徐禮云，陳延儒，董弦弦，吳曉江，鄧夢(mèng)菲，巫小丹，萬(wàn) 茵，劉成梅,b，付桂明,b*

(南昌大學(xué)a.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；食品學(xué)院；b.國(guó)際食品創(chuàng)新研究院，江西 南昌 330047)

瑞士乳桿菌(Lactobaccillushelveticus)是一種常見(jiàn)的具有益生功能的乳酸菌，具有高蛋白水解活性，常被用于強(qiáng)化酸奶，能將乳制品中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為生物活性肽[1-2]。添加瑞士乳桿菌的發(fā)酵乳制品具有減緩疲勞和肌肉損傷的作用，并且食用加入了瑞士乳桿菌的發(fā)酵牛奶可以提高老年人的睡眠效率[3-4]。此外，瑞士乳桿菌產(chǎn)生的胞外多糖，具有多種益生特性，如抗氧化和抗癌作用[5]。因此，瑞士乳桿菌可以被認(rèn)為是一種多功能益生菌，在功能性食品和乳制品工業(yè)中有著廣闊的應(yīng)用前景。

工業(yè)生產(chǎn)活菌發(fā)酵劑時(shí)，噴霧干燥由于其價(jià)格低廉而得到廣泛應(yīng)用。然而乳酸菌耐熱性能弱，在噴霧干燥過(guò)程中易遭受高溫和脫水等惡劣環(huán)境影響，引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)損傷、蛋白質(zhì)變性和酶活性的喪失等，導(dǎo)致獲得的乳酸菌菌劑活力較低[6]。目前提高乳酸菌發(fā)酵劑的活力的研究主要集中于通過(guò)添加高效抗逆保護(hù)劑、特殊營(yíng)養(yǎng)成分或優(yōu)化干燥工藝參數(shù)等方法[7-8]。如El-Sayed等[6]研究發(fā)現(xiàn)，加入黃油可以提高噴霧干燥制得的酸奶粉中瑞士乳桿菌的存活率。

在受外界脅迫時(shí)，微生物可通過(guò)啟動(dòng)代謝補(bǔ)償機(jī)制，產(chǎn)生一系列的生理和代謝變化，如調(diào)節(jié)膜的流動(dòng)性和通透性、增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(海藻糖，可溶性蛋白)產(chǎn)生和提高抗氧化酶活性等，從而使整個(gè)細(xì)胞進(jìn)入對(duì)外界脅迫的防御狀態(tài)[9-10]。但對(duì)高溫脅迫下瑞士乳桿菌代謝補(bǔ)償機(jī)制的研究較少。因此，本文以實(shí)驗(yàn)室保藏的瑞士乳桿菌NCUF 210.1為研究對(duì)象，對(duì)其高溫脅迫后的細(xì)胞膜的流動(dòng)性和通透性，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和抗氧化酶活性進(jìn)行分析，并通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，從分子層面探究高溫脅迫下瑞士乳桿菌的補(bǔ)償效應(yīng)，以期為瑞士乳桿菌在噴霧干燥等食品熱加工條件的選擇和耐高溫工程菌株的構(gòu)建提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌株

瑞士乳桿菌(LactobaccillushelveticusNCUF 210.1)，為南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)室保藏菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，牛肉浸粉8 g，酵母浸粉4 g，檸檬酸氫二銨2 g，CH3COONa 5 g，K2HPO42 g，MnSO4·4H2O 0.04 g，MnSO4·7H2O 0.2 g，吐溫-80 1 mL，水1 L。調(diào)節(jié)pH值為6.0，121 ℃高壓滅菌15 min。

1.1.3 試劑

蛋白胨、牛肉浸粉、酵母浸粉：北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DDS-307型電導(dǎo)率儀，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；SP-756P可見(jiàn)分光亮度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；F-700熒光分光光度計(jì)，日本日立高新技術(shù)公司；SPX-80S-Ⅱ恒溫培養(yǎng)箱，上海新苗實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 瑞士乳桿菌的活化

將實(shí)驗(yàn)室保藏的瑞士乳桿菌在MRS固體培養(yǎng)基平板上劃線(xiàn)分離后，挑取單菌落在MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，37 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h。

