田家瑜， 郭麗麗,2， 邱 勇,3， 喬果果,4， 張志紅*

(1.山西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室， 太原 030001； 2.太原市疾病預(yù)防控制中心科教科， 太原 030001； 3.成都市龍泉驛區(qū)龍泉平安社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心， 成都 610100； 4.山西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心， 太原 030001)

隨著經(jīng)濟(jì)全球化和城市化的快速發(fā)展，大氣顆粒物特別是空氣動(dòng)力學(xué)直徑小于等于2.5 μm的顆粒物(PM2.5)污染問題越來越嚴(yán)重，由于其含有大量有毒有害的化學(xué)物質(zhì)，對(duì)人體健康具有嚴(yán)重不利影響，已逐漸成為公眾關(guān)注的主要環(huán)境問題。在交通發(fā)達(dá)的大中型城市，機(jī)動(dòng)車尾氣的大量排放是PM2.5的一個(gè)主要來源。

大量研究表明，細(xì)顆粒物污染與呼吸系統(tǒng)疾病、心血管疾病、癌癥等多種疾病的發(fā)病率和死亡率呈正相關(guān)[1]。PM2.5每增加10 μg/m3，呼吸系統(tǒng)疾病和肺癌死亡的風(fēng)險(xiǎn)分別增加約6%和8%[2]，心血管疾病住院人數(shù)約增加0.96%[95%置信區(qū)間(confidence internals, CI)0.1%～1.83%][3]。此外，PM2.5還可損傷免疫系統(tǒng)，顆粒物經(jīng)肺間質(zhì)進(jìn)入淋巴系統(tǒng)，導(dǎo)致機(jī)體免疫功能紊亂，抵抗力降低，進(jìn)而使得患感染性疾病的風(fēng)險(xiǎn)增高[4]。研究表明，脾臟是機(jī)體最大的免疫器官，PM2.5暴露可抑制脾細(xì)胞的增殖，上調(diào)凋亡基因的表達(dá)[5]。PM2.5還可對(duì)人淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞遺傳學(xué)毒性[6]。馮欲靜等[7]發(fā)現(xiàn)PM2.5可誘導(dǎo)外周血淋巴細(xì)胞凋亡，可能與自由基產(chǎn)生并造成DNA損傷有關(guān)。前期學(xué)齡兒童的流行病學(xué)調(diào)查表明，重交通污染區(qū)兒童細(xì)胞免疫功能低于輕交通污染區(qū)，并且兒童外周血淋巴細(xì)胞早期凋亡率也高于輕污染區(qū)，表明細(xì)胞凋亡在機(jī)動(dòng)車尾氣抑制兒童免疫功能中起到了一定的作用[8]。盡管PM2.5可造成免疫毒性，但PM2.5尤其是交通相關(guān)PM2.5對(duì)免疫細(xì)胞的影響及具體機(jī)制尚不明確。

外周血淋巴細(xì)胞是機(jī)體進(jìn)行免疫應(yīng)答的一種重要細(xì)胞，當(dāng)機(jī)體免疫功能降低時(shí)，淋巴細(xì)胞數(shù)量就會(huì)減少[7]，淋巴細(xì)胞凋亡參與了免疫抑制的形成。因此，為進(jìn)一步探討交通相關(guān)PM2.5對(duì)免疫細(xì)胞毒性作用機(jī)制，選用人外周血淋巴細(xì)胞作為受試細(xì)胞開展實(shí)驗(yàn)，觀察交通相關(guān)PM2.5對(duì)淋巴細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)分子的影響，探討交通相關(guān)細(xì)顆粒物促進(jìn)淋巴細(xì)胞凋亡及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)儀器TH-1000CII型智能大容量無碳刷空氣總懸浮顆粒物采樣器(武漢天虹)， PM2.5切割器(武漢天虹)，玻璃纖維濾膜(武漢天虹)，酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)，F(xiàn)ACS Calibur型流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

實(shí)驗(yàn)試劑：人淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)蠊?，二甲基亞砜(天津紅巖公司)，1640(美國Gibco)，小牛血清(四季青)，Annexin V-FITC/PI(上海美季公司)，cAMP ELISA試劑盒(南京建成公司)，β-actin一抗(鼠抗人、北京中山)，β-actin二抗(羊抗鼠、北京中杉金橋)，Caspase-3、CREB一抗(兔抗人、博士德)，二抗(羊抗兔、博士德)，ECL發(fā)光液(碧云天)。

