李寶晶，吳 炎，王 磊*，葉文才*

1.云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，云南 昆明 650500

2.暨南大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510632

蟾皮為蟾蜍科（Bufonidae）蟾蜍屬BufoLaurenti動(dòng)物中華大蟾蜍Bufo bufo gargarizansCantor的干燥皮，具有清熱解毒、利水消腫等功效，主治癰疽、腫毒、瘰疬、疳積腹脹[1]，臨床常用于治療惡性腫瘤、慢性乙型肝炎、面神經(jīng)麻痹等。蟾皮中主要含有蟾蜍甾烯類、吲哚烷胺類生物堿、蟾蜍環(huán)酰胺等成分[2-4]，其中蟾蜍甾烯類化合物為其主要成分。蟾皮和蟾酥中的蟾蜍甾烯類化合物，如bufalin、cinobufagin、resibufagin等具有良好的抗腫瘤作用[5]。以蟾皮為原料制成的華蟾素注射液對(duì)腫瘤細(xì)胞有明顯抑制作用，臨床用于中晚期腫瘤的治療[6-7]。為進(jìn)一步明確蟾皮的抗腫瘤藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究對(duì)蟾皮的化學(xué)成分進(jìn)行研究，共分離并鑒定了14個(gè)蟾蜍甾烯類化合物，分別鑒定為3,23-dihydroxy-γ-lactone-24-norchola-14,20(22)-dien-21-oicacid（1）、3-表-酯蟾毒配基（3-epi-resibufogenin，2）、3-表-去乙酰華蟾蜍精（3-epi-desacetylcinobufagin，3）、3-表-蟾蜍靈（3-epi-bufalin，4）、3-氧-去乙酰華蟾蜍精（3-ketodesacetyl-cinobufagin，5）、3-氧-蟾蜍它靈（3-oxo-cinobufagin，6）、3-氧-偽沙蟾蜍精（3-oxoψ-bufarenogin，7）、3-oxo-Δ4(5)-resibufogenin（8）、3-oxo-Δ4(5)-cinobufotalin（9）、3-dehydroscillarenin（10）、3-氧-毛地黃毒苷配基（3-dehydrodigitoxigenin，11）、digirezigenin （12）、bufogargarizin A（13）、bufogargarizin B（14）。其中，化合物1為新天然產(chǎn)物，并首次報(bào)道其NMR數(shù)據(jù)。以上化合物均為首次從蟾皮中分離得到。此外，對(duì)分離得到的部分蟾蜍甾烯類化合物進(jìn)行抗人肝癌HepG2細(xì)胞、人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞及人宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖的活性測(cè)試，結(jié)果顯示具有良好的細(xì)胞毒活性，其中3個(gè)化合物（6、9、10）具有顯著的腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性，半數(shù)抑制濃度（IC50）在0.11～1.67 μmol/L。

1 儀器與材料

JASCO P-1020旋光儀、JASCO V-550紫外/可見(jiàn)光譜儀、JASCO FI/IR-480 Plus Fourier Transform紅外光譜儀（日本JASCO公司）；Bruker AV-300、Bruker AV-400核磁共振儀（德國(guó)Bruker公司）；Finnigan LCQ Advantage MAX質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo公司）；Agilent 6210 LC/MSD TOF質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent公司）；分析型及制備型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）。CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）；超凈工作臺(tái)（新加坡Esco公司）；IX51型倒置熒光顯微鏡（日本Olympus株式會(huì)社）；MK3型酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）；自動(dòng)雙重純水蒸餾器（上海申立玻璃儀器公司）；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（美國(guó)Coning Costar公司）；精密移液槍（法國(guó)Gilson公司）；高壓滅菌鍋（日本Hirayama公司）。

硅膠（200～300目，青島海洋化工公司）；ODS填料（60～80 μm，YMC公司）；Sephadex LH-20（Amershanm Biosciences公司）；分析型HPLC色譜柱采用Cosmosil 5C18-MS-II （250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；制備型及半制備型HPLC分別采用Cosmosil 5C18-MS-II（250 mm×20 mm，5 μm）及Cosmosil 5C18-MS-II（250 mm×10 mm，5 μm）色譜柱，日本半井公司；氘代試劑（美國(guó)CIL公司）；實(shí)驗(yàn)中所用化學(xué)試劑，均為分析純或色譜純；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、新生牛血清（newborn bovine serum，NBS）、胰蛋白酶、青-鏈霉素均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；鹽酸多柔比星（doxorubicin，批號(hào)14023143，山西普德藥業(yè)有限公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、NaHCO3及其他試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

