郝凱越,李遠威,宗永臣,尤俊豪,郭明哲

高原生境下A2O工藝對污水處理的微生物機制

郝凱越,李遠威,宗永臣*,尤俊豪,郭明哲

(西藏農(nóng)牧學院水利土木工程學院,西藏 林芝 860000)

基于 Illumina MiSeq 高通量測序技術,以高原生境下A2O工藝的活性污泥為研究對象,探討不同溫度下微生物群落結構、豐度及相關性.結合污染物分解、吸附及轉(zhuǎn)化等代謝過程中的主要功能蛋白、功能基因、酶的種類及豐度在碳、氮、磷等污染物代謝途徑中的作用,從生物化學和分子水平的角度分析了高原地區(qū)A2O工藝對污水處理的微生物學機制.結果表明:優(yōu)勢細菌門為變形菌門、擬桿菌門、放線菌門、厚壁菌門及綠彎菌門,優(yōu)勢細菌屬為AKYH767、腐敗螺旋菌、、伯克氏菌、IMCC26207、. 污染物去除和微生物群落發(fā)揮作用的效果在15℃為最優(yōu),微生物群落的COG、代謝途徑、基因和酶活性最適宜的溫度為20℃.主要功能蛋白為一般功能預測、氨基酸運輸與代謝和基因轉(zhuǎn)錄;主要代謝途徑為:ABC轉(zhuǎn)運蛋白,細菌雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng),嘌呤、核糖體及嘧啶等代謝,主要功能基因的產(chǎn)物(酶)為:烯酰輔酶A水合酶、乙酰輔酶A C-乙酰轉(zhuǎn)移酶、醛脫氫酶(NAD+)、硫代硫酸鹽及外多磷酸酶.

微生物機制；A2O工藝；高原生境；Illumina MiSeq測序；功能基因

西藏自治區(qū)平均海拔4000余米,水資源豐富[1].隨著自治區(qū)內(nèi)人口的急劇增長,污水排放量也日益增加,水環(huán)境遭受著一定程度的污染[2],這對污水處理廠的處理能力有了更高的要求.區(qū)內(nèi)的污水處理廠主要依靠活性污泥中微生物代謝進行脫氮除磷及去除有機污染物[3-4].但由于強紫外線、低溫及低溶解氧的特殊高原生境,導致活性污泥難以生存,污染物的去除效果不佳[5].且研究區(qū)域的微生物群落結構和功能也會相對較獨特,跟其他區(qū)域的活性污泥樣本之間細菌群落結構的組成有顯著性差異[6].

A2O系統(tǒng)為厭氧-缺氧-好氧工藝,主要通過活性污泥中微生物的代謝活動去除污水中的污染物[7].溫度是影響污染物去除效果的主要因素之一[5,8],且海拔的不同,也會導致污染物去除效果的改變[9].故海拔和溫度的改變,將影響著微生物群落的結構和功能,同時也影響碳、氮、磷等主要污染物的代謝關系以及相對應的功能蛋白、酶、基因的豐度.

為闡述西藏高原地區(qū)A2O工藝中活性污泥微生物群落結構、豐度、相互關系和微生物學機制,本研究采用Illumina MiSeq 高通量測序技術,分析不同溫度下微生物群落細菌的共現(xiàn)性、相關性、聯(lián)通性及參與碳、氮、磷污染物的主要代謝途徑、功能基因和酶的種類及豐度,為研究該地區(qū)A2O工藝對污水處理的微生物群落結構和微生物機制提供參考.

1 材料與方法

試驗用水為西藏農(nóng)牧學院化糞池中的污水,采用連續(xù)性進水,A2O工藝的厭氧池:缺氧池:好氧池的體積比為1:1:2.5,具體流程圖見前期相關研究[5].控制溶解氧(DO)為2.5～3.5mg/L,水力停留時間(HRT)為21h, pH值為7.5左右,污泥回流比為20%～50%,硝化液回流比為200%,MLSS為917.6～1308.7mg/L.使用溫度控制儀控制水溫為25, 20, 15, 10℃共4個溫度工況,當達到目標溫度時,溫控儀自動斷電,不再加熱.每個工況持續(xù)運行10d,取厭氧池、缺氧池及好氧池中的活性污泥樣品15mL進行Illumina MiSeq測序.水質(zhì)指標均采用國標測試方法,其中COD為重鉻酸鉀法,TN為過硫酸鉀-紫外分光光度法,總磷為分光光度法.