1.3.2 不同培養(yǎng)溫度條件下瑞士乳桿菌生長(zhǎng)趨勢(shì)的研究

將活化后的瑞士乳桿菌按1%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基，分別于37 ℃，39 ℃，41 ℃，42 ℃，45 ℃，47 ℃和49 ℃下培養(yǎng)。每隔2 h取樣一次，采用比濁法，測(cè)定波長(zhǎng)600 nm的吸光值。繪制其在不同培養(yǎng)溫度下的生長(zhǎng)曲線(xiàn)[11]。

1.3.3 細(xì)胞膜流動(dòng)性的測(cè)定

根據(jù)楊勝平等[12]的方法并略有修改。將瑞士乳桿菌種子液按1%的接種量接種于50 mL的MRS液體培養(yǎng)基中，置于42 ℃和47 ℃培養(yǎng)，分別于8，10和12 h時(shí)取樣，4 ℃下7 000 r·min-1離心10 min，收集菌體進(jìn)行細(xì)胞膜流動(dòng)性的測(cè)定。

1.3.4 細(xì)胞膜透性的測(cè)定

參照史明科[10]的方法并略有修改。將瑞士乳桿菌種子液按1%的接種量接種于50 mL的MRS液體培養(yǎng)基中，置于42 ℃和47 ℃培養(yǎng)，分別于8，10和12 h時(shí)取樣，4 ℃下7 000 r·min-1離心10 min，收集菌體沉淀進(jìn)行電導(dǎo)率的測(cè)定。

1.3.5 可溶性蛋白含量測(cè)定

可溶性蛋白含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)染色法[10]。將瑞士乳桿菌種子液按1%的接種量接種于50 mL的MRS液體培養(yǎng)基中于42和47 ℃培養(yǎng)，分別于8，10和12 h時(shí)取樣，4 ℃下7 000 r·min-1離心10 min，收集菌體。經(jīng)磷酸緩沖鹽溶液清洗2次，重懸于5 mL磷酸緩沖鹽溶液中，4 ℃下10 000 r·min-1離心20 min，取1.0 mL上清液加入5.0 mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液后靜置5 min后，測(cè)定波長(zhǎng)595 nm的吸光值。對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算可溶性蛋白含量，單位為mg/g細(xì)胞干重。

1.3.6 海藻糖含量測(cè)定

海藻糖含量測(cè)定參照史明科[10]的方法并略有修改。將瑞士乳桿菌種子液按1%的接種量接種于50 mL的MRS液體培養(yǎng)基中于42和47 ℃培養(yǎng)，分別于8，10和12 h時(shí)取30 mL菌樣，4 ℃下7 000 r·min-1離心10 min，收集菌體。經(jīng)磷酸緩沖鹽溶液清洗2次，加入5 mL 10%三氯乙酸，冰水浴1 h，4 ℃下7 000 r·min-1離心10 min。取稀釋至合適倍數(shù)的上清液(1 mL)進(jìn)行海藻糖的含量的測(cè)定。將菌體沉淀置于105 ℃干燥以評(píng)估菌體生物量。對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算海藻糖含量，單位為mg·g-1細(xì)胞干重。

1.3.7 超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定

SOD活性測(cè)定參照史明科[10]的方法并略有修改。將瑞士乳桿菌種子液按1%的接種量接種于50 mL的MRS液體培養(yǎng)基中于42和47 ℃培養(yǎng)，分別于8，10和12 h時(shí)取樣，4 ℃下7 000 r·min-1離心10 min，收集菌體。經(jīng)磷酸緩沖鹽溶液清洗2次，重懸于5 mL磷酸緩沖鹽溶液中，4 ℃下10 000 r·min-1離心20 min，棄沉淀，取上清液進(jìn)行SOD活性測(cè)定。

1.3.8 轉(zhuǎn)錄組技術(shù)分析高溫脅迫下瑞士乳桿菌差異表達(dá)基因

將高溫脅迫(47 ℃，10 h)與最適生長(zhǎng)溫度(42 ℃，10 h)下的瑞士乳桿菌菌體沉淀保存于液氮中用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成RNA的提取、質(zhì)控、建庫(kù)及測(cè)序工作。通過(guò)生物信息學(xué)手段對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，明確其相應(yīng)生物學(xué)功能。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS Statistics 19軟件進(jìn)行單因素方差分析。采用Origin 2018和Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和圖表制作。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 在不同培養(yǎng)溫度條件下瑞士乳桿菌的生長(zhǎng)趨勢(shì)