實(shí)驗(yàn)用中華大蟾蜍的干燥皮共2000張，購(gòu)買于濟(jì)南天興蟾業(yè)。經(jīng)暨南大學(xué)周光雄教授鑒定為中華大蟾蜍Bufo bufo gargarizansCantor，標(biāo)本（No.201112271）現(xiàn)保存于暨南大學(xué)中藥及天然藥物研究所。

2 提取與分離

蟾皮（共13 kg）粉碎成粗粉，用3倍量95%乙醇回流提取（80 ℃）4次，每次1 h，合并提取液，減壓濃縮得95%乙醇總提取物。將95%乙醇總提取物，分別用3 L水混懸后，氯仿萃取，重復(fù)4次，合并萃取液，減壓濃縮得氯仿部位（150 g）。氯仿部位（150 g）經(jīng)硅膠柱色譜，環(huán)己烷-丙酮（100∶0、98∶2、95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、70∶30、1∶1、0∶100）梯度洗脫，經(jīng)薄層色譜分析得到8個(gè)主流分（Fr.A～H）。

Fr.C（15 g）經(jīng)硅膠柱色譜，氯仿-丙酮（98∶2、95∶5、90∶10、80∶20、70∶30、0∶100）梯度洗脫得到6個(gè)流分（Fr.C1～C6）。其中亞流分Fr.C2（5.5 g）經(jīng)反相ODS柱色譜（甲醇-水），50%甲醇洗脫部位利用半制備型HPLC（55%乙腈，3 mL/min）純化，得到化合物9（26.7 mg，tR＝12.5 min）、8（8.3 mg，tR＝13.6 min）；60%甲醇洗脫部位利用半制備型HPLC（80%甲醇，3 mL/min）純化，得到化合物6（57.3 mg，tR＝19.8 min）。Fr.C3（1.3 g）經(jīng)反相ODS柱色譜，50%甲醇洗脫，后通過(guò)半制備型HPLC（55%甲醇，3 mL/min）純化，得到化合物11（1.1 mg，tR＝33.1 min）、12（2.3 mg，tR＝41.0 min）。Fr.C4（1.5 g）經(jīng)反相ODS柱色譜（甲醇-水），60%甲醇洗脫部位析出無(wú)色方晶，得到化合物4（5.7 mg）。Fr.C5（3.7 g）經(jīng)反相ODS柱色譜（甲醇-水），50%甲醇洗脫部位通過(guò)半制備型HPLC（50%乙腈，3 mL/min）純化，得到化合物10（9.7 mg，tR＝10.6 min）；60%甲醇洗脫部位析出無(wú)色方晶，得到化合物2（4.8 mg），析晶后母液通過(guò)制備型HPLC（55%乙腈，6 mL/min）純化，得到化合物1（1.3 mg，tR＝53.7 min）。

Fr.E（11 g）經(jīng)硅膠柱色譜，氯仿-甲醇（100∶0、100∶1、100∶2、100∶5、10∶1、8∶2、1∶1）梯度洗脫得到9個(gè)流分（Fr.E1～E9）。其中亞流分Fr.E4（3.5 g）經(jīng)反相ODS柱色譜（甲醇-水），60%甲醇洗脫部位利用半制備型HPLC（40%甲醇，3 mL/min）純化，得到化合物14（8.7 mg，tR＝20.5 min）、13（3.3 mg，tR＝28.7 min）。Fr.E5（3.0 g）經(jīng)反相ODS柱色譜（甲醇-水），30%甲醇洗脫部位利用制備型HPLC（25%乙腈，6 mL/min）純化，得到化合物7（2.6 mg，tR＝42.3 min），60%甲醇洗脫部位利用制備型HPLC（45%乙腈，6 mL/min）純化，得到化合物5（26.9 mg，tR＝47.4 min）。