通過16SrRNA功能預測軟件(PICRUSt)對微生物分類單元(OTU)豐度表進行標準化;確定每個OTU的數(shù)據(jù)庫信息(greengene id),獲得基因數(shù)據(jù)庫KEGG Orthology (KO)信息和功能蛋白(COG)家族信息;計算出各COG和KO的豐度;根據(jù)COG數(shù)據(jù)庫的信息,從功能注釋(eggNOG)數(shù)據(jù)庫中解析到各COG的描述和功能信息,計算出功能豐度;根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫的信息,獲得KO、代謝通路(Pathway)及酶(EC)信息,并計算各功能類別的豐度;運用功能基因和代謝通路數(shù)據(jù)庫中各種代謝通路、膜轉(zhuǎn)運、細胞周期及信號傳遞等相關通路,獲取參與碳、氮及磷相關代謝途徑的基因和酶種類及豐度[10].

2 結果與分析

2.1 進出水水質(zhì)及去除率

在10, 15, 20, 25℃4個工況下,分別對A2O工藝的進出水COD、TN及TP的濃度進行測定,水質(zhì)及其去除率如表1所示.

根據(jù)表1可知:出水的COD在10, 15及20℃時達到了城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標準[11]的1級A排放標準,25℃時僅達到了2級排放標準,在15℃時去除率最佳為95.74%.TN僅在15℃時達到了1級A排放標準,且去除率最佳為88.86%,在20℃時達到了1級B排放標準,在其他溫度下處理效果不佳.TP同樣在15℃時達到了1級A排放標準,且去除率最佳為98.15%,在其他溫度下處理效果不佳,20℃和25℃時處理較好,達到了1級B排放標準總結可知,溫度為15℃時,COD、TN及TP3種污染物的去除率和去除效果均達到最佳,因此建議在高原地區(qū)下的A2O工藝運行溫度設定為15℃.

表1 不同溫度下進出水水質(zhì)及去除率

各污染物在不同溫度下的進水濃度差異較大,這可能由于在化糞池取污水的時間段不同,人們方便的頻次不同所導致.當COD濃度過高時,活性污泥沉降比升高,氨氮去除率降低,脫氮效率也將隨之降低[12].COD、TN及TP濃度過高,將大量消耗水體中的DO,A2O工藝脫氮除磷過程中所需的DO不足,導致污染物的處理效果不佳[13].當COD濃度較低時,A2O工藝活性污泥中可用來生長繁殖的物質(zhì)較少,微生物的活性受到抑制,導致COD的去除效果較差[14].當COD濃度較低或COD/TN較低時,A2O工藝脫氮除磷過程中所需的碳源不足,將導致脫氮除磷的處理效果不佳[15].而10, 20, 25℃的TN和TP濃度過高,20℃的COD濃度較低,25℃的COD濃度過高,最終導致處理效果不佳,均低于15℃處理效果.

2.2 活性污泥微生物功能種群組成及其功能

2.2.1 微生物種群組成分析 為分析高原生境下A2O工藝的厭氧池、缺氧池及好氧池在4個溫度下12個樣品中32種細菌門和781種細菌屬的共存關系,運用Networks軟件繪制門水平下和屬水平下的微生物種群共現(xiàn)性網(wǎng)絡圖,分別如圖1和圖2所示,所對應網(wǎng)絡節(jié)點門(屬)水平的物種節(jié)點如表2和表3所示,樣本節(jié)點如表4所示.

