張夢(mèng)晨，謝 輝，陸兔林，何 暢，毛春芹，馮 飛，蔣孝峰

南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210046

半夏系天南星科半夏屬植物半夏Pinellia ternate(Thunb.) Breit.的干燥塊莖，辛溫，歸肺、脾、胃經(jīng)；可燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結(jié)。臨床用于濕痰寒痰、咳喘痰多、痰飲眩悸、風(fēng)痰眩暈、痰厥頭痛、嘔吐反胃、胸脘痞悶、梅核氣等病證的治療[1]。半夏是臨床常用有毒中藥，《神農(nóng)本草經(jīng)》將其列為下品，內(nèi)服時(shí)均以炮制品入藥。吳皓[2]研究并分析了漢代至宋代半夏的炮制方法沿革，結(jié)果表明湯洗、姜制是半夏的基本炮制方法，也是其他諸多半夏炮制工藝演變的基礎(chǔ)。

《傷寒雜病論》中含有半夏的42首方劑中，半夏下方標(biāo)注“洗”字共18首[3]，占含半夏方劑數(shù)的42%，可見(jiàn)湯洗半夏的使用頻率之高。2018年4月國(guó)家中醫(yī)藥管理局發(fā)布了《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》，其中含半夏的9首漢代仲景方中5首明確標(biāo)注半夏的炮制方法為“洗”。張仲景在《金匱玉函經(jīng)·方藥炮制》中給出“洗”的解釋?zhuān)骸胺舶胂牟痪?，以湯洗十?dāng)?shù)度，令水清滑盡。洗不熟有毒也?！标P(guān)于“湯”的界定，《說(shuō)文解字》曰：“湯，熱水也”。半夏湯洗即將半夏藥材置于新沸的熱水中反復(fù)泡洗至洗后的水清澈、半夏表面無(wú)涎滑物質(zhì)。有研究表明，半夏經(jīng)過(guò)“湯洗”后對(duì)黏膜的刺激性降低[4]。

項(xiàng)目組在前期對(duì)半夏瀉心湯、旋覆代赭湯、黃連湯[5-6]等經(jīng)典名方開(kāi)展的研究工作中發(fā)現(xiàn)，由于制劑成分復(fù)雜，半夏在制劑中尚缺乏有效的質(zhì)量評(píng)價(jià)手段，因此完善半夏藥材及湯洗飲片的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，控制藥材及飲片質(zhì)量，配合制劑過(guò)程管理，有助于建立含有半夏飲片的復(fù)方制劑質(zhì)量控制體系。

指紋圖譜技術(shù)常用于表征中藥化學(xué)成分的整體性、復(fù)雜性和成分變化的差異性，本研究采用HPLC法構(gòu)建指紋圖譜，結(jié)合主成分分析（principal component analysis，PCA），對(duì)國(guó)內(nèi)主要產(chǎn)區(qū)半夏進(jìn)行分析與評(píng)價(jià)；同時(shí)，采用模式識(shí)別方法對(duì)湯洗前后半夏進(jìn)行判別分析，探尋半夏湯洗前后化學(xué)成分變化，以期發(fā)現(xiàn)和明確區(qū)分半夏及湯洗半夏的質(zhì)量控制指標(biāo)。進(jìn)一步結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析相應(yīng)成分所涉及的靶點(diǎn)與通路，為半夏的質(zhì)量控制及后續(xù)開(kāi)發(fā)研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695高效液相色譜儀，含2998 DAD檢測(cè)器，全自動(dòng)進(jìn)樣器，Empower液相色譜工作站，上海沃特世科技有限公司；TGL-16C高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；CAV64C電子天平，上海奧豪斯儀器有限公司；KQ-500B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試藥

