孫夢君，周可聰，夏一如，謝玉峰，束 蓉

牙周炎是口腔常見的慢性感染性炎癥性疾病，可造成牙周軟硬組織破壞，引起牙齒松動脫落。菌斑生物膜是引起牙周炎的始動因子，宿主過度的免疫炎癥反應(yīng)在疾病進(jìn)展中也發(fā)揮重要作用[1-2]。

牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis，P.gingivalis)是牙周主要致病菌，可與其代表性毒力因子脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)激活一系列信號通路，誘導(dǎo)牙周組織中多種炎癥因子的釋放[3-4]。

二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)屬于n-3多不飽和脂肪酸(n-3 polyunsaturated fatty acids，n-3 PUFAs)，具有多種生物學(xué)功能，包括抗菌、抗炎、抗氧化和抗腫瘤等[5-7]。

人牙齦成纖維細(xì)胞(human gingival fibroblasts，HGFs)是牙齦中的主要組成細(xì)胞，在受到牙周致病菌及其毒力因子刺激后，可釋放一系列促炎介質(zhì)，加重炎癥反應(yīng)[8-9]。

本研究擬觀察DHA對HGFs生物學(xué)活性的影響及P.gingivalisLPS、熱滅活P.gingivalis作用下HGFs炎癥因子(IL-6、IL-8、IL-1β)的表達(dá)變化，為DHA在牙周炎防治方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone，美國)，胎牛血清(Gibco，美國)，DHA(Cayman，美國)，活死細(xì)胞染色試劑盒(Biovision，美國)，P.gingivalisLPS(Invivogen，美國)，RNAiso Reagent、Prime ScriptTMRT reagent kit、SYBR?Premix Ex TaqTM(寶生物，中國大連)，IL-6、IL-8、IL-1β ELISA試劑盒(西唐，中國上海)，HO-1、β-actin抗體(Abcam，英國)。

1.2 HGFs細(xì)胞培養(yǎng)

本研究經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批件號：2016-210-T159)，所有患者知情同意。實驗獲取上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院牙周病科門診患者的牙齦組織，均為牙周健康患者經(jīng)牙冠延長術(shù)及牙齦切除術(shù)后切除，并將牙齦組織即刻置于含有雙抗的DMEM中保存。采用倒置組織塊法培養(yǎng)原代細(xì)胞，待從組織塊中爬出的細(xì)胞密度為70%～80%時進(jìn)行傳代培養(yǎng)，選取第4～6代細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.3 觀察細(xì)胞生物學(xué)活性

1.3.1 活死細(xì)胞染色 將細(xì)胞接種至24孔板，接種密度為1×105個/mL，培養(yǎng)24 h后，換用空白培養(yǎng)液(對照組)或含不同濃度DHA(100、200 μmol/L)的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。根據(jù)染色試劑盒說明書進(jìn)行活死細(xì)胞染色，熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.3.2 細(xì)胞形態(tài)觀察 光鏡：將細(xì)胞以1×105個/mL密度接種至6孔板，培養(yǎng)24 h后，換用空白培養(yǎng)液(對照組)或含100 μmol/L DHA的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，采用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

熒光顯微鏡：將細(xì)胞以5×104個/mL密度接種至置有細(xì)胞爬片的24孔板，培養(yǎng)24 h后，換用空白培養(yǎng)液(對照組)或含100 μmol/L DHA的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h；采用4%多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗后，0.1% Triton X-100處理10 min，PBS洗3次；1% BSA封閉1 h，PBS洗3次；100 nmol/L FITC-鬼筆環(huán)肽避光處理2 h，PBS洗3次；1∶1 000稀釋的DAPI避光孵育5～10 min，PBS洗3次；采用熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.3.3 細(xì)胞周期檢測 將細(xì)胞以2.5×104個/mL密度接種至6孔板，培養(yǎng)24 h后，換用不含血清的DMEM培養(yǎng)液饑餓12 h，再換用空白(對照組)或含100 μmol/L DHA的含血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h及48 h。收集細(xì)胞，采用70%乙醇固定，加入碘化丙啶染色液，于37 ℃避光溫浴30 min，24 h內(nèi)完成流式檢測。

1.4 觀察IL-6、IL-8、IL-1β基因及蛋白表達(dá)