圖1 門水平下微生物種群共現(xiàn)性網(wǎng)絡圖

共現(xiàn)性網(wǎng)絡圖可視化展示豐度(序列數(shù))大于50的種在不同樣本中的共現(xiàn)關系,大圓與小圓的連線表示不同溫度下所含細菌門(屬),共現(xiàn)性網(wǎng)絡圖呈現(xiàn)了不同樣品與細菌門(屬)之間的共現(xiàn)關系,圖2同

表2 門水平下物種節(jié)點表

由于分析軟件的原因,暫無法對每個點開展具體細菌門和樣本信息的注釋,故將12個樣品中32種微生物細菌門加權度前5和后5的細菌門在表2中進行表示,樣本節(jié)點在表4中進行表示.表2表示12個樣品中32種微生物細菌門根據(jù)加權度排序在前5和后5的細菌門及對應的度和加權度,加權度排序越靠前的細菌門,其位置越處于網(wǎng)絡圖的中心.這表明在所有的細菌門中,它們的共現(xiàn)性最高,魯棒性最好.相反,加權度排序越靠后的細菌門,其位置越處于網(wǎng)絡圖的邊緣.這表明在所有的細菌門中,它們僅在極少的樣品中出現(xiàn),共現(xiàn)性最低,魯棒性最差.

由于圖片版面原因,無法對每個點具體表示哪種細菌屬和哪種樣本進行注釋,故將12個樣品中781種微生物細菌屬加權度前10的細菌屬在表3中進行表示,樣本節(jié)點在表4中進行表示. 它們均處于共現(xiàn)性網(wǎng)絡圖的中心,共現(xiàn)性和魯棒性最好.另有60種細菌屬的節(jié)點連通性和加權度均為1,例如:亞硝化單胞菌()、、unclassified_、、、及,還有55種細菌屬的節(jié)點連通性和加權度均為0,均處于網(wǎng)絡圖的邊緣.表明這些細菌屬僅在極少的樣品中出現(xiàn),共現(xiàn)性最低,魯棒性最差.其中,高原地區(qū)豐度較高的微生物特殊優(yōu)勢細菌屬為_AKYH767、及IMCC26207.

圖2 屬水平下微生物種群共現(xiàn)性網(wǎng)絡圖

表3 屬水平下物種節(jié)點表

某節(jié)點的聯(lián)通性表示在網(wǎng)絡中直接與該節(jié)點相連的節(jié)點數(shù)目,連通性越高表示該節(jié)點在整個網(wǎng)絡中重要性越高,連通性非常高的節(jié)點也稱為Hub節(jié)點.針對4個溫度下的樣本,具體細菌門和屬水平下的樣品節(jié)點統(tǒng)計見表4.

表4 門水平和屬水平下樣品節(jié)點聯(lián)通性

門水平下的節(jié)點聯(lián)通性可表示優(yōu)勢細菌門在活性污泥微生態(tài)系統(tǒng)中的作用,其最好的3個樣品(節(jié)點聯(lián)通性)依次為:10℃的缺氧池(30)、15℃的缺氧池(29)及15℃的厭氧池(29),最差的3個樣品依次為:15℃的好氧池(26)、25℃的厭氧池(24)及25℃的缺氧池(20).即優(yōu)勢細菌門在10℃的缺氧池、15℃的缺氧池及15℃的厭氧池的活性污泥中發(fā)揮的作用較為顯著,在15℃的好氧池、25℃的厭氧池及25℃的缺氧池的活性污泥中發(fā)揮的作用較小.

屬水平下節(jié)點聯(lián)通性最好的3個樣品(節(jié)點聯(lián)通性)依次為:15℃的缺氧池(505)、15℃的厭氧池(493)及20℃的厭氧池(491),最差的3個樣品依次為:25℃的好氧池(394)、15℃的好氧池(379)及25℃的缺氧池(376).其與門水平下的樣品節(jié)點的研究結果稍有差異,這是由于細菌門和細菌屬在不同溫度下處理單元的活性污泥中發(fā)揮的作用不同,且部分優(yōu)勢細菌屬不在同一個門水平下等原因所導致.溫度為15℃時,優(yōu)勢細菌門和細菌屬發(fā)揮的作用較大,與去除效果的研究結果基本上一致.

