黃秋蘭，錢巧慧，范德平，劉紅綢，薛娜麗，高守霞，馬瑩瑋，周嘉平

(1.上海市嘉定區(qū)南翔醫(yī)院a.檢驗(yàn)科;b.中醫(yī)科，上海 201802；2.上海健康醫(yī)學(xué)院附屬周浦醫(yī)院教學(xué)培訓(xùn)部，上海 201318)

銅綠假單胞菌（pseudomonas aeruginosa，PA）是目前院內(nèi)感染的最重要條件致病菌之一，隨著臨床碳青霉烯類藥物的廣泛應(yīng)用，耐碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌（carbapenem-resistantpseudomonas aeruginosa，CRPA）逐年增多，相關(guān)感染患者的死亡率呈逐年上升趨勢(shì)[1]。近年世界衛(wèi)生組織（WHO）報(bào)告也指出耐碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌已是最致命的病原菌之一，臨床為控制相關(guān)感染迫切需要合理使用有效的抗生素和治療方法[2-4]。

但是現(xiàn)有抗CRPA 感染藥物，如抗菌肽、鐵鰲合物等，均未廣泛應(yīng)用于臨床，同時(shí)新型抗生素研發(fā)也需要一個(gè)長(zhǎng)期的過(guò)程。中醫(yī)藥治療臨床感染性疾病已歷史久遠(yuǎn)，目前有近百種較為常用的抗菌中草藥。魚腥草味辛，性微寒，可清熱解毒、消癰排膿、利尿通淋，既往多用于治療肺癰吐膿、痰熱喘咳等。現(xiàn)代科學(xué)研究表明魚腥草含有抑菌成分，具有抑菌作用，可用于治療呼吸道感染、結(jié)膜炎等炎癥性疾病[5-6]。本研究旨在分析魚腥草聯(lián)合亞胺培南對(duì)CRPA 的體外殺菌效果，為合理使用抗生素、預(yù)防和控制醫(yī)院感染提供參考。

1 材料和方法

1.1 菌株來(lái)源 從2018年1月～2020年3月上海市某醫(yī)院收治的患者采集痰、尿、創(chuàng)面等液體標(biāo)本，對(duì)分離到的50 株CRPA 進(jìn)行研究，所有菌株均經(jīng)Vitek2Compact 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏儀（生物梅里埃公司，法國(guó)）鑒定，剔除來(lái)源同一患者的重復(fù)菌株。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器：Vitek2Compact，酶標(biāo)儀（SMMk3），微量移液器，生物安全柜，96 孔平底組織培養(yǎng)板，電子分析天平。

1.2.2 試劑：①注射用亞胺培南-西司他丁鈉（默沙東公司，批號(hào):S041089，規(guī)格：亞胺培南500mg和西司他丁鈉500mg/瓶）。將蒸餾水作為溶劑，無(wú)菌條件下配置128U/ml 亞胺培南原液，即每瓶注射用亞胺培南西司他丁鈉用1 953.13ml 無(wú)菌注射用水溶解，并貯存于4℃冰箱中備用。②魚腥草標(biāo)準(zhǔn)品（上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，純度99.8%，批號(hào)：6858，規(guī)格：20mg/瓶）。無(wú)菌操作下用無(wú)菌注射用水作溶劑，配制1 024μg/ml 的魚腥草原液。

1.2.3 CRPA 懸液的制備：使用液體培養(yǎng)法制備，在基礎(chǔ)瓊脂培養(yǎng)基的平板上對(duì)CRPA 傳代2～3 次，確保其保持良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。使用接種環(huán)在無(wú)菌條件下取一環(huán)菌落，將其接種在4～5ml 的MH 肉湯培養(yǎng)液內(nèi)，恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4～6h（35℃）。使用生理鹽水校正濃度至0.5 麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)，將懸液進(jìn)行1:100 稀釋，15min 內(nèi)接種，此時(shí)含菌量約為

1.5 ×106CFU/ml。

1.3 方法

1.3.1 最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）測(cè)定：50 株CRPA 使用微量肉湯稀釋法測(cè)定MIC 值，將魚腥草素鈉原液及亞胺培南原液使用試管倍比稀釋法制備成一系列的濃度稀釋液。制備菌懸液，50μl/孔進(jìn)行接種，同時(shí)設(shè)置陰性與陽(yáng)性對(duì)照。做3 個(gè)重復(fù)，恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)16～18h 后觀察，無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)且孔內(nèi)澄清即為MIC。