乙腈、甲醇，色譜純，美國(guó)天地有限公司；水為超純水。對(duì)照品次黃嘌呤（批號(hào)140661-201704，質(zhì)量分?jǐn)?shù)100.0%）、黃嘌呤（批號(hào)140662-200802，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%）、尿苷（批號(hào)110887-201803，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.5%）、腺嘌呤（批號(hào)110886-201102，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.4%）、琥珀酸（批號(hào)110896-201602，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%）、肌苷（批號(hào)140669-201606，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%）、鳥(niǎo)苷（批號(hào)111977-201501，質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.6%）、腺苷（批號(hào)110879-201703，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.7%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；對(duì)照品胸苷（批號(hào)18042703，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%）購(gòu)自南京金益柏生物科技有限公司。

13批半夏藥材經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)陳建偉教授鑒定，均為天南星科半夏屬植物半夏Pinellia ternate(Thunb.) Breit.的干燥塊莖，信息見(jiàn)表1。

表1 不同產(chǎn)地半夏藥材信息Table 1 Sample information of Pinelliae Rhizoma (PR)from different producing areas

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Waters C18Xselect（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-水，梯度洗脫：0～7 min，0～0.5%乙腈；7～20 min，0.5%～1.0%乙腈；20～25 min，1.0%～1.5%乙腈；25～40 min，1.5%～5.5%乙腈；40～45 min，5.5%～10.0%乙腈；45～50 min，10.0%～15.0%乙腈；50～60 min，15.0%～26.0%乙腈；60～65 min，26.0%～60.0%乙腈；65～85 min，60.0%～100.0%乙腈；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣體積10 μL。

2.2 供試品溶液的制備

取本品細(xì)粉，約2 g，精密稱(chēng)定，置50 mL錐形瓶中，精密加入20 mL超純水，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲45 min，放冷，超純水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過(guò)，離心，取上清液，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取次黃嘌呤、黃嘌呤、尿苷、腺嘌呤、肌苷、胸苷、腺苷、琥珀酸對(duì)照品適量，加入適量超純水，配制成質(zhì)量濃度分別為113.2、46.6、77.8、109.4、45.2、27.5、191.0、195.5 μg/mL的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，以9號(hào)峰（尿苷）為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示各項(xiàng)RSD值均小于3%，表明該儀器具有良好的精密度。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液（S1）6份，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，進(jìn)行6次平行測(cè)定，以9號(hào)峰（尿苷）為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示各項(xiàng)RSD值均小于3%，表明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取樣品（S1），按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在制備后0、2、4、8、16、24 h按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以9號(hào)峰（尿苷）為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示各項(xiàng)RSD值均小于3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 半夏藥材指紋圖譜研究

2.5.1 指紋圖譜的建立及主要色譜峰的指認(rèn) 取13批半夏樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，將260 nm處色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件”（2012版），設(shè)定S1樣品色譜圖為參照?qǐng)D譜，采用平均數(shù)法，進(jìn)行多點(diǎn)校正和色譜峰匹配，經(jīng)全峰匹配后得到半夏的共有模式圖和指紋圖譜疊加圖，見(jiàn)圖1-A、B，S1～S13相似度計(jì)算結(jié)果分別為0.990、0.991、0.996、0.988、0.975、0.984、0.951、0.980、0.981、0.988、0.974、0.983、0.969，相似度為0.951～0.996。取“2.3”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，得到對(duì)照品溶液液相色譜圖，見(jiàn)圖1-C。

圖1 13批半夏藥材的HPLC指紋圖譜 (A)、共有模式圖(B) 和混合對(duì)照品HPLC圖 (C)Fig.1 HPLC fingerprint (A) and common pattern (B) of 13 batches of PR and HPLC of mixed reference substances (C)