由圖1可知，不同生長(zhǎng)溫度下瑞士乳桿菌生長(zhǎng)趨勢(shì)相同。其中42 ℃是瑞士乳桿菌的最適生長(zhǎng)溫度，與岳瑩雪等[5]結(jié)果一致。培養(yǎng)12 h后瑞士乳桿菌開(kāi)始進(jìn)入穩(wěn)定期，OD值最大為1.387±0.03。當(dāng)培養(yǎng)溫度提升至47 ℃時(shí)，瑞士乳桿菌在培養(yǎng)10 h開(kāi)始進(jìn)入穩(wěn)定期，OD值為0.794±0.02，與置于42 ℃培養(yǎng)相比，其生長(zhǎng)受到明顯的抑制。處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的瑞士乳桿菌對(duì)外界脅迫的耐性高于對(duì)數(shù)前期和中期[13]，所以本實(shí)驗(yàn)選擇42℃作為對(duì)照，探究高溫脅迫(47 ℃)對(duì)培養(yǎng)8，10和12 h的瑞士乳桿菌細(xì)胞補(bǔ)償效應(yīng)的影響。

2.2 高溫脅迫對(duì)瑞士乳桿菌的細(xì)胞膜流動(dòng)性的影響

適宜的細(xì)胞膜流動(dòng)性對(duì)維持細(xì)胞膜的正常生理功能有重要意義。當(dāng)細(xì)胞受到外界不良環(huán)境的影響時(shí)，流動(dòng)性會(huì)降低，以提高細(xì)胞的抗逆性[14]。采用ANS熒光探針?lè)▽?duì)細(xì)胞膜流動(dòng)性進(jìn)行測(cè)定[12]。ANS的熒光強(qiáng)度值與細(xì)胞膜的流動(dòng)性呈反比，熒光強(qiáng)度越高，細(xì)胞膜的流動(dòng)性越低。如圖2所示，相比最適生長(zhǎng)溫度(42 ℃)，瑞士乳桿菌在高溫脅迫(47 ℃)下熒光強(qiáng)度值升高，其細(xì)胞膜流動(dòng)性顯著降低，這可能是由于高溫脅迫引起膜脂肪酸組成的變化，導(dǎo)致膜流動(dòng)性下降[15]。張愛(ài)靜等[14]對(duì)大腸桿菌進(jìn)行熱脅迫，發(fā)現(xiàn)隨著脅迫溫度的提高，細(xì)胞膜流動(dòng)性降低，與本研究結(jié)果趨勢(shì)一致，且菌株細(xì)胞膜流動(dòng)性的降低可能有利于保證其在高溫環(huán)境下正常的流動(dòng)性，使細(xì)胞更好地適應(yīng)外界脅迫環(huán)境。在高溫脅迫(47 ℃)下，瑞士乳桿菌在穩(wěn)定期(12 h)時(shí)的細(xì)胞膜流動(dòng)性高于對(duì)數(shù)期后期(10 h)，這可能是由于瑞士乳桿菌經(jīng)自身代謝補(bǔ)償逐漸適應(yīng)了高溫環(huán)境。