1.3.2 聯(lián)合抑菌效應(yīng)判斷：通過(guò)棋盤稀釋法測(cè)定分級(jí)抑菌濃度（fractional inhibitory concentration，F(xiàn)IC）指數(shù)。分別以兩藥MIC 的2 倍為最高稀釋濃度，按試管倍比稀釋法縱橫加25μl 入無(wú)菌96 孔板內(nèi)，每孔中可得到不同濃度組合的兩種抗生素混合液。再制備CRPA 懸液，在15 min 內(nèi)將制備好的菌液每孔50μl 加入孔內(nèi)，此時(shí)每孔最終接種菌量約為5×105CFU/ml，設(shè)置藥物單獨(dú)抗菌試驗(yàn)對(duì)照、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，置35℃培養(yǎng)16 ～18h 后觀察結(jié)果。試驗(yàn)重復(fù)3 次?？變?nèi)澄清無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度，使用棋盤稀釋法測(cè)試并計(jì)算FIC 指數(shù)，由聯(lián)合MIC 和單測(cè)MIC 應(yīng)用公式計(jì)算FIC 指數(shù)：FIC 指數(shù)＝A 藥聯(lián)合時(shí)的MIC/A 藥單測(cè)MIC ＋B藥聯(lián)合時(shí)的MIC/B 藥單測(cè)MIC。并依據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)來(lái)判斷兩藥聯(lián)合的抗菌作用：IC 指數(shù)＜0.5 為協(xié)同作用；0.5 ～1 為相加作用；1～2 為無(wú)相關(guān)作用；＞2為拮抗作用。

1.3.3 浮游菌時(shí)間殺菌曲線：隨機(jī)選取2 株敏感菌株，在含有1×109CFU/L 浮游菌的肉湯內(nèi)加入魚腥草、亞胺培南或魚腥草及亞胺培南，其終濃度分別為16,4 和2mg/L，并設(shè)置空白對(duì)照組，37℃下振蕩培養(yǎng)。在各時(shí)間點(diǎn)分別取樣100μl 進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。殺菌效應(yīng)：24h 時(shí)細(xì)菌數(shù)量降低≥6log CFU/L。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用WHONET 6.0 軟件和SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用率（%）表示，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 亞胺培南、魚腥草單用與聯(lián)用對(duì)CRPA 的MIC 見(jiàn)表1。對(duì)50 株CRPA 進(jìn)行測(cè)定，亞胺培南單用的MIC50和MIC90均高于魚腥草單用及亞胺培南和魚腥草聯(lián)合使用，且魚腥草單用的MIC50和MIC90均高于亞胺培南和魚腥草聯(lián)合使用。

表1 亞胺培南、魚腥草單用和聯(lián)用對(duì)CRPA 的MIC（mg/L）

2.2 亞胺培南和魚腥草聯(lián)用對(duì)CRPA 的FIC 50 株測(cè)試菌株，其中12（24.0%）菌株亞胺培南和魚腥草聯(lián)用后FIC 結(jié)果為＜0.5，呈現(xiàn)協(xié)同作用；30 株（60.0%）FIC 結(jié)果為0.5～1.0，表現(xiàn)為相加作用；8株（16.0%）FIC 結(jié)果為1.0～2.0，表現(xiàn)為無(wú)相關(guān)作用；未發(fā)現(xiàn)有菌株FIC 結(jié)果表現(xiàn)為拮抗作用。

2.3 亞胺培南、魚腥草單用和聯(lián)用對(duì)浮游菌的時(shí)間殺菌曲線 隨機(jī)選取2 株菌株觀察，發(fā)現(xiàn)24h 后浮游菌數(shù)量均＜6log CFU/L，提示無(wú)殺菌效果。單獨(dú)使用亞胺培南6～12h 后，菌株均出現(xiàn)細(xì)菌恢復(fù)生長(zhǎng)的現(xiàn)象。魚腥草聯(lián)合亞胺培南使用時(shí)，菌株的浮游菌數(shù)量降低均＞6log CFU/L，且24h 時(shí)均無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)現(xiàn)象，見(jiàn)圖1。