本研究建立了半夏藥材的指紋圖譜，共標(biāo)記20個(gè)共有峰，經(jīng)對(duì)照品保留時(shí)間及紫外吸收?qǐng)D譜指認(rèn)，確定7～10、13、14、20號(hào)色譜峰分別為次黃嘌呤、黃嘌呤、尿苷、腺嘌呤、胸苷、腺苷和琥珀酸。尿苷的色譜峰（9號(hào)峰）保留時(shí)間適中，峰形對(duì)稱(chēng)，分離度較好，故以其作為參照峰，計(jì)算得到各共有峰保留時(shí)間的RSD＜0.76%，表明各色譜峰出峰穩(wěn)定。分別為將各個(gè)共有峰的峰面積相對(duì)于參照峰的峰面積進(jìn)行量化，得到20×13階數(shù)據(jù)矩陣，見(jiàn)表2。由于不同批次的半夏中肌苷含量差異較大且峰面積較小，色譜圖中肌苷對(duì)應(yīng)的色譜峰（i號(hào)峰）未被指認(rèn)作為半夏指紋圖譜的共有峰。

表2 13批半夏藥材共有峰相對(duì)峰面積Table 2 Relative peak area of 13 batches of PR

2.5.2 PCA PCA將多個(gè)變量轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個(gè)綜合變量（即主成分），是一種有效的降維統(tǒng)計(jì)方法，該方法消除了評(píng)價(jià)指標(biāo)間的相關(guān)影響，有助于更客觀地描述樣品的相對(duì)地位，這對(duì)于半夏藥材質(zhì)量的綜合評(píng)價(jià)具有重要意義。采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件，將13批樣品中20個(gè)成分的相對(duì)峰面積組成矩陣，數(shù)據(jù)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后進(jìn)行PCA。PCA中特征值及貢獻(xiàn)率見(jiàn)表3。由表3可見(jiàn)，前5個(gè)主成分的特征值均大于1，表明前5個(gè)主成分在半夏藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)中起主導(dǎo)作用，5個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率達(dá)90.928%（＞90%），能較客觀地反映不同產(chǎn)地半夏藥材的綜合質(zhì)量，故選取前5個(gè)主成分進(jìn)行分析。

表3 旋轉(zhuǎn)后的主成分特征值及貢獻(xiàn)率Table 3 Rotated eigenvalue of principal component and contribution rate

每個(gè)主成分包含的各因子其載荷系數(shù)綜合反映了所測(cè)成分對(duì)各主成分的影響。由表4可知，1、4、7（次黃嘌呤）、18、19、20（琥珀酸）號(hào)峰對(duì)主成分1有明顯的正負(fù)荷；12、16、17號(hào)峰是主成分2的主要決定因子，此外，10（腺嘌呤）號(hào)峰對(duì)主成分2有較強(qiáng)的逆負(fù)荷；6、11號(hào)峰的載荷因子在主成分3中較大；8（黃嘌呤）號(hào)峰是對(duì)主成分4影響較大的特征向量，此外，10（腺嘌呤）、15號(hào)峰對(duì)主成分2有較強(qiáng)對(duì)逆負(fù)荷；2、13號(hào)峰的載荷因子在第5主成分中較大，說(shuō)明上述化合物對(duì)半夏藥材的品質(zhì)影響較大，其余色譜峰對(duì)半夏藥材的品質(zhì)影響較小。

表4 主成分荷載Table 4 Load matrix of principal component

不同產(chǎn)地半夏樣品的主成分各因子總得分見(jiàn)表5，可根據(jù)各主要因子的權(quán)重系數(shù)計(jì)算得出各樣品的綜合得分。權(quán)重系數(shù)依據(jù)其方差貢獻(xiàn)的大小計(jì)算，即各主成分的貢獻(xiàn)率與5個(gè)主成分的總貢獻(xiàn)率之比，主成分1的權(quán)重為36.864%/90.928%＝0.405 4，同理可得主成分2、3、4、5的權(quán)重分別為0.223 6、0.144 9、0.113 6、0.112 6。各主成分因子得分與其權(quán)重乘積之和相加，得出各半夏樣品的總因子得分（F），其表達(dá)式為F＝0.405 4F1＋0.223 6F2＋0.144 6F3＋0.113 6F4＋0.112 6F5，其值越高，綜合質(zhì)量越好。結(jié)果顯示，S6批樣品（甘肅隴南）綜合質(zhì)量最好，S12（江蘇泰州）綜合質(zhì)量次之。