Fr.G（8 g）經(jīng)反相ODS柱色譜，甲醇-水（10∶90、20∶80、30∶70、40∶60、50∶50、60∶40、70∶30、80∶20）梯度洗脫，得到16個(gè)流分（Fr.G1～G16）。其中Fr.G14（0.5 g）經(jīng)Sephadex LH-20（氯仿-甲醇）分離后，經(jīng)制備型HPLC（50%乙腈，6 mL/min）純化，得到化合物3（14.8 mg，tR＝22.4 min）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：無(wú)色針晶（甲醇），香草醛-濃硫酸反應(yīng)顯棕色；[α]26D?54.65°(c0.5,CH3OH)。依據(jù)HR-ESI-MS給出的準(zhǔn)分子離子峰m/z357.232 6[M＋H]+（計(jì)算值為357.243 0），確定化合物1的分子式為C23H32O3，不飽和度8。IR光譜顯示羥基(3403 cm?1) 和羰基 (1748 cm?1) 的特征吸收。205 (4.21)?；衔?的1H-NMR (400 MHz,CDCl3) 圖譜中，低場(chǎng)區(qū)顯示2個(gè)烯質(zhì)子信號(hào)[δH7.18 (1H,dd,J=3.6,1.6 Hz,H-22),5.20 (1H,dd,J=2.1,1.3 Hz,H-15)]；中、高場(chǎng)區(qū)顯示1個(gè)連氧的亞甲基質(zhì)子 [δH4.82 (2H,dt,J=3.6,1.6 Hz,H-23)]，2個(gè)角甲基質(zhì)子信號(hào) [δH0.96 (3H,s,H-19),0.74 (3H,s,H-18)]。13C-NMR (100 MHz,CDCl3) 譜中，共顯示23個(gè)碳信號(hào)，其中低場(chǎng)區(qū)δC174.6為酯羰基碳信號(hào)，δC155.0,116.4以及δC145.5,135.1為兩組烯碳信號(hào)。中場(chǎng)區(qū)δC70.3為1個(gè)連氧的亞甲基信號(hào)，δC67.2為1個(gè)連氧的次甲基信號(hào)。高場(chǎng)區(qū)δC23.7,19.2為2個(gè)角甲基信號(hào)。結(jié)合上述信息，確定化合物1具有甾體的母核，且具有3-羥基，但并不含有蟾蜍甾烯類化合物的特征六元內(nèi)酯環(huán)，可能為C-23甾類化合物?；衔?的1H-1H COSY譜中可觀察到3組質(zhì)子自旋偶合體系（圖1），確證了甾體環(huán)戊烷駢多氫菲母核的存在，同時(shí)在3位有羥基取代，14、15位具有雙鍵。此外，δH4.82 (H-23) 和δC135.1 (C-20),174.6 (C-21)，δH0.74 (H-18) 和δC41.7(C-12) 之間的遠(yuǎn)程相關(guān)信號(hào)（圖1），進(jìn)一步確定了化合物1的17位連接的是不同于甲型強(qiáng)心甾的五元內(nèi)酯環(huán)。至此確定化合物1的平面結(jié)構(gòu)（圖1），并對(duì)1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)得以全歸屬（表1）。

圖1 化合物1的化學(xué)結(jié)構(gòu) (a) 和1H-1H COSY及部分HMBC相關(guān) (b)Fig.1 Chemical structure (a),1H-1H COSY and selected HMBC correlations (b) of compound 1

化合物1的ROESY譜中觀察到Me-18 (δH0.74)和H-8 (δH2.05)、H-11β(δH1.46)、H-22 (δH7.18)，Me-19 (δH0.97) 和H-1β(δH1.43)、H-5 (δH1.76)、H-6β(δH1.25)、H-11β(δH1.46) 具有NOE相關(guān)，說(shuō)明這些質(zhì)子處于同側(cè)。同理，H-17(δH2.94) 和H-12α(δH2.05)，H-9 (δH1.42) 和H-2α(δH1.55)、H-7α(δH1.55)、H-12α(δH2.05)，H-4α(δH1.96) 和H-2α(δH1.55)、H-7α(δH1.55) 具有NOE相關(guān)，說(shuō)明這些質(zhì)子處于另一側(cè)，由此確定了化合物1的相對(duì)構(gòu)型（圖2-a）。為確定化合物1的絕對(duì)構(gòu)型，進(jìn)行化合物1的單晶銅靶X射線衍射實(shí)驗(yàn)，最終確定絕對(duì)構(gòu)型（圖2-b）?；衔?單晶衍射實(shí)驗(yàn)參數(shù)如下：C23H32O3(fw＝356.49)；斜方晶系（orthorhombic），空間群P212121；a＝0.637 842 (10)nm，b＝1.281 540 (15) nm，c＝2.336 33 (4) nm，α＝β＝γ＝90.00；V＝1.909 77 (5) nm3，T＝293 (2) K，Z＝4，DC＝1.240 mg/mm3，F(xiàn)(000)＝776。在3.78≤θ≤62.66，共收集3073個(gè)獨(dú)立反射點(diǎn)，其中2933個(gè)反射點(diǎn)用于結(jié)構(gòu)求解 [I＞2σ(I)]。最后的偏離因子R＝0.028 5，RW＝0.073 1，S＝1.076。Flack parameter＝?0.08 (19)。綜上所述，鑒定化合物1為3,23-二羥基-γ-內(nèi)酯-24-去甲-14,20(22)-二烯-21-膽酸，為1個(gè)新天然產(chǎn)物[8]，首次報(bào)道并歸屬其NMR數(shù)據(jù)。