2.2.2 微生物種間相關性分析 為闡述高原生境下A2O工藝中細菌群落物種間的相互關系,通過Networks軟件繪制在門水平下和科水平下細菌屬的相關性網(wǎng)絡圖(圖3).物種相關性網(wǎng)絡圖主要反映某一環(huán)境條件下各分類水平的物種相關性.選取屬水平總豐度前20種,并計算物種之間的斯皮爾曼等級相關系數(shù),以反映物種之間的相關性.

圖3 門水平和科水平下細菌屬的相關性網(wǎng)絡圖

顯示<0.05的物種,相關系數(shù)絕對值30.8;圖中節(jié)點的大小表示物種豐度大小,不同顏色表示不同的物種;連線的顏色表示正負相關性,紅色表示正相關,綠色表示負相關;線越多,表示該物種與其他物種之間的聯(lián)系越密切,度越大

在門水平和科水平下,16個細菌屬具有相關性,聯(lián)通性最好的5個細菌屬(度)(聚類系數(shù))為:(10)(0.47)、(8)(0.57)、(8) (0.57)、(8) (0.61)、_ R-7_group(7) (0.62),均與其他細菌屬聯(lián)系較為緊密;聚類系數(shù)為0.47～0.62,具有一定的相關性.聯(lián)通性最差的5個細菌屬(度)(聚類系數(shù))為:unclassified_(4)(0.83)、(3)(1)、(2)(1)、(2)(1)、(1)(0),均與其他細菌屬聯(lián)系并不緊密.聚類系數(shù)為0的表示無相關性,為1的表示具有極好的相關性.

在門水平和科水平下,豐度前20的細菌屬中共有4種細菌屬與其他細菌屬均無相關性,分別是:伯克氏菌科(unclassi)、IMCC26207、、unclassified.具有相關性的細菌屬處于網(wǎng)絡圖的邊緣與、和共3種細菌屬聯(lián)通,且呈正相關;與、、、及G30-KF-CM45共5種細菌屬聯(lián)通,也呈正相關.即在同一門和科水平下具有相關性的菌屬具有相似或相反的功能和習性,但與菌屬豐度的高低無直接關系.這一結論與康小虎[10]的研究豐度較低的細菌屬之間的關系更為密切的結論不吻合,產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因與高原獨特的生境有關,其機理有待后續(xù)研究進一步揭示.

2.2.3 微生物群落功能及變化 通過PICRUSt中存儲了greengene id對應的直系同源蛋白質(zhì)簇COG信息對OTU豐度表進行標準化,獲得OTU對應的COG家族信息,并計算其功能分類及相對豐度.COG數(shù)據(jù)庫對活性污泥樣品中4512個功能蛋白進行了同源蛋白質(zhì)功能分類共24小類,其預測功能主要可分為細胞生長與傳導、信息儲存與加工、分解及合成代謝、貧乏特征4大類,不同溫度的A2O工藝活性污泥樣品的微生態(tài)群落物種的COG功能分類及豐度如圖4所示.

由圖4可知:溫度的改變對微生態(tài)群落物種繁殖相關的蛋白質(zhì)功能分類及豐度幾乎無影響(=0.509> 0.05).說明在高原地區(qū)A2O工藝微生物的蛋白質(zhì)功能及分類保持穩(wěn)定,這與微生物的生長和繁殖密切相關.這與康小虎[10]的研究結論較為相似,崔迪[16]的研究結論不一致.這可能由于高原環(huán)境下溫度的變化對微生物群落蛋白功能影響較小,而在寒冷地區(qū)下季節(jié)性溫度的變化對其影響較大,即溫度變化在高原和寒冷地區(qū)對微生物蛋白功能的影響差別較大.

功能蛋白質(zhì)種類的豐度高低代表著微生態(tài)群落物種生長繁殖的重要性.功能蛋白質(zhì)種類豐度最高的為功能表達的[S]功能未知和[R]一般功能預測2類功能蛋白,豐度較高的為信息儲存與加工的[E]氨基酸運輸與代謝和[K]基因轉(zhuǎn)錄2類功能蛋白,其次為[M]細胞壁/膜/質(zhì)膜形成、[C]能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)化、[P]無機離子運輸與代謝、[G]碳水化合物運輸與代謝及[T]信號轉(zhuǎn)導機制,豐度最低的為細胞生長與傳導的[Z]細胞骨架和[W]胞外結構2類功能蛋白.