1.4.1P.gingivalis的熱滅活處理 收集對數(shù)生長期P.gingivalis菌液，調(diào)整OD600 nm為1.0，對應(yīng)細(xì)菌濃度為1×109CFU/mL，分裝后置于60 ℃水浴1 h，儲存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 定量PCR檢測 將細(xì)胞以1×105個/mL密度接種至6孔板，培養(yǎng)24 h后，換用空白培養(yǎng)液或含不同濃度DHA(25、50、100 μmol/L)的培養(yǎng)液預(yù)處理2 h，再換用空白培養(yǎng)液(對照組)或含P.gingivalisLPS(1 μg/mL)、熱滅活P.gingivalis(MOI=100∶1)的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，采用Trizol裂解細(xì)胞，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，熒光定量PCR檢測。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量。定量PCR引物序列見表1。

表1 基因引物序列

1.4.3 ELISA檢測 將細(xì)胞以1×105個/mL密度接種至6孔板，培養(yǎng)24 h后，換用空白培養(yǎng)液或含不同濃度DHA(25、50、100 μmol/L)的培養(yǎng)液預(yù)處理2 h，再換用空白培養(yǎng)液(對照組)或含P.gingivalisLPS(1 μg/mL)、熱滅活P.gingivalis(MOI=100∶1)的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞上清。按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行IL-6、IL-8、IL-1β的蛋白檢測。

1.5 檢測HO-1基因及蛋白表達(dá)

1.5.1 檢測HO-1基因 HO-1基因定量PCR檢測步驟同1.4.2，基因引物序列F：GCAGAGGGTGATAGAAGAGGC，R：GTGTAAGGACCCATCGGAGAA。

1.5.2 Western blot檢測 將細(xì)胞以1×105個/mL密度接種至6孔板，培養(yǎng)24 h后，換用空白培養(yǎng)液(對照組)或含不同濃度DHA(25、50、100 μmol/L)的培養(yǎng)液預(yù)處理2 h，采用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。采用10% SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)至0.22 μm孔徑的PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h。孵育HO-1、β-actin一抗，4 ℃過夜。TBST洗膜后，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h。TBST洗膜后，采用ECL試劑顯色并成像。

1.6 統(tǒng)計分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，定量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用獨立樣本t檢驗，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 DHA對HGFs細(xì)胞活性的影響

活死細(xì)胞染色顯示，DHA濃度為100 μmol/L時，紅色熒光染色的細(xì)胞數(shù)與對照組相比未見改變，但當(dāng)DHA濃度達(dá)到200 μmol/L時，紅色熒光染色的細(xì)胞數(shù)明顯增加，表明細(xì)胞活性下降(圖1)。根據(jù)該結(jié)果，后續(xù)實驗中DHA最高濃度采用100 μmol/L。

圖1 DHA對HGFs細(xì)胞活性的影響(活死細(xì)胞染色)( ×100)

2.2 DHA對HGFs細(xì)胞形態(tài)的影響

光學(xué)顯微鏡(圖2B)及熒光顯微鏡(圖2D)觀察顯示，HGFs在100 μmol/L DHA處理48 h后，細(xì)胞形態(tài)與對照組(圖2A、C)相比未見明顯改變。

A：對照組，光學(xué)顯微鏡( ×100)；B：DHA 100 μmol/L處理組，光學(xué)顯微鏡( ×100)；C：對照組，熒光顯微鏡( ×400)；D：DHA 100 μmol/L處理組，熒光顯微鏡( ×400)

2.3 DHA對HGFs細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測表明，與對照組相比，100 μmol/L DHA處理HGFs 24 h和48 h后，G0/G1、S和G2/M期細(xì)胞所占比例均未發(fā)生明顯改變，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖3A)，代表性的流式圖見圖3B。

A：細(xì)胞周期統(tǒng)計圖；B：代表性的流式代表圖

2.4 DHA對P.gingivalis LPS及熱滅活P.gingivalis誘導(dǎo)HGFs表達(dá)IL-6、IL-8、IL-1β mRNA的影響

定量PCR結(jié)果顯示，25、50、100 μmol/L DHA預(yù)處理均可顯著下調(diào)P.gingivalisLPS誘導(dǎo)HGFs表達(dá)的IL-1β mRNA及熱滅活P.gingivalis誘導(dǎo)HGFs表達(dá)的IL-6、IL-8和IL-1β mRNA(P<0.05)，且隨著DHA濃度的增加，其抑制效果逐漸增強(qiáng)(圖4C～F)；100 μmol/L DHA還可明顯下調(diào)P.gingivalisLPS誘導(dǎo)表達(dá)的IL-6和IL-8 mRNA(P<0.05)(圖4A、B)。