表1 化合物1的NMR數(shù)據(jù) (400/100 MHz,CDCl3)Table 1 NMR data of compound 1 (400/100 MHz,CDCl3)

化合物2：無(wú)色方晶（甲醇），香草醛-濃硫酸反應(yīng)顯綠色；[α]26D＋17.56°(c1.0,CH3OH)；203 (4.68),295 (4.33)；(cm?1): 3437,2934,1709,1642,1540,1375；ESI-MSm/z:385 [M＋H]+，分子式為C24H32O4。1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ: 7.78 (1H,dd,J=9.7,2.4 Hz,H-22),7.23 (1H,d,J=2.4 Hz,H-21),6.24 (1H,d,J=9.7 Hz,H-23),0.95 (3H,s,H-19),0.77 (3H,s,H-18)；13C-NMR (100 MHz,CDCl3)δ: 33.9 (C-1),30.7(C-2),71.7 (C-3),36.3 (C-4),40.1 (C-5),26.4 (C-6),21.0 (C-7),41.6 (C-8),35.1 (C-9),35.1 (C-10),21.0(C-11),39.5 (C-12),45.4 (C-13),74.8 (C-14),60.1(C-15),32.5 (C-16),47.9 (C-17),17.0 (C-18),23.4(C-19),122.4 (C-20),149.7 (C-21),147.1 (C-22),115.4 (C-23),162.2 (C-24)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[9]，故鑒定化合物2為3-表-脂蟾蜍精。

圖2 化合物1的部分ROESY相關(guān) (a) 和單晶結(jié)構(gòu) (b)Fig.2 Selected ROESY correlations (a) and X-ray crystal structure (b) of compound 1

化合物3：無(wú)色方晶（甲醇），香草醛-濃硫酸反應(yīng)顯紅棕色；[α]26D＋116.33°(c0.1,CH3OH)；203 (4.57),218 (4.37),296 (4.46)；3419,2933,1698,1631,1535,1334；ESI-MSm/z:401 [M＋H]+分子式為C24H32O4。1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 7.93 (1H,d,J=9.2 Hz,H-22),7.45 (1H,d,J=1.7 Hz,H-21),6.16 (1H,dd,J=9.2,1.7 Hz,H-23),0.88 (3H,s,H-19),0.66(3H,s,H-18)；13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6)δ:30.4 (C-1),34.6 (C-2),69.8 (C-3),36.0 (C-4),41.1(C-5),26.1 (C-6),20.4 (C-7),32.9 (C-8),39.1 (C-9),34.8 (C-10),20.5 (C-11),38.9 (C-12),44.4 (C-13),71.7 (C-14),62.1 (C-15),70.6 (C-16),50.8 (C-17),17.1 (C-18),23.1 (C-19),117.9 (C-20),151.1 (C-21),150.0 (C-22),112.0 (C-23),161.3 (C-24)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)比一致[10]，故鑒定化合物3為3-表-去乙酰華蟾蜍精。

化合物4：無(wú)色方晶（甲醇），香草醛-濃硫酸反應(yīng)（TLC）顯青藍(lán)色；[α]26D?19.02°(c1.0,CH3OH)；(nm): 204 (4.39),299 (3.91)；(cm?1): 3421,2941,1703,1635,1541,1363；ESI-MSm/z:387 [M＋H]+，分子式為C24H34O4。1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ: 7.83 (1H,dd,J=9.7,2.6 Hz,H-22),7.22 (1H,d,J=2.6 Hz,H-21),6.25 (1H,d,J=9.7 Hz,H-23),0.91 (3H,s,H-18),0.69 (3H,s,H-19)；13CNMR (100 MHz,CDCl3)δ: 35.2 (C-1),36.4 (C-2),71.8 (C-3),36.6 (C-4),27.2 (C-5),21.4 (C-6),42.7(C-7),41.7 (C-8),35.0 (C-9),21.7 (C-10),28.9(C-11),41.0 (C-12),48.5 (C-13),85.5 (C-14),33.0(C-15),30.8 (C-16),51.4 (C-17),16.7 (C-18),23.4(C-19),122.8 (C-20),148.7 (C-21),146.9 (C-22),115.5 (C-23),162.5 (C-24)。通過(guò)1H-1H-COSY、HSQC、HMBC、NOESY等二維譜對(duì)核磁數(shù)據(jù)進(jìn)行了歸屬，鑒定化合物4為3-表-蟾蜍靈[11]。