t/h

λ/nm

2.3 高溫脅迫對(duì)瑞士乳桿菌的相對(duì)電導(dǎo)率的影響

細(xì)胞膜是保護(hù)和維持瑞士乳桿菌細(xì)胞穩(wěn)定的重要組成部分，是細(xì)胞抵抗外界脅迫的重要屏障，也是反映細(xì)胞完整性的重要指標(biāo)。微生物在遭受外界脅迫時(shí)菌體細(xì)胞膜通透性增加，導(dǎo)致一些鉀鹽、磷酸鹽等小分子釋放，使發(fā)酵液電導(dǎo)率升高[16]。由圖3可知，與最適生長(zhǎng)溫度(42 ℃)相比，瑞士乳桿菌在高溫脅迫(47 ℃)下相對(duì)電導(dǎo)率分別提高了11.43%(8 h)，10.81%(10 h)和12.97%(12 h)。這可能是因?yàn)楦邷孛{迫導(dǎo)致細(xì)胞膜蛋白質(zhì)變性，滲透調(diào)節(jié)紊亂，同時(shí)細(xì)胞膜通透性增大，造成內(nèi)部電解質(zhì)的外滲。與最適生長(zhǎng)溫度(42 ℃)相比，瑞士乳桿菌在高溫脅迫條件(47 ℃)下，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵液的電導(dǎo)率顯著升高(P<0.05)，之后趨于平穩(wěn)。這可能是由于瑞士乳桿菌對(duì)高溫脅迫產(chǎn)生完全應(yīng)答需要一定時(shí)間，在此期間細(xì)胞不能適應(yīng)高溫脅迫環(huán)境，可能導(dǎo)致細(xì)胞膜的屏障作用減弱，通透性增加，引發(fā)包括電解質(zhì)在內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)容物外泄，從而造成發(fā)酵液相對(duì)電導(dǎo)率逐漸增大。隨著高溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞可能逐漸完成細(xì)胞應(yīng)答過(guò)程，適應(yīng)了高溫脅迫環(huán)境，胞內(nèi)電解質(zhì)外泄速度減緩，因此發(fā)酵液相對(duì)電導(dǎo)率趨于平穩(wěn)。

不同上標(biāo)小寫(xiě)字母表示具有顯著差異(P<0.05)。

2.4 高溫脅迫對(duì)瑞士乳桿菌細(xì)胞可溶性蛋白含量的影響

研究發(fā)現(xiàn)微生物在遭受外界脅迫時(shí)，在其適應(yīng)過(guò)程中，細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生了一系列的應(yīng)答反應(yīng)，通過(guò)產(chǎn)生大量滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(如可溶性蛋白，海藻糖等)，提高生物對(duì)外界脅迫的適應(yīng)性[10]。由圖4可知，與最適生長(zhǎng)溫度(42 ℃)相比，瑞士乳桿菌在高溫脅迫(47 ℃)下可溶性蛋白含量分別提高了77.46%(8 h)，140.13%(10 h)和31.62%(12 h)。這可能是外界脅迫導(dǎo)致細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)紊亂，合成酶活性下降，水解酶活性增加，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變成可溶性化合物，細(xì)胞內(nèi)可溶性化合物增加，因而增強(qiáng)細(xì)胞的滲透勢(shì)，提高其滲透調(diào)節(jié)的能力，保護(hù)細(xì)胞膜，從而增強(qiáng)其耐熱性[10]。在高溫脅迫(47 ℃)下，瑞士乳桿菌在穩(wěn)定期(12 h)時(shí)的可溶性蛋白含量顯著低于對(duì)數(shù)期后期(10 h)(P<0.05)，這可能是由于瑞士乳桿菌在穩(wěn)定期(12 h)時(shí)經(jīng)自身代謝補(bǔ)償逐漸適應(yīng)了高溫環(huán)境，水解酶活性降低，可溶性蛋白質(zhì)的生成降低。

