謝澳文，樊 磊，韓一鳴，李文靖，王 樂(lè)，張帥兵，呂揚(yáng)勇

河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001

黃曲霉毒素(aflatoxins, AFs)主要是由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的一種聚酮合酶類(lèi)(PKS)次級(jí)代謝產(chǎn)物。目前已獲得鑒定的黃曲霉毒素有20多種，包括B、M等多個(gè)家族，其中AFB1具有較強(qiáng)毒性和致癌性，在食品中也最為常見(jiàn)[1-2]。長(zhǎng)期攝入含有黃曲霉毒素的食物，可導(dǎo)致人體免疫力降低、肝功能損傷甚至誘發(fā)肝癌[3-5]。在一定的條件下，黃曲霉產(chǎn)生的AFB1常存在于玉米、花生等大宗農(nóng)產(chǎn)品中，由此造成的污染而導(dǎo)致的直接或間接經(jīng)濟(jì)損失非常嚴(yán)重。因此，深入研究黃曲霉毒素脫毒方法及其降解機(jī)理對(duì)于進(jìn)一步研究制定有效策略保證食品安全和人體健康具有重要意義。

目前，黃曲霉毒素的去除手段主要包括：物理方法如紫外照射[6-7]、高溫處理、微波處理[8]、放射性元素[9]及電子束照射[10]、某些物質(zhì)吸附[11]等；化學(xué)方法如酸處理、堿處理和氧化劑處理等[12-13]。然而，理化去除黃曲霉毒素的方法雖然能夠去除AFB1，但存在成本高、有化學(xué)殘留以及影響食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值等弊端[14-16]。因此，利用生物法去除黃曲霉毒素已成為目前的研究熱點(diǎn)之一，其機(jī)理是通過(guò)吸附作用或酶促反應(yīng)降解毒素從而達(dá)到脫毒的目的[17-20]。比如Liu等[21]研究發(fā)現(xiàn)假蜜環(huán)菌胞內(nèi)酶可將黃曲霉毒素轉(zhuǎn)化成環(huán)氧化物，并最終打開(kāi)雙呋喃環(huán)從而脫毒；Afsharmanesh等[22]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌UTB1在細(xì)菌素的生物合成過(guò)程中能夠產(chǎn)生一種降解黃曲霉毒素的氧化還原酶，并對(duì)其降解基因進(jìn)行了確證。在一定的條件下篩選得到降解酶的菌株，并通過(guò)發(fā)酵、分離純化脫毒酶的研究技術(shù)已廣泛應(yīng)用于食品、飼料等領(lǐng)域[23]。通過(guò)生物法去除黃曲霉毒素的過(guò)程高效且反應(yīng)是在溫和的條件下進(jìn)行，對(duì)于食品中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)基本不會(huì)造成破壞或者只是極少破壞，因此應(yīng)用前景廣泛[24-25]。

作者選取自然界發(fā)霉的糧食、秸稈、牛糞以及土壤等樣品，通過(guò)分離獲得了多個(gè)具有降解黃曲霉毒素能力的菌株，通過(guò)薄板層析初步篩選出降解效果較好的菌株；通過(guò)發(fā)酵條件的優(yōu)化，篩選降解菌株的最優(yōu)培養(yǎng)基，對(duì)其發(fā)揮作用的降解酶進(jìn)行質(zhì)譜鑒定；對(duì)降解產(chǎn)物萃取后，通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS/MS)獲得降解產(chǎn)物的分子量，推斷其可能的降解機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

發(fā)霉的花生、玉米、秸稈、土壤以及牛糞均采自鄭州郊區(qū)的農(nóng)田。Hormisch改良初篩培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基參考文獻(xiàn)[26-27]。其余培養(yǎng)基如下。

SC培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨 10.00、Glucose 5.00、K2HPO4·3H2O 0.10、KH2PO41.00、MnSO40.50、 MgSO4·7H2O 1.00，pH 7.0。

DJN培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨 10.00、酵母粉 5.00、K2HPO4·3H2O 0.10、KH2PO41.00、MnSO40.50、MgSO4·7H2O 1.00、牛肉膏 3.00,pH 7.0。