化合物5：無(wú)色針晶（甲醇），香草醛-濃硫酸反應(yīng)顯黃綠色；[α]26D＋24.61°(c1.0,CH3OH)；(nm):204(3.55),294(3.48),215(3.46)；(cm?1):3452,2936,1716,1698,1540,1423；ESI-MSm/z:399 [M＋H]+，分子式為C24H30O5。1HNMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 7.94 (1H,d,J=9.2 Hz,H-22),7.46 (1H,d,J=1.7 Hz,H-21),6.17 (1H,dd,J=9.2,1.7 Hz,H-23),0.96 (3H,s,H-19),0.69(3H,s,H-18)；13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6)δ:36.1 (C-1),36.7 (C-2),211.8 (C-3),41.7 (C-4),43.1(C-5),25.4 (C-6),19.6 (C-7),38.6 (C-8),32.6 (C-9),34.8 (C-10),20.7 (C-11),38.8 (C-12),44.5 (C-13),71.6 (C-14),62.2 (C-15),70.6 (C-16),50.9 (C-17),17.1 (C-18),22.1 (C-19),117.9 (C-20),151.2 (C-21),150.0 (C-22),112.1 (C-23),161.3 (C-24)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[12]，故鑒定化合物5為3-氧-去乙酰華蟾蜍精。

化合物6：無(wú)色針晶（甲醇），香草醛-濃硫酸反應(yīng)顯棕綠色；[α]26D＋0.06°(c1.0,CH3OH)；203 (4.49),294 (4.19)；(cm?1): 3490,2938,1717,1642,1540,1374；ESI-MSm/z:441 [M＋H]+，分子式為C26H32O6。1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 7.87 (1H,d,J=9.8 Hz,H-22),7.47 (1H,s,H-21),6.24 (1H,d,J=9.8 Hz,H-23),0.96 (3H,s,H-18),0.73 (3H,s,H-19)；13C-NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ: 36.0 (C-1),36.7 (C-2),211.7 (C-3),41.6 (C-4),43.0 (C-5),25.2 (C-6),19.4(C-7),38.3 (C-8),32.5 (C-9),34.7 (C-10),20.7(C-11),38.7 (C-12),44.7 (C-13),71.8 (C-14),59.5(C-15),74.5 (C-16),49.0 (C-17),16.9 (C-18),22.0(C-19),116.0 (C-20),152.2 (C-21),148.5 (C-22),112.9 (C-23),160.8 (C-24),169.4 (C-25),20.2(C-26)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[12]，故鑒定化合物6為3-氧-華蟾蜍精。

化合物7：無(wú)定形粉末，香草醛-濃硫酸反應(yīng)顯黃色；[α]26D?27.77°(c1.0,CH3OH)；205 (3.96),292 (3.44)；3436,2940,1715,1629,1541,1386；ESI-MS：m/z415 [M＋H]+，分子式為C24H30O6。1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 7.63 (1H,dd,J=9.7,2.6 Hz,H-22),7.53 (1H,d,J=2.6 Hz,H-21),6.22 (1H,dd,J=9.7,2.6 Hz,H-23),0.99 (3H,s,H-18),0.84 (3H,s,H-19)；13CNMR (100 MHz,DMSO-d6)δ: 36.5 (C-1),37.1 (C-2),211.6 (C-3),42.1 (C-4),43.6 (C-5),26.7 (C-6),20.2(C-7),39.4 (C-8),45.5 (C-9),36.7 (C-10),213.9(C-11),82.0 (C-12),53.9 (C-13),82.1 (C-14),33.5(C-15),27.2 (C-16),45.4 (C-17),18.2 (C-18),22.7(C-19),119.7 (C-20),150.9 (C-21),148.2 (C-22),113.2 (C-23),161.2 (C-24)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[13]，故鑒定化合物7為3-氧-偽沙蟾蜍精。