表5 不同產(chǎn)地半夏藥材的主成分因子及品質(zhì)綜合評(píng)價(jià)Table 5 Principal component factors and comprehensive quality evaluation of PR from different producing areas

2.6 湯洗半夏指紋圖譜研究

2.6.1 湯洗半夏的制備 取凈半夏藥材，加水浸泡至內(nèi)無(wú)干心后棄去全部水液，加入5倍量新沸的熱水，浸泡攪拌10 min，棄去水液及漂浮物，如此反復(fù)拌洗7次，取出，干燥，即得。13批半夏藥材S1～S13湯洗后對(duì)應(yīng)飲片編號(hào)為T(mén)1～T13。

2.6.2 湯洗半夏指紋圖譜的建立 取13批湯洗半夏飲片，以“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，將260 nm處色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件”（2012版），設(shè)定S1樣品色譜圖為參照?qǐng)D譜，采用平均數(shù)法，進(jìn)行多點(diǎn)校正和色譜峰匹配，經(jīng)全峰匹配后得到湯洗半夏飲片的指紋圖譜疊加圖和共有模式圖，見(jiàn)圖2，圖2中共有峰的編號(hào)系根據(jù)半夏藥材指紋圖譜中對(duì)應(yīng)共有峰號(hào)編制。湯洗半夏飲片T1～T13相似度計(jì)算結(jié)果分別為0.978、0.977、0.993、0.993、0.940、0.988、0.995、0.984、0.983、0.997、0.961、0.989、0.991，相似度介于0.940～0.997。

圖2 13批湯洗半夏的HPLC指紋圖譜疊加圖 (A) 和共有模式 (B)Fig.2 HPLC fingerprint (A) and common pattern (B) of 13 batches of wPR

與半夏藥材相比，經(jīng)湯洗處理后，指紋圖譜中某些共有色譜峰峰面積減小甚至消失，僅余11個(gè)共有峰，分別對(duì)應(yīng)半夏藥材指紋圖譜共有峰中的3、4、6、7、9～11、14、17、18、20號(hào)峰。經(jīng)對(duì)照品保留時(shí)間及紫外吸收?qǐng)D譜指認(rèn)，確定7、9、10、20號(hào)色譜峰分別對(duì)應(yīng)為次黃嘌呤、尿苷、腺嘌呤和琥珀酸。分別為將各個(gè)共有峰的峰面積相對(duì)于參照峰（9號(hào)峰）的峰面積進(jìn)行量化，得到11×26階數(shù)據(jù)矩陣，比較半夏及湯洗半夏共有峰的相對(duì)峰面積，結(jié)果見(jiàn)表6。

2.6.3 PCA 將13批半夏、湯洗半夏共有峰的相對(duì)峰面積導(dǎo)入SIMCA-P14.1軟件，以10個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積為變量，PCA得分圖見(jiàn)圖3。半夏與湯洗半夏在主成分空間分布上均有特定區(qū)域，說(shuō)明半夏與湯洗半夏化學(xué)成分存在顯著差異，能夠?qū)崿F(xiàn)半夏與湯洗半夏的區(qū)分。

2.6.4 正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）與差異性成分分析 在PCA的基礎(chǔ)上選擇有監(jiān)督模式的OPLS-DA，模型主成分回歸系數(shù)：R2X＝0.683，R2Y＝0.724，Q2＝0.64＞0.5，說(shuō)明預(yù)測(cè)模型有效，半夏與湯洗半夏可以得到有效區(qū)分，如圖4。模型得到變量重要性投影（variable importance projection，VIP）值，見(jiàn)圖5。VIP值越大，即變量離X軸越遠(yuǎn)，表明該色譜峰對(duì)于半夏與湯洗半夏的分類(lèi)貢獻(xiàn)越大，也是導(dǎo)致半夏與湯洗半夏相區(qū)分的差異成分。其中VIP＞1的有4個(gè)色譜峰，依次為11、10、18、20號(hào)，其為導(dǎo)致差異的主要標(biāo)志物。其中10號(hào)峰為腺嘌呤，20號(hào)峰為琥珀酸。其余色譜峰均＜1，對(duì)于區(qū)分半夏和湯洗半夏意義不大。