1.2 交通相關(guān)PM2.5的采集與收集

使用大容量總懸浮顆粒物采樣器于山西省太原市某污染嚴(yán)重的交通路口采集PM2.5。采樣前，空白濾膜先于450 ℃馬弗爐中烘烤1 h，冷卻后置于恒溫恒濕干燥器中平衡24 h，然后再稱重直到恒重。采樣時(shí)，采樣高度為1.5 m，采樣流量設(shè)置為1.05 m3/min，采樣時(shí)長為11～12 h/d，持續(xù)1個(gè)月，其中濾膜每隔3～4 h更換一次。采樣后，再次將濾膜置于干燥器中平衡24 h后稱重。

采樣后將濾膜剪成2 cm×2 cm的小塊并浸入去離子水中，經(jīng)超聲振蕩20 min×3次對(duì)PM2.5進(jìn)行洗脫，后再用6層紗布過濾振蕩液，使用高速冷凍離心機(jī)于4 ℃下離心濾液30 min(轉(zhuǎn)速14 000 r/min)，真空冷凍干燥下層懸液，低溫保存。臨用前取出用生理鹽水配制，超聲振蕩15 min，混勻滅菌后即可使用。

1.3 人外周血淋巴細(xì)胞的提取

抽取志愿者外周血(已獲知情同意)于肝素抗凝管中，用冷PBS倍比稀釋肝素抗凝血。在一離心管中先加入等量淋巴細(xì)胞分離液，再沿管壁緩緩加入稀釋后的血液，離心化，淋巴細(xì)胞停留在分離層與血漿層的交界面。吸出淋巴細(xì)胞層于另一離心管，用冷PBS再作倍比稀釋，混勻離心，棄上清液，之后再用PBS洗2次，待用。

1.4 人外周血淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)

向提取的外周血淋巴細(xì)胞中加入完全培養(yǎng)液(細(xì)胞密度為1 ×106個(gè)/mL)，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，用不同濃度的PM2.5染毒不同時(shí)間，染毒結(jié)束后測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。根據(jù)前期細(xì)胞增殖功能測(cè)定結(jié)果[9]，為保持80%的細(xì)胞增殖功能，選用0～320 μg/mL PM2.5濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的染毒劑量范圍。

1.5 人外周血淋巴細(xì)胞早期凋亡和壞死的測(cè)定

提取淋巴細(xì)胞于完全培養(yǎng)液37 ℃、5% CO2培養(yǎng)48 h后，用0(生理鹽水)、50、100、200 μg/mL濃度的PM2.5染毒細(xì)胞24 h和48 h。PBS洗滌收集的淋巴細(xì)胞1 500 r/min離心5 min兩次，分別加入Binding Buffer 500 μL懸浮細(xì)胞，Annexin-FITC 5 μL避光反應(yīng)30 min，Propidium Iodide(PI) 10 μL避光反應(yīng)10 min，隨后全部樣品立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。上機(jī)測(cè)定時(shí)綠色熒光通過FITC通道檢測(cè)，紅色熒光通過PI通道檢測(cè)(Ex=488 nm，Em=530 nm)。

1.6 Caspase-3和CREB蛋白表達(dá)的測(cè)定

提取的淋巴細(xì)胞于完全培養(yǎng)液37 ℃、5% CO2培養(yǎng)48 h后，用0(生理鹽水)、20、80、320 μg/mL濃度的PM2.5染毒24、48和72 h，收集淋巴細(xì)胞。先提取細(xì)胞總蛋白，并用BCA試劑盒對(duì)蛋白含量進(jìn)行測(cè)定，蛋白印跡法檢測(cè)人外周血淋巴細(xì)胞中Caspase-3和CREB的表達(dá)情況，隨后用Image J軟件對(duì)目的條帶和內(nèi)參條帶進(jìn)行測(cè)定，對(duì)各組目的和內(nèi)參條帶的比值進(jìn)行比較分析。

1.7 細(xì)胞內(nèi)cAMP含量的測(cè)定

用0、20、80、320 μg/mL濃度的PM2.5染毒培養(yǎng)24、48、72 h后收集淋巴細(xì)胞。細(xì)胞內(nèi)cAMP的濃度根據(jù)ELISA試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算各組cAMP含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 PM2.5對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞早期凋亡和壞死的影響