不同上標(biāo)小寫(xiě)字母表示具有顯著差異(P<0.05)。

2.5 高溫脅迫對(duì)瑞士乳桿菌細(xì)胞海藻糖含量的影響

海藻糖是一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。外界脅迫會(huì)造成生物體內(nèi)海藻糖的積累，從而保護(hù)細(xì)胞質(zhì)膜，核酸等生物大分子空間結(jié)構(gòu)和功能活性，維持細(xì)胞滲透壓，幫助細(xì)胞抵抗外界不良環(huán)境[10，17]。如圖5所示，瑞士乳桿菌在最適生長(zhǎng)溫度(42 ℃)培養(yǎng)下海藻糖含量最低；在高溫脅迫(47 ℃)下海藻糖含量分享提高了30.12%(8 h)，17.23%(10 h)和21.95%(12 h)；這可能由于海藻糖是一種生物應(yīng)激代謝產(chǎn)物，生長(zhǎng)在不良環(huán)境中微生物細(xì)胞中海藻糖含量較高[18]。海藻糖對(duì)生物體的保護(hù)作用是由于它提高了細(xì)胞內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，使細(xì)胞滲透壓降低，維持細(xì)胞膜的完整性，從而提高細(xì)胞的抗外界脅迫能力[10]。葉燕銳等[19]發(fā)現(xiàn)在42 ℃熱脅迫下，釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)的海藻糖含量較脅迫前提高了4倍，表明海藻糖的積累能夠增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)外界脅迫的抗性。近年來(lái)的報(bào)道中還發(fā)現(xiàn)，在生物體處于脅迫條件時(shí)，海藻糖可通過(guò)誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，從而保護(hù)細(xì)胞，使其免于凋亡，最終使生物體在極端環(huán)境中得以存活[20]。在高溫脅迫(47 ℃)下，瑞士乳桿菌在穩(wěn)定期(12 h)和對(duì)數(shù)期后期(10 h)的海藻糖含量變化不顯著(P>0.05)，這可能是由于瑞士乳桿菌經(jīng)自身代謝補(bǔ)償逐漸適應(yīng)了高溫環(huán)境，海藻糖合成減緩。

不同上標(biāo)小寫(xiě)字母表示具有顯著差異(P<0.05)。

2.6 高溫脅迫對(duì)瑞士乳桿菌中SOD活性的影響

外界脅迫會(huì)增加生物體內(nèi)活性氧自由基的產(chǎn)生，導(dǎo)致活性氧自由基的產(chǎn)生和清除間的平衡被破壞，造成膜脂過(guò)氧化，從而對(duì)細(xì)胞造成損傷[21]。SOD是生物體抗氧化酶系統(tǒng)重要組分，能夠清除生物體產(chǎn)生的自由基[10]。在高溫脅迫條件下，瑞士乳桿菌SOD活性有不同程度的變化(圖6)。由圖6可知，與最適生長(zhǎng)溫度(42 ℃)相比，瑞士乳桿菌在高溫脅迫(47 ℃)時(shí)SOD活性分別提高了97.24%(8 h)，159.28%(10 h)和126.96%(12 h)，差異顯著(P<0.05)。這可能是由于瑞士乳桿菌在高溫脅迫下通過(guò)激發(fā)補(bǔ)償效應(yīng)，提高的SOD活性，增強(qiáng)清除活性氧的能力，減小膜脂過(guò)氧化作用，降低高溫對(duì)細(xì)胞造成的傷害，從而達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的作用[10]。

不同上標(biāo)小寫(xiě)字母表示具有顯著差異(P<0.05)。

2.7 高溫脅迫下瑞士乳桿菌轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因分析

從高溫脅迫對(duì)瑞士乳桿菌的生長(zhǎng)情況、細(xì)胞膜通透性和流動(dòng)性、可溶性蛋白含量、海藻糖含量和SOD活性多個(gè)指標(biāo)的變化分析，選取高溫脅迫(47 ℃，10 h)與最適生長(zhǎng)溫度(42 ℃，10 h)的瑞士乳桿菌送往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，探究高溫脅迫下瑞士乳桿菌的轉(zhuǎn)錄水平變化情況。選擇差異倍數(shù)|log2(fold change)|>1和顯著水平q value<0.05的差異基因進(jìn)行分析。結(jié)果如圖7所示，與最適生長(zhǎng)溫度(42 ℃)相比，高溫脅迫(47 ℃)下的瑞士乳桿菌中有432個(gè)基因的調(diào)控模式發(fā)生變化。其中，有219個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，213個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)。由此可見(jiàn)，高溫脅迫(47 ℃)下瑞士乳桿菌基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生一定改變。

log2(fold change)

2.8 高溫脅迫下瑞士乳桿菌差異表達(dá)基因GO和KEGG注釋分類(lèi)