圖4 不同溫度下活性污泥樣品COG功能分類及豐度

A:RNA合成和修飾,B:染色質(zhì)結構和動力學,C:能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化,D:細胞周期調(diào)控、細胞分裂、染色體分區(qū),E:氨基酸運輸和代謝,F:核苷酸運輸和代謝,G:碳水化合物運輸和代謝,H:輔酶運輸和代謝,I:脂質(zhì)運輸和代謝,J:蛋白質(zhì)翻譯、核糖體結構和形成,K:基因轉(zhuǎn)錄,L:DNA復制、重組和修復,M:細胞壁/膜/質(zhì)膜形成,N:細胞運動,O:翻譯后修飾,蛋白質(zhì)折疊與分子伴侶,P:無機離子運輸和代謝,Q:次生代謝產(chǎn)物生物合成、轉(zhuǎn)運和分解代謝,R:一般功能預測,S:功能未知,T:信號轉(zhuǎn)導機制,U:胞內(nèi)合成、分泌和運輸,V:免疫機制,W:胞外結構,Z:細胞骨架

對每個溫度下3個池子的樣品COG豐度進行合計,并求出所有樣品豐度的總和,篩選豐度前10的COG編號,其豐度及功能蛋白如表5所示.

表5 不同溫度污泥樣品COG豐度及功能

在A2O工藝的活性污泥中,微生物群落細胞中脫氫酶/還原酶豐度最高,這表明細胞可充分利用糖類、氨基酸等有機物使底物發(fā)生氧化還原反應.其次是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,它與細胞的信息存儲和進程有關.接著是膜轉(zhuǎn)運蛋白,它為污染物的有效去除提供了保障.組氨酸激酶、RNA聚合酶、酰基輔酶A脫氫酶、α/β水解酶等豐度也較高,它們是細胞合成、分解及代謝的重要催化劑. 溫度為20℃時基本上各COG豐度為最大,這與15℃時去除效果最佳的研究結果存在差異.這可能由于不同溫度下各處理單元之間豐度差異較大和15℃時COG的豐度滿足了微生物群落細胞的合成、分解及代謝等活動,而最終影響了C、N、P污染物的去除效果.COG的編號不同,其功能可能相同,如COG0583和COG1309的功能均為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子.

2.3 微生物代謝途徑

2.3.1 微生物群落主要代謝途徑 為進一步討論高原地區(qū)A2O工藝中活性污泥的微生物群落細胞代謝途徑,通過PICRUSt去除16S marker gene在物種基因組中的copy數(shù)目的影響,獲得OTU對應的KEGG Orthology (KO)信息,根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫的信息和OTU豐度,得到295條代謝途徑(Pathway)各個樣品的豐度表.對每個溫度3個池子樣品代謝途徑的豐度進行合計,求出所有樣品豐度的總和,并篩選前20的代謝通路,如表6所示.

表6 不同溫度污泥樣品主要代謝途徑及其豐度

由表6可知,ABC轉(zhuǎn)運蛋白的豐度最高,是污染物主要的去除途徑,其可通過水解ATP主動運輸如脂類、糖、離子、蛋白質(zhì)、肽及藥物分子等底物,使微生物細胞對污染物吸收和利用.其次為細菌雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng),主要存在于原核生物的細胞中,是由反應調(diào)控蛋白和組氨酸激酶組成,主要功能是利用雙組分蛋白的磷酸化和去磷酸化來調(diào)節(jié)細胞的信號傳導[17].豐度較高的代謝途徑還有嘌呤、嘧啶代謝及核糖體等,它們的主要功能是氮和磷的去除,這為污水中的微生物提供了大量的糖類、脂類和蛋白質(zhì)等有機底物[18].其他豐度較高的代謝主要是去除碳、氮、磷的途徑,主要碳去除代謝途徑為原核生物中的碳固定,糖酵解/糖異生,丙酮酸、丙酸酯及氨基糖和核苷酸糖代謝;主要氮去除代謝途徑為精氨酸、脯氨酸、丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸的代謝;主要磷去除代謝途徑為氧化磷酸化、脂肪酸和丁酸代謝.這些豐度較高的代謝途徑在細菌群落中適應了高原地區(qū)的特殊生境,這對高原環(huán)境的微生態(tài)穩(wěn)定性和特殊性等方面發(fā)揮著極其重要的作用.溫度為20℃時,所有代謝途徑的豐度均達到最大,豐度最小時無明顯對應的溫度,這與COG豐度的變化規(guī)律相似.