化合物8：無(wú)色針晶（甲醇），香草醛-濃硫酸反應(yīng)顯棕色；[α]26D＋61.87°(c1.0,CH3OH)；(nm): 203 (4.47),238 (4.48),299 (4.21)；(cm?1): 2941,2864,1717,1667,1539,1369；ESI-MSm/z:381 [M＋H]+，分子式為C24H28O4。1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 7.76 (1H,dd,J=9.8,2.6 Hz,H-22),7.55 (1H,d,J=2.6 Hz,H-21),6.28 (1H,dd,J=9.8,2.6 Hz,H-23),5.64 (1H,s,H-4),1.17 (3H,s,H-19),0.74 (3H,s,H-18)；13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6)δ: 35.0 (C-1),33.6 (C-2),198.0(C-3),123.3 (C-4),170.1 (C-5),31.3 (C-6),26.4(C-7),33.1 (C-8),52.0 (C-9),38.3 (C-10),20.6(C-11),37.9 (C-12),44.5 (C-13),73.5 (C-14),59.4(C-15),31.5 (C-16),45.9 (C-17),16.5 (C-18),17.1(C-19),121.9 (C-20),150.7 (C-21),147.3 (C-22),114.2 (C-23),161.1 (C-24)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[14]，故鑒定化合物8為3-oxo-Δ4(5)-resibufogenin。

化合物9：無(wú)定形粉末，香草醛-濃硫酸反應(yīng)顯棕色；[α]26D＋38.40°(c1.0,CH3OH)；203 (4.37),237 (4.46),292 (4.01)；2939,1726,1665,1540,1375；ESI-MSm/z:439 [M＋H]+，分子式為C26H30O6。1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 7.85 (1H,d,J=9.8 Hz,H-22),7.48 (1H,d,J=2.0 Hz,H-21),6.25 (1H,d,J=9.8 Hz,H-23),5.65 (1H,s,H-4),1.81 (3H,s,H-26),1.17 (3H,s,H-19),0.77 (3H,s,H-18)；13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6)δ: 34.9 (C-1),33.6 (C-2),198.0 (C-3),123.4 (C-4),169.8 (C-5),31.2(C-6),26.2 (C-7),32.6 (C-8),51.5 (C-9),38.3 (C-10),20.5 (C-11),38.4 (C-12),44.5 (C-13),71.4 (C-14),59.3(C-15),74.4 (C-16),48.8 (C-17),16.8 (C-18),17.1(C-19),115.9 (C-20),152.4 (C-21),148.4 (C-22),113.0(C-23),160.8 (C-24),169.3 (C-25),20.2 (C-26)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)比一致[13]，故鑒定化合物9為3-oxo-Δ4(5)-cinobufotalin。

化合物10：無(wú)定形粉末，香草醛-濃硫酸反應(yīng)顯黃色；[α]26D＋19.61°(c1.0,CH3OH)；202 (3.97),239 (4.27),299 (3.74)；3461,2941,1715,1654,1540,1369；ESI-MSm/z:383[M＋H]+，分子式為C24H30O6。1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 7.92 (1H,dd,J=9.7,2.6 Hz,H-22),7.53 (1H,dd,J=2.6,0.8 Hz,H-21),6.31 (1H,dd,J=9.7,0.8 Hz,H-23),5.64 (1H,s,H-4),1.11 (3H,s,H-19),0.66 (3H,s,H-18)；13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6)δ：35.1 (C-1),33.6 (C-2),198.1 (C-3),123.0 (C-4),170.8 (C-5),32.4 (C-6),27.6 (C-7),41.2(C-8),48.9 (C-9),38.3 (C-10),21.0 (C-11),39.5(C-12),47.9 (C-13),83.0 (C-14),31.9 (C-15),28.4(C-16),49.8 (C-17),16.6 (C-18),17.2 (C-19),122.6(C-20),149.3 (C-21),147.3 (C-22),114.3 (C-23),161.4 (C-24)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[15]，故鑒定化合物10為3-dehydroscillarenin。

化合物11：無(wú)定形粉末，香草醛-濃硫酸反應(yīng)顯橙色；[α]26D＋29.60°(c0.5,CH3OH)；217 (4.19)；3451,2938,1747,1625,1541,1384；ESI-MSm/z:373 [M＋H]+，分子式為C23H32O4。1H-NMR (500 MHz,CD3OD)δ: 5.93 (1H,s,H-22),5.06 (1H,dd,J=18.4,1.6 Hz,H-21a),4.95(1H,dd,J=18.4,1.6 Hz,H-21b),1.06 (3H,s,H-19),0.93 (3H,s,H-18)；13C-NMR (125 MHz,CD3OD)δ:38.0 (C-1),37.9 (C-2),216.0 (C-3),43.0 (C-4),45.5(C-5),27.8 (C-6),22.2 (C-7),42.5 (C-8),37.5 (C-9),36.4 (C-10),22.4 (C-11),40.7 (C-12),51.1 (C-13),86.2 (C-14),33.4 (C-15),28.1 (C-16),52.1 (C-17),16.4 (C-18),22.9 (C-19),178.4 (C-20),75.4 (C-21),117.9 (C-22),177.3 (C-23)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[16]，故鑒定化合物11為3-dehydrodigitoxigenin。