DPN培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10.00、Glucose 5.00、K2HPO4·3H2O 0.10、KH2PO41.00、MnSO40.50、MgSO4·7H2O 1.00、牛肉膏 3.00，pH 7.0。

1.2 主要儀器與設(shè)備

1260型高效液相色譜儀：安捷倫科技有限公司；熒光檢測(cè)器：島津公司；MicrOTOF-QII質(zhì)譜儀：布魯克公司；UV-3100型分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；恒溫?fù)u床：上海一恒儀器有限公司；5810R 型離心機(jī)：Eppendorf。

1.3 方法

1.3.1 AFB1降解菌的初篩與復(fù)篩

將5 g樣品置于95 mL的無(wú)菌水中，加入玻璃珠，在室溫條件下，160 r/min振蕩1 h，獲得懸濁液，取300 μL涂布于Hormisch改良初篩培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，挑選在初篩培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好的菌株進(jìn)行劃線分離，劃線分離3次后，挑取單菌落保存至LB斜面?zhèn)溆谩?菌種復(fù)篩參考孫糧等[24]的方法。

氯仿萃取之后，通過(guò)薄層層析法初步判斷菌株發(fā)酵液的降解效果，高效液相色譜法測(cè)定降解率，篩選出降解效果最優(yōu)的菌株。

1.3.2 高效液相色譜檢測(cè)AFB1

樣品前處理方法：以氯仿作為萃取劑，采用分步萃取的方式連續(xù)萃取3次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，用甲醇將萃取出的降解產(chǎn)物溶解，按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[28]采用液相色譜檢測(cè)。

1.3.3 AFB1降解菌的鑒定

參考《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[29]和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[30]進(jìn)行屬的鑒定。16 s rDNA基因擴(kuò)增及PCR程序參考孫糧等[24]的方法。

將獲得的測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性比對(duì)，并在MEGA7中進(jìn)行分析，計(jì)算相似性并采用Neighbor-Joining方法做系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1.3.4 降解菌株最優(yōu)培養(yǎng)基的選擇

挑選降解效果較好的菌株在LB培養(yǎng)基中活化后分別接種于SC、DJN及DPN培養(yǎng)基中，重復(fù)1.3.2的步驟，通過(guò)HPLC對(duì)樣品中AFB1的含量進(jìn)行檢測(cè)，并計(jì)算降解率。

1.3.5 降解AFB1成分分析

菌懸液及上清液的制備：取2 mL菌體發(fā)酵液，10 000 r/min離心2 min，收集上清液備用。菌體在無(wú)菌操作臺(tái)中使用無(wú)菌水清洗2次，并重懸于2 mL無(wú)菌水中制得菌懸液備用。

上清液處理：(1)上清液中加入終質(zhì)量濃度為0.01 g/mL蛋白酶K，室溫下處理1 h；(2)上清液加入終質(zhì)量濃度為0.01 g/mL SDS后處理6 h。分別在菌懸液，上清液，經(jīng)過(guò)蛋白酶K、SDS處理后的上清液中加入AFB1，按照1.3.1所述方法進(jìn)行降解試驗(yàn)并測(cè)定降解率。

1.3.6 不同培養(yǎng)基發(fā)酵上清液蛋白圖譜及差異蛋白鑒定

SDS-PAGE的分離膠與濃縮膠的濃度分別為15%與5%，通過(guò)SDS-PAGE比較不同降解率的發(fā)酵液上清液中蛋白圖譜的差異，篩選差異蛋白條帶，切膠后送北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，詳細(xì)方法參考文獻(xiàn)[31]。

1.3.7 AFB1降解產(chǎn)物分析

以上清液加AFB1振蕩0 h作為空白對(duì)照，按照1.3.2的步驟進(jìn)行降解試驗(yàn)，在190～800 nm進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描，測(cè)定降解產(chǎn)物的紫外吸收波長(zhǎng)。分別使用正丁醇、氯仿、乙酸乙酯等萃取劑對(duì)降解后的產(chǎn)物進(jìn)行萃取，采用分步萃取的方式連續(xù)萃取3次，在55 ℃下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，用甲醇將獲得的降解產(chǎn)物溶解，在190～800 nm進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描，并將含有降解產(chǎn)物的甲醇溶液用于質(zhì)譜檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選及鑒定