2.3.2 微生物群落主要碳代謝途徑 根據(jù)OTU對應的KEGG Orthology (KO)信息,共獲得5760個基因,篩選出豐度前15 跟碳代謝相關KO,查詢對應的基因和酶,并從上述295條代謝途徑(Pathway)的豐度表中選出對應的碳代謝途徑,如表7所示.

表7 碳相關基因及代謝途徑

注:EC為酶的縮寫形式.

豐度較高的碳代謝相關的KO對應的酶主要為葡萄糖酶類、乙酰輔酶類、轉(zhuǎn)移酶類及甘油酶類,對應的碳代謝途徑主要有糖酵解/糖異生,丙酮酸代謝,乙醛酸和二羧酸的代謝,丙酸代謝,原核生物中的碳固定途徑,纈氨酸,亮氨酸和異亮氨酸降解,磷酸戊糖途徑,半乳糖代謝,淀粉和蔗糖代謝,氨基糖和核苷酸糖代謝,TCA循環(huán),甲烷代謝等.這些基本代謝途徑是高原地區(qū)A2O工藝微生物群落細胞降解有機污染物為無機物并釋放出CO2和H2O的基本保障.豐度最高的酶為酰基轉(zhuǎn)移酶(EC:2.3.1.9),屬于轉(zhuǎn)移酶,參與了丙酮酸、乙醛酸和二羧酸的代謝.

參與碳代謝的微生物群落菌屬主要的作用分為降解有機物和產(chǎn)生胞外多聚物,其中降解有機物的優(yōu)勢菌屬豐度較高的依次為戈登氏菌屬(G)[19],毛球菌屬()[20],[21],[22-23],鐵銹菌屬(r),慢生根瘤菌屬()[24],,黃桿菌屬(Flavobacterium)[25].產(chǎn)生胞外多聚物的依次為根瘤菌屬(),鏈球菌屬(),芽孢桿菌屬(),假單胞菌屬()[16].

2.3.3 微生物群落主要氮代謝途徑 由表8可知,豐度較高的氮代謝相關的KO對應的酶主要為谷氨酶類、酰胺酶類、氧化還原酶類及合成酶類,最主要的氮代謝途徑為氮代謝(ko00910)和丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸代謝(ko00250).其他氮代謝途徑為氮素代謝,細菌雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng),硒化合物代謝,精氨酸和脯氨酸代謝,苯丙氨酸代謝,色氨酸代謝,氨基苯甲酸酯降解和苯乙烯降解等.

表8 氮相關基因及代謝途徑

脫氮的微生物群落菌屬主要為硝化細菌和反硝化細菌,本研究中硝化細菌豐度較高的依次為羅丹桿菌(),硝化螺旋菌屬 ()[26-27],[28],亞硝化單胞菌屬 (),.反硝化細菌主要為[29],單純螺旋藻()[30],嗜熱菌()[31],[32],不動桿菌屬()[33],索氏菌屬()[34],叢毛單胞菌屬()[35],[20],假單胞菌屬()[36],脫氯單胞菌屬()[37],氫嗜胞菌屬()[38],黃桿菌屬()[39].

2.3.4 微生物群落主要磷代謝途徑 由表9可知,豐度較高的磷代謝相關的KO對應的酶主要為磷酸酶類、甘油酶類、氧化還原酶類及轉(zhuǎn)移酶類,基因K02274和K02276對應同一個酶為細胞色素C氧化酶亞基.最主要的磷代謝途徑為氧化磷酸化(ko00190),其次為甘油磷脂代謝(ko00564)、甘油脂代謝(ko00561).丁酸代謝,嘌呤代謝及磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)等途徑也參與了磷代謝.