2.7 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

2.7.1 候選化合物靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 核苷類(lèi)成分和有機(jī)酸是半夏中主要的2類(lèi)成分，已有許多研究報(bào)道證實(shí)這些成分是半夏的功效關(guān)聯(lián)物質(zhì)[7-8]。檢索中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）、PubChem Compound數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.

nih.gov/pubmed/）、Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.swisstargetprediction.ch/）中次黃嘌呤、黃嘌呤、尿苷、腺嘌呤、肌苷、胸苷、腺苷和琥珀酸8個(gè)化合物，候選化合物作用的靶點(diǎn)；并通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.uniprot.org/）將預(yù)測(cè)出的靶點(diǎn)蛋白名轉(zhuǎn)換為對(duì)應(yīng)的基因名。將各數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出的靶點(diǎn)蛋白合并，除去重復(fù)靶點(diǎn)，最終得到與8個(gè)化合物相關(guān)的229個(gè)靶點(diǎn)蛋白。

表6 半夏-湯洗半夏指紋圖譜共有峰的相對(duì)峰面積Table 6 Relative common peak area of PR and wPR

圖3 半夏與湯洗半夏PCA得分圖Fig.3 PCA score chart of PR and wPR

圖4 半夏與湯洗半夏OPLS-DA得分散點(diǎn)圖Fig.4 OPLS-DA scatter plot of PR and wPR

圖5 半夏、湯洗半夏指紋圖譜共有峰VIP值Fig.5 VIP values of fingerprint common peaks of PR and wPR

2.7.2 靶點(diǎn)蛋白與蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)分析 將獲得的229個(gè)靶點(diǎn)蛋白以gene symbol形式導(dǎo)入在線String 11.0軟件（https://string-db.org/cgi/input.pl），物種選擇為人（homo sapiens），最高置信度蛋白交互參數(shù)評(píng)分值＞0.9，其他參數(shù)設(shè)置不變，將得到的相互作用參數(shù)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，去掉網(wǎng)絡(luò)中的單一節(jié)點(diǎn)，見(jiàn)圖6。

圖6 PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.6 PPI network

對(duì)PPI進(jìn)行拓?fù)涮卣鞣治?，選取在度中心性（degree）、中介中心性（betweenness）、接近中心性（closeness）3個(gè)參數(shù)均大于中位數(shù)且degree≥9的點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)，經(jīng)篩選后共得到9個(gè)重要核心靶點(diǎn)，具體包括MAPK1（degree 15）、RAC1（degree 10）、CASP3（degree 10）、MAPK3（degree 10）、CCND1（degree 9）、CDK2（degree 9）、SRC（degree 9）、PNP（degree 9）、EGFR（degree 9），且發(fā)現(xiàn)這9個(gè)靶點(diǎn)主要與腺苷、腺嘌呤、肌苷、尿苷、次黃嘌呤有關(guān)。

2.7.3 功能富集分析與通路分析 利用David 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/）對(duì)9個(gè)潛在的核心靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行交集靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）功能和京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。GO功能分析主要用于描述基因靶點(diǎn)的功能，包括細(xì)胞功能、分子功能和生物功能。KEGG富集分析可以得到潛在靶點(diǎn)所富集的信號(hào)通路。GO分析以P＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在GO富集分析中，共獲取19個(gè)GO條目，其中生物過(guò)程（biological process，BP）占10個(gè)，分子功能（molecular function，MF）占1個(gè)，細(xì)胞組成（cellular component，CC）占8個(gè)，選擇P值＜0.05的條目進(jìn)行展示，GO分析結(jié)果提示BP顯著富集在長(zhǎng)波紫外光（long wave ultraviolet ray，UV-A）反應(yīng)、乳腺上皮細(xì)胞增殖、底物黏附依賴(lài)性細(xì)胞擴(kuò)散和G1/S過(guò)渡有絲分裂細(xì)胞周期等過(guò)程；MF主要富集在ATP結(jié)合；CC主要富集在胞質(zhì)、周期蛋白依賴(lài)的蛋白激酶全酶復(fù)合、早期內(nèi)體膜等過(guò)程。具體信息見(jiàn)表7。