將432個(gè)差異基因根據(jù)不同的功能進(jìn)行GO(Gene Ontology)功能注釋及分類(lèi)，結(jié)果如圖8所示。GO功能分為3大類(lèi)：生物過(guò)程(biological process)、細(xì)胞組分(cellular component)及分子功能(molecular function)。在生物過(guò)程上的10個(gè)亞分類(lèi)中，以代謝過(guò)程(metabolic process)和細(xì)胞過(guò)程(cellular process)居多，占該類(lèi)別的比例分別為35.18%和33.10%，其次是生物調(diào)控(biological regulation)、應(yīng)激反應(yīng)(response to stimulus)和定位(localization)，分別占比5.09%，3.47%和2.08%。其中，應(yīng)激反應(yīng)中有10個(gè)差異基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，5個(gè)差異基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)。瑞士乳桿菌可能通過(guò)增加應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程的差異基因表達(dá)，積累更多的熱激蛋白，提高其抗熱脅迫的能力。在細(xì)胞組分類(lèi)別中，差異表達(dá)基因主要與細(xì)胞構(gòu)造(cellular anatomical entity)和含蛋白質(zhì)復(fù)合物(protein-containing complex)有關(guān)，這2類(lèi)功能占該大類(lèi)的比例分別為35.65%和2.3%。在分子功能的10個(gè)亞分類(lèi)中，差異表達(dá)基因主要與催化活性(catalytic activity)和結(jié)合(binding)有關(guān)，分別占該類(lèi)別的51.62%和40.27%。其次是結(jié)構(gòu)分子活性(structural molecule activity)和轉(zhuǎn)運(yùn)活性(transporter activity)，分別占比5.56%和5.09%。其中，催化活性中有125個(gè)差異基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，98個(gè)差異基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)；抗氧化活性(antioxidant activity)中有2個(gè)差異基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)。以上結(jié)果表明，高溫脅迫影響了瑞士乳桿菌的催化活性和抗氧化活性等分子功能、細(xì)胞構(gòu)造和含蛋白質(zhì)復(fù)合物等細(xì)胞組分以及代謝過(guò)程和應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程等生物過(guò)程。

圖8 差異表達(dá)基因的GO分類(lèi)圖

圖9 差異表達(dá)基因的KEGG功能分類(lèi)圖

為了解差異基因的生物學(xué)功能，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)注釋。結(jié)果如圖9所示，高溫脅迫下瑞士乳桿菌在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中共有223個(gè)差異表達(dá)基因分別在代謝(Metabolism)，遺傳信息處理(Genetic Information Processing)，環(huán)境信息處理(Environmental Information Processing)，細(xì)胞過(guò)程(Cellular Processes)，生物體系統(tǒng)(Organismal Systems)，人類(lèi)疾病(Human Diseases)6大功能27個(gè)通路上得到功能注釋。結(jié)果顯示，130個(gè)差異基因在代謝通路上得到注釋?zhuān)渲?6個(gè)差異基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，74個(gè)差異基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)。代謝途徑層面的差異基因主要集中在糖代謝(Carbohydrate metabolism)、氨基酸代謝(Amino acid metabolism)和核苷酸代謝(Nucleotide metabolism)等代謝。上調(diào)差異基因中，糖代謝途徑中有19個(gè)差異基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)；氨基酸代謝途徑中有12個(gè)差異基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)；核苷酸代謝途徑中有17個(gè)差異基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)。表明氨基酸代謝、糖代謝和核苷酸代謝水平提高，可促進(jìn)相關(guān)功能蛋白和酶的合成，對(duì)高溫脅迫的瑞士乳桿菌細(xì)胞損傷具有重要修復(fù)作用。Gao等[22]研究表明植物乳桿菌可通過(guò)提高核苷酸代謝水平，為ATP合成提供更多的腺嘌呤，從而為抵抗惡劣環(huán)境提供能量。遺傳信息處理途徑中有10個(gè)差異基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，36個(gè)差異基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)。瑞士乳桿菌處于47 ℃高溫脅迫時(shí)，其生長(zhǎng)受到明顯的抑制。環(huán)境信息處理途徑中有11個(gè)差異基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，其中與膜運(yùn)輸(Membrane transport)有關(guān)的上調(diào)差異基因?yàn)?個(gè)，與信號(hào)傳導(dǎo)(Signal transduction)有關(guān)的上調(diào)差異基因?yàn)?個(gè)。高溫脅迫下可能通過(guò)調(diào)節(jié)膜運(yùn)輸和信號(hào)傳導(dǎo)等代謝途徑，增加細(xì)胞膜通透性，維持細(xì)胞膜內(nèi)外滲透壓平衡，保持細(xì)胞膜的完整性，提高瑞士乳桿菌抗高溫脅迫的能力。