本研究中聚磷菌(PAOs)豐度較高的依次為不動桿菌屬(),假單胞菌屬(),四球蟲屬()[40],單胞菌屬(),紅環(huán)菌屬()等,反硝化除磷微生物菌群(DPAOs)為紅桿菌屬(),,等.聚磷菌群通過氧化磷酸化代謝途徑將無機磷轉(zhuǎn)化為ATP,為微生物群落的增長繁殖提供能量.氧化磷酸化是PAO合成PHA的主要能源的代謝途徑,在高原地區(qū)A2O工藝的磷代謝途徑中豐度最高.

2.4 微生物的功能基因

根據(jù)OTU對應的KEGG Orthology (KO)信息,共獲得5760個基因.求出每個溫度下3個池子樣品總和的KO豐度和所有樣品KO豐度的總和,篩選豐度前20的KO編號,查詢對應的基因豐度和基因功能,如表10所示.

表9 磷相關基因及代謝途徑

表10 不同溫度污泥樣品KO豐度及功能(前20)

根據(jù)表10可知,豐度最高的KO是K01692,對應的基因名稱為paaf和echa,編碼產(chǎn)物為烯酰輔酶A水合酶類,包括加氫裂解酶和碳-氧裂解酶.它們參與了多種氨基酸的降解和細胞碳水化合物的固定,其在高原地區(qū)A2O工藝系統(tǒng)的碳固定和氮代謝中發(fā)揮著重要作用.同時也表明該基因能高效轉(zhuǎn)錄和翻譯,對有機污染物的去除有著顯著的貢獻.K00626豐度也較高,編碼基因為acat和atob,基因的編碼產(chǎn)物為乙酰輔酶A C-乙酰轉(zhuǎn)移酶.其屬于轉(zhuǎn)移酶類,豐度處于第4位,可將乙酰輔酶A和乙酰輔酶C通過轉(zhuǎn)移酰基生成乙酰乙酰輔酶A[10].它主要在氮代謝中發(fā)揮著顯著作用[41].

K00128在KO信息庫中豐度較高,編碼基因為aldh,編碼產(chǎn)物為醛脫氫酶(NAD+).其屬于氧化還原酶類,可發(fā)生:醛+ NAD++H2O=羧酸鹽+NADH+H+反應,可以為細胞存儲能量.K01011對應的基因為tst, mpst及ssea,編碼產(chǎn)物為硫代硫酸鹽或3-巰基丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶,主要功能為硫代謝.K01524的基因為ppx-gppa,產(chǎn)物為外多磷酸酶、鳥苷5'-三磷酸,3'-二磷酸焦磷酸酶,其主要在磷代謝中發(fā)揮著重要的作用.大多數(shù)的KO和基因中,豐度最高的工況為20℃,與COG和代謝途徑最高豐度時的溫度一樣,豐度最小的工況為10℃.這表明在高原地區(qū)A2O工藝系統(tǒng)中,微生物群落的基因和酶活性最適宜的溫度為20℃,最不適的溫度為10℃.

COG、酶、基因及代謝途徑最適宜的溫度為20℃,而COD、TN及TP的去除率和去除效果最佳時的溫度為15℃.分析原因為:1.不同溫度下不同反應器之間豐度差異較大,去除COD、TN及TP的主要反應器的COG、酶、基因及代謝途徑可能在15℃時的豐度最大.2.主要的COG、酶、基因及代謝途徑在20℃豐度最大,不足以說明所有的與COD、TN及TP的有關的COG、酶、基因及代謝途徑在20℃豐度都能達到最大或處于高效狀態(tài).3.溫度為15℃時,進水濃度及濃度比適宜,而COG、酶、基因及代謝途徑的豐度滿足了微生物群落細胞的合成、分解及代謝等活動所需,使得COD、TN及TP的去除率和去除效果達到了最佳.這些可能將成為下一步的研究方向,其具體原因和機理尚待進一步的研究.