圖1 亞胺培南、魚腥草單用和聯(lián)用對(duì)CRPA 浮游菌的時(shí)間殺菌曲線

3 討論

PA 極易出現(xiàn)耐藥，且耐藥機(jī)制十分復(fù)雜，即使部分菌株是初次分離的敏感菌株，在用抗生素治療3～4 天后即可發(fā)生耐藥[7-8]。臨床分離到的CRPA菌株，往往同時(shí)對(duì)氨基苷類、氟喹諾酮類以及β-內(nèi)酰胺類等抗生素耐藥，盡管多黏菌素可能是目前對(duì)CRPA 最為有效的抗生素之一，但是其毒副作用大，臨床較少使用；替加環(huán)素是耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌感染的首選，但對(duì)CRPA 無(wú)抗菌活性。新型抗生素的研發(fā)是克服CRPA 耐藥性的有效途徑，但新藥開(kāi)發(fā)周期長(zhǎng)、投資大，短期內(nèi)也無(wú)新藥可用于臨床抗感染治療。

中醫(yī)藥治療臨床感染性疾病已歷史久遠(yuǎn)，目前有近百種較為常用的抗菌中草藥，因而從中草藥中去篩選對(duì)銅綠假單胞菌具有較強(qiáng)抗菌活性的藥物或相關(guān)成分可能有助于CRPA 感染的治療。近年有研究通過(guò)篩查12 種中藥對(duì)銅綠假單胞菌的體外抗菌活性，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)魚腥草具有體外抑制銅綠假單胞菌的活性[9]。然而CRPA 具有廣泛耐藥的特性，單一的中藥抑制其活性作用有限，本研究旨在分析亞胺培南作為臨床一線用藥抗多重耐藥PA 感染理論基礎(chǔ)上，聯(lián)合魚腥草在體外抗CRPA 的活性。研究結(jié)果顯示亞胺培南單用的MIC 均高于魚腥草單用及亞胺培南和魚腥草聯(lián)合使用，且魚腥草單用的MIC50和MIC90均高于亞胺培南和魚腥草聯(lián)合使用。通過(guò)對(duì)CPRA 的MIC 值分析，本研究同時(shí)也證明魚腥草對(duì)CRPA 具有一定的抑菌活性。

為進(jìn)一步分析魚腥草和亞胺培南體外聯(lián)合抑菌效應(yīng)，本研究通過(guò)棋盤稀釋法測(cè)定分級(jí)抑菌濃度對(duì)50 株CRPA 進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)魚腥草和亞胺培南聯(lián)用后，測(cè)試菌株主要呈現(xiàn)協(xié)同作用和相加作用，未發(fā)現(xiàn)有菌株FIC 結(jié)果表現(xiàn)為拮抗作用。已有研究發(fā)現(xiàn)由于中藥藥性平和，毒副作用小且不易產(chǎn)生耐藥性，與西藥聯(lián)用可增強(qiáng)療效[10]?；谠撗芯坷碚?，本研究結(jié)論也進(jìn)一步顯示魚腥草和亞胺培南聯(lián)用可增強(qiáng)CRPA 的抑菌效率。

為從時(shí)間維度驗(yàn)證魚腥草和亞胺培南對(duì)CRPA的體外抑菌效率，本研究最后通過(guò)隨機(jī)選取2 株菌株觀察對(duì)浮游菌的時(shí)間殺菌曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用亞胺培南6～12h 后，菌株均出現(xiàn)細(xì)菌恢復(fù)生長(zhǎng)的現(xiàn)象，而魚腥草聯(lián)合亞胺培南使用時(shí)，菌株的浮游菌數(shù)量明顯降低，且24h 時(shí)無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)現(xiàn)象。該結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明了魚腥草聯(lián)合亞胺培南抗PA 時(shí)較不易發(fā)生耐藥，具有較佳的協(xié)同抗菌作用。

對(duì)于魚腥草抑制銅綠假單胞菌作用機(jī)制，包括抑制LasA 蛋白酶的活性[11]、調(diào)控細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)[12]以及消除生物膜的屏障[13]等，本研究并未在分子水平進(jìn)行相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)的檢測(cè)，同時(shí)魚腥草的體外抑菌效率有待在動(dòng)物水平進(jìn)一步驗(yàn)證。