通過(guò)初篩從樣品中得到了46株降解株，對(duì)這些菌株進(jìn)行AFB1降解試驗(yàn)。結(jié)果顯示，從土壤中篩選出的N1菌株對(duì)AFB1有較好的降解效果，通過(guò)16S rDNA基因(圖1)及生理生化(表1)鑒定,結(jié)果表明該菌屬于克雷伯氏菌屬。

圖1 N1的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

表1 菌株N1的生理生化試驗(yàn)結(jié)果

2.2 降解AFB1最佳培養(yǎng)基篩選及降解成分分析

N1菌株在SC、DPN、DJN培養(yǎng)基中的發(fā)酵上清液對(duì)AFB1的降解率存在差異，分別為57%、36%、74%，因此，將DJN培養(yǎng)基確定為最佳培養(yǎng)基，在后續(xù)的降解試驗(yàn)中采用該培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵。

未處理的發(fā)酵上清液對(duì)黃曲霉毒素的降解率達(dá)到了74%，遠(yuǎn)高于菌體懸液對(duì)黃曲霉毒素20%的降解率，表明N1菌株對(duì)黃曲霉毒素的降解能力以上清液為主，菌體的吸附作用存在但不明顯。在上清液經(jīng)過(guò)蛋白酶K、SDS處理后，對(duì)黃曲霉毒素的降解能力大幅度下降，分別為10.56%和0。由此推斷上清液中對(duì)黃曲霉毒素具有降解能力的物質(zhì)可能為胞外酶。

2.3 AFB1降解酶的初步推斷

3種培養(yǎng)基上清液對(duì)AFB1降解率不同，同時(shí)初步確定降解物質(zhì)為胞外蛋白，因此，通過(guò)SDS-PAGE電泳對(duì)胞外蛋白圖譜進(jìn)行表征，考察不同培養(yǎng)基發(fā)酵上清液蛋白圖譜的差異，以期對(duì)目標(biāo)酶作初步分析，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同培養(yǎng)基發(fā)酵上清液的蛋白圖譜

圖2表明，N1菌株在3種培養(yǎng)基的發(fā)酵上清液中胞外蛋白圖譜差異性不明顯，但在DJN培養(yǎng)基的發(fā)酵上清液中蛋白條帶的濃度相比SC與DPN稍高。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，相比于另外2種培養(yǎng)基，23 kDa處蛋白條帶濃度較高且完整地分布在DJN發(fā)酵培養(yǎng)上清液中，因此選擇該分子量完整單一的①號(hào)條帶進(jìn)行切膠回收，并送至北京華大蛋白質(zhì)研究中心進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果，并結(jié)合已有文獻(xiàn)報(bào)道的黃曲霉毒素降解酶，綜合分析該條帶，初步推斷對(duì)應(yīng)的酶可能為Mn-超氧化物歧化酶(SodA)或NADH-醌氧化還原酶(NuoB)，在后續(xù)試驗(yàn)中需要做進(jìn)一步的蛋白分離鑒定，或者用基因克隆、異源表達(dá)等實(shí)驗(yàn)手段確定其種類(lèi)。

2.4 降解產(chǎn)物萃取及檢測(cè)

按照1.3.1的步驟進(jìn)行降解試驗(yàn)，降解結(jié)束后對(duì)降解體系進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果顯示在波長(zhǎng)為310 nm左右具有較強(qiáng)的紫外吸收峰(圖3a)。

圖3結(jié)果表明，氯仿和乙酸乙酯萃取產(chǎn)物的全波長(zhǎng)掃描結(jié)果與整個(gè)降解體系不同，在310 nm左右沒(méi)有吸收峰(圖3b和3c)，只有正丁醇萃取的產(chǎn)物在該波長(zhǎng)處具有較強(qiáng)紫外吸收峰，說(shuō)明降解產(chǎn)物存在其中(圖3d)。