如表1所示，不同劑量的PM2.5染毒人外周血淋巴細(xì)胞24 h和48 h后，細(xì)胞均出現(xiàn)了早期凋亡和壞死的情況，并且有一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系，各劑量組與生理鹽水組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。此外，早期凋亡的發(fā)生還具有一定的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。

2.2 PM2.5染毒人外周血淋巴細(xì)胞Caspase-3蛋白的表達(dá)

如圖1所示，PM2.5染毒細(xì)胞24、48、72 h后，各劑量組Caspase-3蛋白表達(dá)水平均高于對(duì)照組，除80 μg/mL PM2.5染毒72 h外，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F24 h=26 250.228，P<0.001；F48 h=3 867.136，P<0.001；F72 h=701.278，P<0.001)。并且0、20、320 μg/mL濃度組隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的延長，Caspase-3蛋白表達(dá)水平增高。

2.3 細(xì)胞內(nèi)cAMP含量的變化

如表2所示，320 μg/mL PM2.5染毒細(xì)胞24、48、72 h后，細(xì)胞內(nèi)cAMP含量均比生理鹽水組升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。且各劑量組細(xì)胞內(nèi)cAMP含量在48 h最高。

表1 PM2.5對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞早期凋亡和壞死的影響Table 1 Effects of PM2.5 on early apoptosis and necrosis of human peripheral blood

表2 PM2.5染毒人外周血淋巴細(xì)胞24 h、48 h和72 h細(xì)胞內(nèi)cAMP含量的變化Table 2 Changes of cAMP content after human peripheral blood lymphocytes were exposed to PM2.5 for 24 h, 48 h and 72 h

*表示與0 μg/mL組比較，P<0.01；**表示與20 μg/mL組比較，P<0.01圖1 PM2.5染毒淋巴細(xì)胞24 h、48 h和72 h后 Caspase-3蛋白表達(dá)水平的變化Fig.1 Changes of Caspase-3 protein expression after lymphocytes were exposed to PM2.5 for 24 h, 48 h and 72 h

2.4 PM2.5染毒人外周血淋巴細(xì)胞CREB蛋白的表達(dá)

如圖2所示，染毒細(xì)胞72 h后，隨著PM2.5濃度的升高CREB蛋白表達(dá)量下降，各劑量組染毒72 h后均比生理鹽水組明顯降低(F72 h=6 219.570，P<0.001)。20、80、320 μg/mL劑量組染毒48 h后CREB蛋白表達(dá)量最高，但隨著染毒時(shí)間的延長，染毒72 h后達(dá)到最低。

*表示與0 μg/mL組比較，P<0.01；**表示與20 μg/mL組比較，P<0.01圖2 PM2.5染毒淋巴細(xì)胞24、48、72 h后 CREB蛋白表達(dá)水平的變化Fig.2 Changes of CREB protein expression in lymphocytes exposed to PM2.5 for 24 h, 48 h and 72 h

3 討論

細(xì)胞凋亡是指為維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因調(diào)控的自主且有序的1種細(xì)胞死亡方式，也稱程序性細(xì)胞死亡。細(xì)胞凋亡過程的紊亂參與了許多疾病的發(fā)生發(fā)展，如自身免疫性疾病、腫瘤等，然而能夠誘發(fā)細(xì)胞凋亡的因素也有很多，如環(huán)境、藥物、射線等都可以導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生凋亡[10]。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，人外周血淋巴細(xì)胞在不同劑量的交通相關(guān)PM2.5染毒24 h和48 h后，早期凋亡和壞死的發(fā)生均有劑量-效應(yīng)關(guān)系，早期凋亡還有一定的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系，說明交通相關(guān)PM2.5可誘導(dǎo)人外周血淋巴細(xì)胞凋亡，并且與濃度和接觸時(shí)間均有關(guān)。前期人群研究表明，交通污染嚴(yán)重區(qū)域?qū)W齡兒童外周血淋巴細(xì)胞早期凋亡的發(fā)生率高于輕污染區(qū)，這表明汽車排放的污染物誘導(dǎo)了淋巴細(xì)胞的早期凋亡[8]，與本次體外細(xì)胞研究結(jié)果一致。馮欲靜等[7]也發(fā)現(xiàn)PM2.5可使細(xì)胞內(nèi)自由基增多，造成DNA氧化損傷，最終導(dǎo)致外周血淋巴細(xì)胞凋亡。董潔等[11]研究也表明，交通相關(guān)PM2.5可導(dǎo)致6T-CEM細(xì)胞凋亡的發(fā)生，并可能通過線粒體途徑誘導(dǎo)凋亡。