化合物12：無(wú)定形粉末，香草醛-濃硫酸反應(yīng)顯藍(lán)色；[α]26D＋30.13°(c1.0,CH3OH)；212 (4.02)；3403,2936,1748,1647,1541,1377；ESI-MSm/z:373 [M＋H]+，分子式為C23H32O4。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ: 5.89 (1H,s,H-22),4.95 (1H,dd,J=18.7,1.6 Hz,H-21a),4.84(1H,dd,J=18.7,1.6 Hz,H-21b),1.03 (3H,s,H-19),0.98 (3H,s,H-18)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ:30.7 (C-1),28.5 (C-2),67.6 (C-3),34.1 (C-4),37.4 (C-5),27.0 (C-6),21.7 (C-7),40.5 (C-8),34.7 (C-9),36.5(C-10),22.0 (C-11),39.0 (C-12),46.5 (C-13),75.2(C-14),60.3 (C-15),31.7 (C-16),47.9 (C-17),16.1(C-18),24.2 (C-19),176.9 (C-20),75.7 (C-21),119.0(C-22),176.9 (C-23)。通過(guò)1H-1H-COSY、HSQC、HMBC、NOESY等二維譜對(duì)核磁數(shù)據(jù)進(jìn)行了歸屬，鑒定化合物12為digirezigenin[17]。

化合物13：無(wú)定形粉末，香草醛-濃硫酸反應(yīng)顯紅色；[α]26D–22.15°(c1.0,CH3OH)；(nm): 204 (3.70),217 (3.58),296 (3.68)；(cm?1): 3420,2936,1724,1601,1535,1377；ESI-MSm/z:463 [M＋Na]+，分子式為C25H30O8。1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ: 8.07 (1H,d,J=9.8 Hz,H-22),7.42 (1H,s,H-21),6.30 (1H,d,J=9.8 Hz,H-23),5.52 (1H,d,J=8.9 Hz,H-16),3.68 (1H,m,H-3),3.86 (1H,s,H-15),1.91 (3H,s,H-26),0.90 (3H,s,H-18)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ: 34.0 (C-1),32.3 (C-2),70.8 (C-3),54.9 (C-4),209.9 (C-5),64.5(C-6),26.8 (C-7),37.8 (C-8),58.0 (C-9),81.4 (C-10),21.4 (C-11),41.7 (C-12),47.0 (C-13),73.5 (C-14),60.8 (C-15),76.6 (C-16),51.0 (C-17),17.9 (C-18),118.3 (C-20),153.6 (C-21),150.8 (C-22),114.1(C-23),164.0 (C-24),171.6 (C-25),20.3 (C-26)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[18]，故鑒定化合物13為bufogargarizin A。

化合物14：無(wú)定形粉末，香草醛-濃硫酸反應(yīng)顯藏青色；[α]26D–18.35°(c1.0,CH3OH)；(nm): 203 (3.59),217 (3.48),294 (3.68)；(cm?1): 3421,2938,1714,1629,1536,1380；ESI-MSm/z:459 [M＋H]+，分子式為C25H30O8。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ: 8.05 (1H,d,J=9.8 Hz,H-22),7.43(1H,s,H-21),6.29 (1H,d,J=9.8 Hz,H-23),5.56(1H,d,J=8.9 Hz,H-16),4.43 (1H,ddd,J=15.9,9.3,6.9 Hz,H-2),3.82 (1H,s,H-15),1.91 (3H,s,H-26),0.92 (3H,s,H-18)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ:35.6 (C-1),71.7 (C-2),51.9 (C-3),79.8 (C-4),39.7(C-5),22.4 (C-6),39.9 (C-7),58.1 (C-8),212.7 (C-9),62.7 (C-10),24.3 (C-11),39.4 (C-12),46.5 (C-13),72.3 (C-14),61.0 (C-15),76.4 (C-16),51.2 (C-17),17.5 (C-18),118.2 (C-20),153.7 (C-21),150.7 (C-22),114.2 (C-23),164.0 (C-24),171.6 (C-25),20.3(C-26)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)比一致[18]，故鑒定化合物14為bufogargarizin B。

4 體外細(xì)胞毒活性實(shí)驗(yàn)

