存活，而野生型水稻5 d內(nèi)幾乎全部死亡，去除300 mmol NaCl脅迫條件的轉(zhuǎn)AtNHX1水稻的恢復(fù)生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)顯示，轉(zhuǎn)基因植株10 d內(nèi)可以恢復(fù)正常生長(zhǎng)，而野生型水稻則無(wú)法恢復(fù)，表明過(guò)表達(dá)AtNHXS1顯著提高了水稻的耐鹽性[9]。目前，利用基因工程技術(shù)培育耐鹽性轉(zhuǎn)基因水稻已經(jīng)取得了較好的進(jìn)展[10-12]。

鹽脅迫制約了水稻的生長(zhǎng)、發(fā)育，培育耐鹽水稻品種已成為當(dāng)務(wù)之急。本實(shí)驗(yàn)利用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的轉(zhuǎn)OsWD40水稻株系，進(jìn)行鹽脅迫處理，考察轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)鹽脅迫的生理響應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

OsWD40是本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)生物信息學(xué)和同源克隆的方法，找到的一個(gè)響應(yīng)NaCl的基因。在本課題研究中，以轉(zhuǎn)OsWD40過(guò)表達(dá)T6代水稻株系(B3-5和B4-3)和受體日本晴(OryzasativaL. japonica.cv.Nipponbare)為實(shí)驗(yàn)材料。

1.2 處理設(shè)計(jì)

水稻種植采用國(guó)際水稻研究所(IRRI)水稻營(yíng)養(yǎng)液配方配制水培溶液[13]，經(jīng)消毒、浸種、催芽、沙培后移入黑色小桶中水培，每3 d換一次全營(yíng)養(yǎng)液。水稻在溫室大棚中長(zhǎng)至四葉一心時(shí)，用含200 mmol NaCl的水稻營(yíng)養(yǎng)液處理水稻，在0、12、24、48 h對(duì)葉片取樣，冷凍保存，用于生理生化指標(biāo)測(cè)定。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

葉片相對(duì)含水量采用郭龍彪等[14]方法；葉片電導(dǎo)率使用DDS-307電導(dǎo)率儀測(cè)定；葉片葉綠素含量測(cè)定采用丙酮浸提法[15]；葉片可溶性糖含量測(cè)定采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司試劑盒；葉片總蛋白含量和過(guò)氧化氫酶(CAT)測(cè)定采用南京建成生物工程研究所試劑盒。所有數(shù)據(jù)測(cè)定均重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所用數(shù)據(jù)為同一處理3次重復(fù)的平均值，采用SPSS軟件的ANOVA過(guò)程處理，顯著性檢驗(yàn)采用鄧肯式新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)葉片相對(duì)含水量的影響

轉(zhuǎn)基因水稻株系和日本晴的葉片相對(duì)含水量在處理開(kāi)始時(shí)基本相同。隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，水稻葉片相對(duì)含水量呈降低趨勢(shì)，在處理后24、48 h時(shí)，轉(zhuǎn)基因水稻B3-5和B4-3的相對(duì)含水量分別是64%、62%和39%、47%，均高于日本晴的50%和33%。其中24 h時(shí)B3-5的相對(duì)含水量、48 h的B4-3的相對(duì)含水量與日本晴相比呈顯著差異，表明轉(zhuǎn)基因水稻株系B3-5和B4-3葉片具有較好的保水作用(圖1)。