3 結論

3.1 高原生境下A2O工藝的優(yōu)勢細菌門為變形菌門、擬桿菌門、放線菌門、厚壁菌門及綠彎菌門,優(yōu)勢細菌屬為___AKYH767、腐敗螺旋菌、、伯克氏菌、IMCC26207、.特殊的優(yōu)勢細菌屬為___AKYH767、及IMCC26207.

3.2 溫度為15℃時,COD、TN及TP 3種污染物的去除率和去除效果均達到最佳,優(yōu)勢細菌門和細菌屬發(fā)揮的作用較大.微生物群落的COG、代謝途徑、基因和酶活性最適宜的溫度為20℃,基因和酶最不適的溫度為10℃.

3.3 微生物群落主要的代謝途徑為:ABC轉(zhuǎn)運蛋白,細菌雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng),嘌呤、嘧啶及核糖體等代謝.主要碳代謝途徑為原核生物中的碳固定,糖酵解/糖異生,丙酮酸、丙酸酯及氨基糖和核苷酸糖代謝等;主要氮代謝途徑為氮(素)代謝,精氨酸、脯氨酸、丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸的代謝等;主要磷代謝途徑為氧化磷酸化、甘油磷脂代謝及甘油脂代謝等.

3.4 微生物群落主要的基因產(chǎn)物(酶)為:烯酰輔酶A水合酶類、乙酰輔酶A C-乙酰轉(zhuǎn)移酶、醛脫氫酶(NAD+)、硫代硫酸鹽及外多磷酸酶等.主要碳代謝為葡萄糖酶類、乙酰輔酶類、轉(zhuǎn)移酶類及甘油酶類等;主要氮代謝為谷氨酶類、酰胺酶類、氧化還原酶類及合成酶類等;主要磷代謝為磷酸酶類、甘油酶類、氧化還原酶類及轉(zhuǎn)移酶類等.

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Microbial mechanism of A2O process for wastewater treatment in plateau habitat.

HAO Kai-yue, LI Yuan-wei, ZONG Yong-chen*, YOU Jun-hao, GUO Ming-zhe

(Water Conservancy Project & Civil Engineering College, Tibet Agriculture & Animal Husbandry University, Nyingchi 860000, China)., 2021,41(5)：2240～2251

Based on Illumina MiSeq high-throughput sequencing technology, the structure, abundance and correlation of the microbial community at different temperatures were discussed in the A2O process activated sludge under the plateau habitat. Combined with the role of the main functional proteins, functional genes, enzymes and their abundance in the metabolic pathways of carbon, nitrogen, phosphorus, sulfur and other pollutants during the decomposition, adsorption and transformation of pollutants, the microbial mechanism of A2O process for sewage treatment in plateau area was analyzed from the perspective of biochemistry and molecular level. The results showed that the dominant bacterial Phylum were Proteobacteria, Bacteroidetes, Actinobacteria, Firmicutes and Chloroflexi, and the dominant bacterial genusAKYH767,,, unclassified, IMCC26207, and. The optimum temperature for pollutant removal and microbial community was 15℃, and the optimum temperature for COG, metabolic pathway, gene and enzyme activity of microbial community was 20℃. The main functional proteins were general function prediction only, amino acid transport and metabolism, transcription. The main metabolic pathways were ABC transporters, two-component system, purine metabolism, ribosome and pyrimidine metabolism. The main functional gene products (enzymes) were enoyl-CoA hydratase, acetyl-CoA C-acetyltransferase, aldehyde dehydrogenase (NAD+), thiosulfate and exopolyphosphatase.

microbial mechanism；A2O process；plateau habitat；Illumina MiSeq sequencing；functional genes

X703

A

1000-6923(2021)05-2240-12

郝凱越(1997-),男,河北武安人,西藏農(nóng)牧學院碩士研究生,主要研究方向為水利工程對水生態(tài)環(huán)境的影響.發(fā)表論文20余篇.

2020-10-13

國家自然科學基金資助項目(51868069);西藏地區(qū)自然科學基金資助項目(XZ 2018 ZR G-20)

* 責任作者, 教授, zyc_2001@sohu.com