采用MTT法，體外測(cè)試化合物1、2、4、6～12不同濃度下對(duì)HepG2、A549及HeLa細(xì)胞的增殖抑制活性。實(shí)驗(yàn)選用多柔比星（dox）為陽(yáng)性對(duì)照化合物，受試樣品以DMSO溶解，實(shí)驗(yàn)具體操作參照文獻(xiàn)方法[19]進(jìn)行，以IC50為指標(biāo)評(píng)價(jià)各化合物的細(xì)胞毒活性。結(jié)果表明，除化合物1無(wú)活性外，蟾皮中的蟾蜍甾烯類化合物在不同濃度下對(duì)HepG2、A549及HeLa細(xì)胞均表現(xiàn)出增殖抑制作用（表2）。其中，3個(gè)蟾蜍甾烯類化合物（6、9、10）對(duì)3種腫瘤細(xì)胞均具有顯著的增殖抑制活性，IC50值分別為0.40、0.63、0.78 μmol/L，1.02、0.76、1.67 μmol/L和0.21、0.11、0.30 μmol/L。

表2 蟾皮中部分蟾蜍甾烯類化合物對(duì)HepG2、A549及HeLa的細(xì)胞毒活性 (±s ,n=3)Table 2 Cytotoxic activities of bufadienolides on HepG2,A549,and HeLa cells (±s ,n=3)

表2 蟾皮中部分蟾蜍甾烯類化合物對(duì)HepG2、A549及HeLa的細(xì)胞毒活性 (±s ,n=3)Table 2 Cytotoxic activities of bufadienolides on HepG2,A549,and HeLa cells (±s ,n=3)

化合物 IC50/(μmol·L?1)HepG2 A549 HeLa dox 0.18±0.02 0.21±0.07 0.26±0.08 1 ＞100 ＞100 ＞100 2 6.20±1.43 16.11±1.73 16.74±3.84 4 2.78±0.33 1.61±0.32 2.46±0.60 6 0.40±0.06 0.63±0.15 0.78±0.16 7 2.80±0.47 5.19±0.44 5.85±1.14 8 29.92±6.91 20.20±5.35 17.53±5.71 9 1.02±0.34 0.76±0.08 1.67±0.26 10 0.21±0.01 0.11±0.01 0.30±0.09 11 7.88±1.82 10.67±0.33 9.25±1.45 12 12.07±2.48 5.82±0.26 15.28±3.00

5 討論

本研究從中藥蟾皮中分離鑒定了14個(gè)蟾蜍甾烯類化合物，均為首次從蟾皮中分離得到。其中，化合物1為新天然產(chǎn)物，具有特殊的五元內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)[21-羰基，Δ20(22)]，與常見(jiàn)的甲型強(qiáng)心甾結(jié)構(gòu)[23-羰基，Δ20(22)]不同，本實(shí)驗(yàn)首次報(bào)道并歸屬了化合物1的NMR數(shù)據(jù)，并用單晶X-衍射的方法確定其絕對(duì)構(gòu)型。從中華大蟾蜍的耳后腺分泌物中分離得到sarmentogenin[20]，化合物1可能的生物合成途徑如圖3所示。

圖3 化合物1可能的生物合成途徑Fig.3 Proposed biogenetic pathway of compound 1

本研究首次報(bào)道了化合物1、4、7～9、11、12對(duì)HepG2細(xì)胞、A549細(xì)胞以及HeLa細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，結(jié)果表明，蟾皮中部分蟾蜍甾烯類化合物對(duì)HepG2、A549及HeLa細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的體外增殖抑制作用。初步分析可得到以下構(gòu)效關(guān)系：3位為α-羥基，3位羥基氧化為羰基，A環(huán)引入α,β-不飽和酮，14,15-環(huán)氧取代均使活性降低，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[21]。值得注意的是，以往的研究認(rèn)為甾體母核17位的五元不飽和內(nèi)酯環(huán)為活性必須基團(tuán)[21]，化合物1與化合物11、12相比，均具有五元不飽和內(nèi)酯，但成酯位置不同，化合物1（21-羰基成酯）與化合物11、12（23-羰基成酯）活性產(chǎn)生了顯著差異，由此可見(jiàn)，酯基位置亦是內(nèi)酯環(huán)作為活性必須基團(tuán)的關(guān)鍵因素。以上研究為蟾蜍甾烯類成分的進(jìn)一步構(gòu)效關(guān)系研究，以及中藥蟾皮及相關(guān)制劑抗腫瘤物質(zhì)基礎(chǔ)的闡明提供了科學(xué)依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突