A～C：DHA對P.gingivalis LPS誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)IL-6、IL-8、IL-1β mRNA的影響；D～F：DHA對熱滅活P.gingivalis誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)IL-6、IL-8、IL-1β mRNA的影響；*：與LPS組、滅活全菌組相比，P<0.05

2.5 DHA對P.gingivalis LPS及熱滅活P.gingivalis誘導(dǎo)HGFs表達(dá)IL-6、IL-8、IL-1β蛋白的影響

ELISA結(jié)果顯示，25、50、100 μmol/L DHA預(yù)處理均可顯著下調(diào)P.gingivalisLPS誘導(dǎo)HGFs分泌的IL-6蛋白及熱滅活P.gingivalis誘導(dǎo)HGFs分泌的IL-6和IL-8蛋白(P<0.05)，且隨著DHA濃度的增加，其抑制效果逐漸增強(qiáng)(圖5A、C、D)；100 μmol/L DHA還可明顯下調(diào)P.gingivalisLPS誘導(dǎo)分泌的IL-8(P<0.05)(圖5B)。

A、B：DHA對P.gingivalis LPS誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)IL-6和IL-8蛋白的影響；C、D：DHA對熱滅活P.gingivalis誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)IL-6和IL-8蛋白的影響；*：與LPS組、滅活全菌組相比，P<0.05

而對于IL-1β蛋白，ELISA檢測中各組樣品的光密度值均低于標(biāo)準(zhǔn)曲線的最小光密度值，因此，未檢測出其表達(dá)。

2.6 DHA對P.gingivalis LPS及熱滅活P.gingivalis誘導(dǎo)HGFs表達(dá)HO-1 mRNA的影響

定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，25、50、100 μmol/L DHA預(yù)處理HGFs后，均可顯著上調(diào)P.gingivalisLPS及熱滅活P.gingivalis誘導(dǎo)HGFs表達(dá)的HO-1 mRNA(P<0.05)，且其上調(diào)作用呈濃度依賴性(圖6)。

A：DHA對P.gingivalis LPS誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)HO-1 mRNA的影響；B：DHA對熱滅活P.gingivalis誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)HO-1 mRNA的影響；*：與LPS組、滅活全菌組相比，P<0.05

2.7 DHA對HGFs表達(dá)HO-1蛋白的影響

Western blot結(jié)果顯示，25、50、100 μmol/L DHA均可顯著上調(diào)HGFs表達(dá)的HO-1蛋白(P<0.05)(圖7)。

*：與對照組相比，P<0.05

3 討 論

DHA是n-3 PUFAs的代表性成員之一，具有22個碳原子和6個不飽和雙鍵，其不飽和雙鍵起始于碳?xì)滏溂谆说牡?和第4碳原子之間。人體自身并不能有效合成DHA，僅能通過攝入深海魚類及魚油補(bǔ)充。DHA具有多種生物學(xué)功能，包括抗菌、抗炎、抗氧化和抗腫瘤等，并且不會產(chǎn)生明顯的抗藥性[5-7,10-11]。

目前關(guān)于DHA抗炎作用的研究主要集中于免疫細(xì)胞[11]，其對牙周組織細(xì)胞的作用僅見于人牙周膜成纖維細(xì)胞(human periodontal ligament cells，HPDLCs)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)：DHA對牙周致病菌及其生物膜具有顯著的抑制作用[12]，可在不影響細(xì)胞活性的前提下顯著抑制P.gingivalisLPS誘導(dǎo)HPDLCs表達(dá)的炎癥因子，包括白介素-6(interleukin-6，IL-6)、IL-8及IL-1β[12-13]。

HPDLCs是牙周膜中的主要細(xì)胞，而牙周炎癥初期主要累及牙齦組織，HGFs作為牙齦組織中的主要組成細(xì)胞，在牙周炎癥初期發(fā)揮作用。DHA對HGFs生物學(xué)活性及炎癥因子表達(dá)的作用尚不得而知，本研究就此進(jìn)行了探討。