Caspase-3被認(rèn)為是Caspase依賴性凋亡通路的最終標(biāo)志分子。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在染毒細(xì)胞24、48、72 h后，各濃度組Caspase-3蛋白表達(dá)水平均高于對(duì)照組，提示PM2.5暴露可誘導(dǎo)人外周血淋巴細(xì)胞發(fā)生凋亡，外周血淋巴細(xì)胞凋亡則會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫功能降低。PM2.5致淋巴細(xì)胞凋亡可能是因?yàn)槠鋽y帶多種有毒有害的物質(zhì)，例如PM2.5中含有大量的多環(huán)芳烴和非烴組分，可誘導(dǎo)小鼠肺泡巨噬細(xì)胞凋亡[12]。高濃度的多環(huán)芳烴和元素鎳與高細(xì)胞凋亡率和IL-1β的高表達(dá)密切相關(guān)[13]。張英英[14]研究結(jié)果顯示，PM2.5上負(fù)載有大量的重金屬，能夠誘導(dǎo)心肌細(xì)胞產(chǎn)生大量的活性氧，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞炎癥，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

PM2.5可誘導(dǎo)人外周血淋巴細(xì)胞凋亡，但其具體機(jī)制尚未完全明確。cAMP作為第二信使，可在正常機(jī)體細(xì)胞內(nèi)直接參與各種生理功能活動(dòng)的調(diào)控，例如細(xì)胞的代謝、增殖、分裂和凋亡以及激活離子通道、基因表達(dá)等多種生命活動(dòng)，同時(shí)其在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生和降解速率也受到各種胞內(nèi)和胞外信號(hào)的影響。研究顯示，提高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平能誘導(dǎo)多種淋巴瘤細(xì)胞增殖阻滯和凋亡[15]。細(xì)胞內(nèi)cAMP含量的增加與淋巴細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，AlCl3通過增加cAMP含量以及蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)基因表達(dá)誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡[16]。Gong等[17]研究發(fā)現(xiàn)，大劑量X射線可誘導(dǎo)胸腺細(xì)胞凋亡，在此過程中cAMP、蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)以及Ca2+起到了促進(jìn)作用。同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn)，CoCl2可降低平滑肌細(xì)胞cAMP含量，增加細(xì)胞凋亡[18]。cAMP的增加可以促進(jìn)凋亡，也可以抑制凋亡，因細(xì)胞類型的不同發(fā)揮不同的作用[15]。本研究結(jié)果顯示，在320 μg/mL PM2.5染毒人外周血淋巴細(xì)胞24、48、72 h后，細(xì)胞內(nèi)cAMP含量均比生理鹽水組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明PM2.5可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cAMP含量增加，進(jìn)而造成淋巴細(xì)胞凋亡。

CREB是真核細(xì)胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，受多種因素的激活調(diào)控靶基因，參與細(xì)胞的增殖、分化、能量代謝以及凋亡。研究顯示，CREB可通過H2O2酶減輕ROS對(duì)細(xì)胞的損傷，CREB沉默可導(dǎo)致氧化應(yīng)激后細(xì)胞凋亡的增加[19]。研究發(fā)現(xiàn)，使用CREB抑制劑抑制CREB的轉(zhuǎn)錄活性，通過下調(diào)Bcl-2顯著增強(qiáng)了PC12細(xì)胞凋亡[20]。而CREB的過表達(dá)能抑制SH-SY5Y細(xì)胞的氧化應(yīng)激和凋亡[21]。研究結(jié)果顯示，染毒細(xì)胞72 h后，CREB的表達(dá)量隨著PM2.5濃度的升高而降低，且各劑量組染毒72 h后CREB的表達(dá)量均比生理鹽水組明顯降低(P<0.01)，結(jié)合染毒72 h后Caspase-3凋亡蛋白表達(dá)最高，促進(jìn)了淋巴細(xì)胞凋亡，表明CREB可能負(fù)調(diào)控細(xì)胞凋亡形成，與前面相關(guān)研究基本一致。

4 結(jié)論

(1)交通相關(guān)PM2.5可誘導(dǎo)人外周血淋巴細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，并且與PM2.5濃度以及接觸時(shí)間有關(guān)。

(2)細(xì)胞內(nèi)cAMP和CREB參與了交通相關(guān)PM2.5誘導(dǎo)人外周血淋巴細(xì)胞凋亡的調(diào)控。