2.5 LC-MS/MS檢測(cè)降解產(chǎn)物的分子量

將正丁醇萃取液經(jīng)過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，甲醇溶解后進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)，在負(fù)離子模式下甲醇及降解產(chǎn)物的粒子流如圖4所示。結(jié)果表明，甲醇溶液的粒子流背景噪聲較低，滿足測(cè)試要求，而正丁醇萃取產(chǎn)物則在保留時(shí)間為2.6 min有單一峰出現(xiàn)，其他雜質(zhì)峰不明顯。

對(duì)保留時(shí)間為2.6 min峰的物質(zhì)和可能的降解產(chǎn)物進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖5。該峰對(duì)應(yīng)的二級(jí)質(zhì)譜圖(圖5a)顯示其分子量為241.1，根據(jù)碎片峰提示，推測(cè)該降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)式如圖5b所示。研究表明黃曲霉毒素結(jié)構(gòu)中的苯環(huán)結(jié)構(gòu)相對(duì)比較穩(wěn)定，很難被破壞，而呋喃環(huán)上的 8、9 位雙鍵部位則容易被破壞，該功能雙鍵是黃曲霉毒素與蛋白和DNA形成等復(fù)合體的作用位點(diǎn)，也是導(dǎo)致基因突變和致癌的主要功能基團(tuán)[32]。此外，文獻(xiàn)[20]報(bào)道黃曲霉的內(nèi)酯鍵、甲氧基和環(huán)戊烯酮也能夠被破壞，從而降低其毒性。降解之后的結(jié)構(gòu)式(圖5b)與黃曲霉毒素B1原始結(jié)構(gòu)相比，呋喃環(huán)上的 8、9 位雙鍵被破壞，這與文獻(xiàn)[21,24]報(bào)道的一致；除此之外12位的甲氧基也被去除，其進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)需要采用核磁共振來(lái)確定。

圖3 N1菌株發(fā)酵上清液降解黃曲霉毒素B1產(chǎn)物全波長(zhǎng)掃描圖

圖4 降解產(chǎn)物負(fù)離子模式下粒子流圖

圖5 降解產(chǎn)物的二級(jí)質(zhì)譜圖及推測(cè)的結(jié)構(gòu)式

3 討論與結(jié)論

以黃曲霉毒素結(jié)構(gòu)類(lèi)似物香豆素為唯一碳源，從土壤中篩選出一株對(duì)AFB1具有良好降解能力的菌株N1，經(jīng)過(guò)分子生物學(xué)鑒定為克雷伯氏菌屬。目前對(duì)AFB1具有降解能力的大部分是枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、乳酸菌等，而克雷伯氏菌屬報(bào)道相對(duì)較少，只有最近王威等[33]做過(guò)類(lèi)似研究。研究發(fā)現(xiàn)該N1菌株在DJN發(fā)酵液中的上清液對(duì)AFB1降解效果最好，在37 ℃、72 h內(nèi)降解率為74%，初步分析其降解成分為胞外酶，胞外蛋白差異條帶的鑒定結(jié)果顯示：該酶可能為超氧化物歧化酶或者NADH -錕氧化還原酶，后期還需要對(duì)該蛋白進(jìn)行異源表達(dá)、分離純化以及降解效果分析等以明確其種類(lèi)。降解產(chǎn)物的分析結(jié)果表明，通過(guò)正丁醇萃取能夠獲得降解產(chǎn)物，表明通過(guò)胞外酶的作用，黃曲霉毒素結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，呋喃環(huán)上的 8、9 位雙鍵以及12位的甲氧基被破壞，降解產(chǎn)物的極性增大，親水性加強(qiáng)，LC-MS/MS結(jié)果顯示該降解產(chǎn)物的分子量為241.1，推測(cè)其呋喃環(huán)發(fā)生了變化，這與已有文獻(xiàn)報(bào)道的作用位點(diǎn)一致。本研究結(jié)果為進(jìn)一步分離純化該胞外酶，繼而進(jìn)行異源表達(dá)從而大規(guī)模獲取該蛋白并應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。