高溫脅迫會(huì)對(duì)瑞士乳桿菌的生長(zhǎng)發(fā)育、生理過(guò)程產(chǎn)生多種不利的影響。細(xì)胞膜是分隔細(xì)胞與外界環(huán)境的一道屏障,也是細(xì)胞與外界進(jìn)行物質(zhì)運(yùn)輸和信息交流的重要通道[10]。在高溫脅迫下瑞士乳桿菌的細(xì)胞膜流動(dòng)性降低，膜通透性增加。細(xì)胞膜流動(dòng)性和膜通透性主要與細(xì)胞膜的組成有關(guān)[23]。GO功能分類(lèi)分析顯示，細(xì)胞組分類(lèi)別中，差異表達(dá)基因集中在細(xì)胞構(gòu)造和含蛋白質(zhì)復(fù)合物。KEGG通路分析顯示，與膜運(yùn)輸有關(guān)的上調(diào)差異基因?yàn)?個(gè)。高溫脅迫可能導(dǎo)致瑞士乳桿菌細(xì)胞膜成分發(fā)生變化，細(xì)胞膜流動(dòng)性和細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，從而使瑞士乳桿菌對(duì)高溫環(huán)境具有更好的適應(yīng)性和保護(hù)性。

此外，在高溫脅迫下瑞士乳桿菌的可溶性蛋白含量、海藻糖含量和SOD活性升高。GO功能分類(lèi)分析顯示，催化活性中有125個(gè)差異基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)。這可能導(dǎo)致水解酶和合成酶相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(可溶性蛋白、海藻糖)的產(chǎn)生，提高其滲透調(diào)節(jié)的能力，維護(hù)細(xì)胞膜的正常生理功能，幫助細(xì)胞抵抗外界不良環(huán)境[10]。GO功能分類(lèi)分析顯示，與抗氧化活性有關(guān)的差異表達(dá)基因增加，可能增強(qiáng)瑞士乳桿菌清除活性氧的能力，防止膜脂過(guò)氧化，降低高溫對(duì)細(xì)胞膜造成損傷。KEGG通路分析顯示，高溫脅迫會(huì)影響瑞士乳桿菌多條代謝途徑，促進(jìn)了氨基酸代謝、糖代謝和核苷酸代謝，為瑞士乳桿菌抵抗高溫脅迫提供能量和組織細(xì)胞合成，從而增強(qiáng)細(xì)胞的代謝補(bǔ)償效應(yīng)，進(jìn)而使瑞士乳桿菌對(duì)高溫環(huán)境具有抗逆性。

3 結(jié)論

本文研究發(fā)現(xiàn)瑞士乳桿菌處于47 ℃高溫脅迫時(shí)，其生長(zhǎng)受到明顯的抑制，細(xì)胞膜流動(dòng)性降低，膜通透性增加。此外，在高溫脅迫條件下瑞士乳桿菌的可溶性蛋白含量、海藻糖含量和SOD活性升高，維護(hù)細(xì)胞膜的正常生理功能，保護(hù)細(xì)胞抵抗外界不良環(huán)境。高溫脅迫會(huì)影響瑞士乳桿菌多條代謝途徑，主要促進(jìn)了氨基酸代謝、糖代謝和核苷酸代謝，為瑞士乳桿菌抵抗高溫脅迫提供能量和組織細(xì)胞合成，同時(shí)提高了調(diào)節(jié)膜運(yùn)輸和信號(hào)傳導(dǎo)等相關(guān)基因代謝水平，從而增強(qiáng)細(xì)胞的代謝補(bǔ)償效應(yīng)，進(jìn)而提高瑞士乳桿菌對(duì)高溫脅迫的抗性。通過(guò)本研究對(duì)瑞士乳桿菌高溫脅迫補(bǔ)償效應(yīng)機(jī)制的探討，為進(jìn)一步研究提高瑞士乳桿菌高溫耐受性提供理論指導(dǎo)。