同一時(shí)間柱上，無(wú)相同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。圖2～7同。

2.2 對(duì)葉片相對(duì)電導(dǎo)率的影響

隨著鹽脅迫時(shí)間的增加，轉(zhuǎn)基因水稻株系和日本晴的葉片電導(dǎo)率總體呈上升趨勢(shì)。脅迫處理12 h時(shí)，B3-5、B4-3的葉片相對(duì)電導(dǎo)率分別是30.6%和34.5%，而日本晴為42.0%；24 h時(shí)，B3-5、B4-3的葉片相對(duì)電導(dǎo)率分別是45.0%和52.2%，而日本晴為60.3%；至48 h時(shí)，葉片細(xì)胞質(zhì)膜嚴(yán)重受損，日本晴和2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系相對(duì)電導(dǎo)率均達(dá)最高值(圖2)。說(shuō)明在200 mmol NaCl鹽脅迫處理下，在24 h時(shí)間范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)基因水稻株系B3-5和B4-3比日本晴具有較好的耐鹽性，能夠保持一定的細(xì)胞質(zhì)膜功能。

圖2 NaCl處理對(duì)水稻葉片電導(dǎo)率的影響

2.3 對(duì)葉片葉綠素含量的影響

轉(zhuǎn)基因株系B3-5、B4-3和日本晴在12 h時(shí)葉綠素a的含量都比未處理時(shí)高，說(shuō)明此時(shí)在鹽脅迫下水稻有一個(gè)適應(yīng)過(guò)程，尚未影響葉綠素a的合成和積累。12 h之后3個(gè)品種的葉綠素a含量都呈快速下降的趨勢(shì)。48 h時(shí)，轉(zhuǎn)基因水稻株系的的葉綠素a含量顯著高于日本晴，特別是B4-3品種(圖3)。

圖3 NaCl處理對(duì)水稻葉片葉綠素a含量的影響

葉綠素b含量的差異在鹽脅迫24、48 h比較明顯，特別是48 h時(shí)，轉(zhuǎn)基因水稻株系的葉綠素b含量大于日本晴，其中B3-5的葉綠素b含量是日本晴的1.2倍，B4-3的葉綠素b含量是日本晴的1.6倍(圖4)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鹽脅迫24、48 h時(shí)，轉(zhuǎn)基因水稻株系與日本晴葉綠素a和葉綠素b的含量有較顯著的差異。

圖4 NaCl處理對(duì)水稻葉片葉綠素b含量的影響

2.4 對(duì)葉片總蛋白含量的影響

與脅迫開(kāi)始時(shí)相比，鹽處理12 h時(shí)的葉片總蛋白含量呈整體上升的現(xiàn)象。鹽處理24 h時(shí)，日本晴水稻葉片總蛋白含量急劇下降，轉(zhuǎn)基因水稻株系B3-5和B4-3的葉片總蛋白含量均顯著高于日本晴，其中B3-5、B4-3葉片總蛋白含量分別是日本晴的1.9倍和2.2倍(圖5)。鹽處理48 h時(shí)，日本晴、B3-5、B4-3葉片總蛋白含量均有顯著下降，葉片總蛋白含量分別為0.46、0.53和0.93 g·L-1，表明轉(zhuǎn)基因水稻株系在鹽脅迫的24～48 h仍然具有較好的蛋白質(zhì)合成能力。

圖5 NaCl處理對(duì)水稻葉片蛋白質(zhì)含量的影響

2.5 對(duì)葉片可溶性糖含量的影響

隨著鹽處理時(shí)間的增加，日本晴和轉(zhuǎn)基因株系B3-5、B4-3葉片的可溶性糖含量有增加，在12、24 h時(shí)，日本晴的可溶性糖含量均高于B3-5和B4-3。但鹽脅迫48 h時(shí)，與日本晴相比，B3-5和B4-3的可溶性糖含量明顯上升，分別增加了66.6%和37.1%(圖6)。說(shuō)明轉(zhuǎn)基因水稻株系具有較持久的可溶性糖合成能力。