研究表明，高濃度DHA可顯著抑制腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞的活性。當(dāng)DHA濃度≥228 μmol/L，可呈劑量依賴性抑制胃癌細(xì)胞生長，可能與DHA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)[14]。同樣，100 μmol/L DHA可明顯抑制前列腺癌細(xì)胞系增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。對于人內(nèi)皮細(xì)胞系，DHA從200 μmol/L開始顯著下調(diào)細(xì)胞活性[16]。而50、100 μmol/L DHA對人內(nèi)皮細(xì)胞系及小鼠成肌細(xì)胞系的細(xì)胞活性無明顯影響[16-17]。同樣，本實驗前期采用MTT檢測發(fā)現(xiàn)，25、50、100 μmol/L DHA并不影響HPDLCs及HGFs的細(xì)胞活性，但200 μmol/L DHA則使細(xì)胞活性顯著下降[10,12-13]。在前期實驗基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步采用活死細(xì)胞染色觀察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)DHA濃度達(dá)到200 μmol/L時，可明顯抑制HGFs活性，而100 μmol/L DHA則不影響細(xì)胞活性，與課題組前期MTT結(jié)果一致[10,12-13]，這為DHA的臨床應(yīng)用提供了濃度選擇方面的理論依據(jù)。

目前DHA對細(xì)胞周期的作用研究較少。DHA可呈濃度依賴性上調(diào)成肌細(xì)胞系[17]及乳腺癌細(xì)胞[18]G0/G1期，下調(diào)S期和G2/M期細(xì)胞比率。與上述結(jié)果不同，100 μmol/L DHA并不會改變?nèi)橄侔┘?xì)胞G0/G1期、S期及G2/M期細(xì)胞比率[19]。我們的研究結(jié)果也未發(fā)現(xiàn)100 μmol/L DHA對HGFs各細(xì)胞周期比例的改變。上述研究結(jié)果的不一致，可能是由于不同的細(xì)胞間脂肪酸的多樣性所致[17]。

DHA對多種炎癥介質(zhì)具有明顯的抑制作用，目前研究多集中于免疫細(xì)胞[20-22]。DHA可顯著下調(diào)LPS誘導(dǎo)單核細(xì)胞表達(dá)的IL-6和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)[21]。DHA還可顯著抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表達(dá)的IL-6和IL-1β[22]。而在牙周防御反應(yīng)中，除了免疫細(xì)胞，牙周組織細(xì)胞也發(fā)揮了必不可少的作用。我們前期已發(fā)現(xiàn)，在25～100 μmol/L濃度范圍內(nèi)，DHA可呈劑量依賴性下調(diào)P.gingivalisLPS誘導(dǎo)HPDLCs表達(dá)的IL-6、IL-8和IL-1β[12-13]。在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，100 μmol/L DHA可顯著抑制P.gingivalisLPS及熱滅活P.gingivalis誘導(dǎo)HGFs表達(dá)的IL-6、IL-8、IL-1β mRNA以及IL-6、IL-8蛋白，25、50 μmol/L DHA也表現(xiàn)出不同程度的下調(diào)作用。這與DHA對免疫細(xì)胞炎癥因子的抑制作用一致[21-22]。

目前，DHA的抗炎機(jī)制尚不明確，可能與其誘導(dǎo)HO-1表達(dá)有關(guān)。對于人內(nèi)皮細(xì)胞系，50 μmol/L和100 μmol/L DHA可上調(diào)其HO-1表達(dá)，而通過siRNA抑制HO-1后，DHA對炎癥因子的抑制能力減弱[16]。同樣，DHA可上調(diào)小鼠腹膜巨噬細(xì)胞HO-1的表達(dá)，可能與其下調(diào)IL-6、IL-1β和TNF-α有關(guān)[23]。我們在本研究中也發(fā)現(xiàn)DHA可顯著上調(diào)HO-1表達(dá)，該上調(diào)趨勢與其對炎癥因子的抑制趨勢相反，提示HO-1可能在DHA對HGFs的抗炎效果中發(fā)揮作用。為了進(jìn)一步明確HO-1的作用，有待將其抑制或敲除后進(jìn)一步觀察DHA抗炎效果的變化來加以證實。

綜上所述，DHA可在不影響HGFs生物學(xué)活性的前提下，有效抑制牙周致病菌及其毒力因子誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)的炎癥因子，該抑制作用可能與DHA對HO-1的上調(diào)作用有關(guān)，提示DHA用于牙周炎防治的潛在可能。