KEGG富集分析得到73條通路，結(jié)果見(jiàn)表8。選擇關(guān)聯(lián)基因數(shù)大于等于5的的條目進(jìn)行展示，富集到16條通路主要涉及癌癥中的病毒致癌（viral carcinogenesis）、蛋白聚糖作用癌癥（proteoglycans in cancer）、癌癥通路（pathways in cancer）、乙型肝炎（hepatitis B）、黏著斑（focal adhesion）、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）信號(hào)通路等，結(jié)果表明這9個(gè)核心靶點(diǎn)可能主要通過(guò)調(diào)控這些通路達(dá)到干預(yù)疾病的目的。

2.7.4 成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 根據(jù)上述成分-靶點(diǎn)、靶點(diǎn)-通路的對(duì)應(yīng)關(guān)系，利用Cytoscape3.6.0軟件繪制出成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖，并通過(guò)網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行可視化展示，見(jiàn)圖7。由網(wǎng)絡(luò)圖可知，半夏是通過(guò)多靶點(diǎn)、多途徑發(fā)揮協(xié)同作用的。根據(jù)Cytoscape3.6.0軟件分析結(jié)果，以化合物、靶點(diǎn)蛋白、信號(hào)通路的連接度（degree）為參考，發(fā)現(xiàn)化合物腺苷（degree 73）、肌苷（degree 38）的連接度較高，提示這2個(gè)化合物可能是半夏的活性成分，MAPK1（degree 16）、CCND1（degree 13）、ADORA1（degree 6）、ADORA2A（degree 6）、ADORA3（degree 5）、PNP（degree 5）的連接度高于其他靶點(diǎn)，表明這6個(gè)靶點(diǎn)發(fā)揮的作用可能更為關(guān)鍵，蛋白聚糖作用癌癥（degree 7）、癌癥通路（degree 7）、病毒致癌（degree 7）、PI3K-Akt信號(hào)通路（degree 6）、乙型肝炎（degree 6）、黏著斑（degree 6）連接度高于其他通路，表明半夏的7個(gè)關(guān)鍵成分主要對(duì)上述6條信號(hào)通路發(fā)揮重要作用。

表8 主要作用靶點(diǎn)的通路富集分析Table 8 Enrichment analysis of main target pathways

圖7 半夏成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)Fig.7 Component-target-pathway network of PR

2.8 整合分析

半夏中含有生物堿類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、核苷類(lèi)、植物甾醇類(lèi)、芳香酸類(lèi)及半夏蛋白等多種成分，其中有機(jī)酸類(lèi)和核苷類(lèi)成分是半夏主要的活性成分之一，具有多種藥理作用[9]。1987年從半夏中分離出鳥(niǎo)苷[10]，1997年分離出胸苷[11]；2003年分離出次黃嘌呤核苷[12]。有研究表明，半夏經(jīng)炮制成清半夏、姜半夏、法半夏飲片后，肌苷、鳥(niǎo)苷、腺苷、琥珀酸含量明顯降低[13]，這與本研究中識(shí)別出的差異性成分相吻合。

MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡等進(jìn)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[14]。細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1，CD1）經(jīng)研究表明可促進(jìn)細(xì)胞增殖，但其過(guò)度表達(dá)可致細(xì)胞增殖失控，促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[15]。過(guò)表達(dá)的CD1與肝細(xì)胞癌相關(guān)。綜上，推測(cè)半夏差異性成分可通過(guò)作用這些核心靶點(diǎn)發(fā)揮潛在的治療機(jī)制。與半夏中核苷類(lèi)成分相關(guān)度較高的通路主要為蛋白聚糖作用癌癥、癌癥通路、病毒致癌、PI3K-Akt信號(hào)通路、乙型肝炎、黏著斑等。通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)可知，半夏中總蛋白、多糖等成分對(duì)卵巢癌細(xì)胞、小鼠肉瘤瘤株S180、小鼠肝癌細(xì)胞H22、小鼠艾氏腹水癌細(xì)胞EAC等具有顯著的抑制作用[16-19]。半夏中的核苷類(lèi)成分是否具有抑癌協(xié)同增效作用有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)分別建立了半夏藥材和湯洗半夏飲片的HPLC指紋圖譜，并指認(rèn)了其中7個(gè)共有峰，半夏藥材和湯洗半夏飲片的均具有較好的相似度，說(shuō)明該方法簡(jiǎn)便快捷，可以穩(wěn)定可靠地應(yīng)用于半夏的質(zhì)量控制過(guò)程中。各主成分的載荷值綜合得分表明不同產(chǎn)地半夏藥材的綜合化學(xué)質(zhì)量存在差異，且無(wú)明顯的地域性規(guī)律，這進(jìn)一步說(shuō)明由于受環(huán)境、生長(zhǎng)年限等多因素的影響，造成了半夏化學(xué)質(zhì)量的差異。經(jīng)湯洗處理后其中11個(gè)共有峰的色譜數(shù)據(jù)經(jīng)PCA和OPLS-DA篩選后得到4種差異性成分。采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析相關(guān)成分，結(jié)果表明它們具有廣泛的靶點(diǎn)和網(wǎng)絡(luò)通路，與半夏的主要藥理作用密切相關(guān)，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證、潛在藥理學(xué)機(jī)制及臨床拓展應(yīng)用提供參考依據(jù)。

在文獻(xiàn)研究基礎(chǔ)上，指紋圖譜方法建立過(guò)程中對(duì)水、20%甲醇、50%甲醇3種提取溶劑進(jìn)行比較，研究發(fā)現(xiàn)用水超聲提取45 min得到的供試液分離效果好且色譜峰數(shù)量較多；以水為提取溶劑，分離出來(lái)的成分極性較大，例如多糖類(lèi)成分、核苷類(lèi)成分。且超聲提取一次操作簡(jiǎn)單，避免多重操作處理有助于降低精密度。

經(jīng)文獻(xiàn)查閱[20-22]，同時(shí)進(jìn)行190～410 nm波長(zhǎng)下全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)在260 nm處各成分均有較強(qiáng)吸收，色譜峰相對(duì)較多，故選擇260 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行指紋圖譜分析；對(duì)Waters C18Xselect（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters C18XTerra（250 mm×4.6 mm，5 μm）、漢邦Hedera ODS-2（250 mm×4.6 mm，5 μm）等色譜柱進(jìn)行了比較，結(jié)果表明Waters C18Xselect（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱對(duì)于極性成分分離效果最佳，可以最大限度地反映半夏化學(xué)成分組成的全貌。研究中還對(duì)柱溫、流動(dòng)相流速、梯度洗脫程序進(jìn)行了考察，最終確定了色譜條件。

來(lái)源不確定、各地炮制規(guī)范不統(tǒng)一、貯藏運(yùn)輸不當(dāng)使得中藥飲片的質(zhì)量控制問(wèn)題頻出[23]，本研究采用指紋圖譜技術(shù)對(duì)多個(gè)產(chǎn)地的半夏藥材開(kāi)展質(zhì)量研究，初步分析了湯洗前后半夏中的差異性成分，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步篩選其潛在的作用靶點(diǎn)和網(wǎng)絡(luò)通路，有助于更快速地找到效應(yīng)相關(guān)的質(zhì)量標(biāo)志物。未來(lái)還需借助適宜的化學(xué)分析技術(shù)、藥效學(xué)與毒理學(xué)技術(shù)和“譜-效-毒”關(guān)聯(lián)性分析研究，進(jìn)一步闡明湯洗影響半夏臨床使用的有效性與安全性的科學(xué)內(nèi)涵。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突