圖6 NaCl處理對(duì)水稻葉片可溶性糖含量的影響

2.6 對(duì)葉片CAT活力的影響

在鹽處理的不同時(shí)間，轉(zhuǎn)基因株系B3-5和B4-3的CAT活性均高于日本晴，而日本晴隨著鹽脅迫時(shí)間進(jìn)程，其CAT活性逐漸下降。從脅迫12 h到48 h，B3-5的CAT活性穩(wěn)步增加，至48 h時(shí)，其CAT活性是日本晴的3.6倍；而B(niǎo)4-3的24 h CAT活性增加不明顯，但48 h時(shí)，其CAT活性是日本晴的2.1倍(圖7)。說(shuō)明，轉(zhuǎn)基因水稻株系B3-5和B4-3在鹽脅迫條件下，可以保持較長(zhǎng)時(shí)間的CAT活力來(lái)保持細(xì)胞機(jī)制的相對(duì)穩(wěn)定的運(yùn)行。

圖7 NaCl處理對(duì)水稻葉片CAT活力的影響

3 小結(jié)

根據(jù)世界糧農(nóng)組織估計(jì)，全世界超過(guò)6%的土地受到鹽分的影響。如何在環(huán)境脅迫下提高作物產(chǎn)量，以應(yīng)對(duì)日益增長(zhǎng)的糧食需求，是研究人員急需解決的重要科學(xué)課題[16]。隨著植物分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，耐鹽基因的不斷發(fā)現(xiàn)，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)來(lái)獲得抗鹽植株已成為常規(guī)耐鹽育種之外的一種有效手段。

目前，與鹽分脅迫有關(guān)的生理指標(biāo)如葉片相對(duì)含水量、電導(dǎo)率、抗氧化酶活性等，常被用于評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因植物對(duì)鹽脅迫的抗性，這些生理指標(biāo)主要反映了鹽脅迫條件下細(xì)胞膜的損傷程度、氧化代謝水平及滲透物質(zhì)的調(diào)節(jié)能力。實(shí)驗(yàn)表明，在鹽脅迫條件下，ZFP179過(guò)表達(dá)水稻具有較高的相對(duì)含水量和存活率、較低的電導(dǎo)率和丙二醛(MDA)含量，并可積累比野生型更多的可溶性糖[17]。與野生型相比，在150 mmol NaCl處理后3 d，過(guò)表達(dá)OsCaM1-1的轉(zhuǎn)基因水稻株系的相對(duì)含水量、相對(duì)生長(zhǎng)率、光合色素含量以及過(guò)氧化氫酶和谷胱甘肽還原酶等活性均較高[18]。而轉(zhuǎn)OsMYB6水稻150 mmol NaCl脅迫6 d后的恢復(fù)生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)顯示，野生型水稻全部死亡，轉(zhuǎn)基因水稻仍有43.9%的存活率；生理指標(biāo)顯示，轉(zhuǎn)基因水稻具有較低的電導(dǎo)率和MDA含量，較高的CAT和超氧化物歧化酶(SOD)活性[12]。通過(guò)這些生理指標(biāo)的測(cè)定，可知轉(zhuǎn)基因水稻的鹽脅迫耐受能力，證實(shí)轉(zhuǎn)基因水稻可以通過(guò)提高適應(yīng)性的生理活動(dòng)來(lái)增強(qiáng)水稻的耐鹽能力[19-23]。

本研究表明，鹽脅迫會(huì)影響轉(zhuǎn)基因水稻的生長(zhǎng)發(fā)育生理。在200 mmol NaCl處理?xiàng)l件下，與非轉(zhuǎn)基因水稻相比，轉(zhuǎn)基因水稻株系葉片細(xì)胞質(zhì)膜損傷程度較輕，細(xì)胞鎖水能力較強(qiáng)，表現(xiàn)為葉片相對(duì)含水量較高而電導(dǎo)率增加較緩；同時(shí)，轉(zhuǎn)基因水稻株系通過(guò)自身對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)，合成蛋白質(zhì)、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及提高抗氧化酶代謝水平來(lái)改善對(duì)鹽脅迫的耐受性，表現(xiàn)為總蛋白含量、可溶性糖含量及CAT活力的提高。