劉曉芳，劉 貝，周方月,黃云祥，鐘引鳳，張茹云,梁宇芳，王 丹，付金衡*

(1.南昌大學(xué)a.生命科學(xué)學(xué)院,江西 南昌 330031;b.中德聯(lián)合研究院,江西 南昌 330047;2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，江西 南昌 330045)

Shimomure等首次分離出的GFP[1]具有β桶和α-螺旋使其性質(zhì)穩(wěn)定[2]，研究者常把它作為一種標(biāo)簽分子應(yīng)用于抗體檢測[3-4]、單分子熒光成像[5]、細(xì)胞內(nèi)定位[6-7]等領(lǐng)域[8]。GFP/eGFP作為最常用的工具蛋白，在生命科學(xué)研究中具有很高的研究與應(yīng)用價值，抗GFP/eGFP納米抗體應(yīng)運(yùn)發(fā)展。與傳統(tǒng)抗體相比，具有小體積，15 KDa分子質(zhì)量；耐酸耐熱較高穩(wěn)定性、穿透力強(qiáng)、易于基因工程改造及表達(dá)、親和性高等優(yōu)點[9-10]的納米抗體被廣大科學(xué)研究者應(yīng)用于各領(lǐng)域[11]，例如在發(fā)育生物學(xué)中的有機(jī)體和細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中[12-13]，作為穩(wěn)定生物學(xué)中構(gòu)象狀態(tài)的結(jié)晶伴侶[14,15]；作為酶的活性調(diào)節(jié)劑或抑制劑[16,17]；作為生物化學(xué)分析的免疫組化試劑[18]或作為“二抗”檢測抗鼠抗Ig的免疫印跡和免疫熒光[19]等。特異性結(jié)合GFP/eGFP的抗GFP/eGFP納米抗體在亞細(xì)胞定位[20]、細(xì)胞內(nèi)信號通路研究和活細(xì)胞成像[21-22]以及靶向納米材料[22]等方面被廣泛應(yīng)用。但對高親和力的抗GFP/eGFP納米抗體的研究鮮少報道。

本研究以eGFP蛋白免疫羊駝皮下部位，構(gòu)建抗eGFP納米抗體噬菌體展示文庫；經(jīng)過四輪淘選獲得能與eGFP結(jié)合的納米抗體，通過基因克隆技術(shù)在大腸桿菌Rosetta中表達(dá)，獲得了高親和力的納米抗體4-28，HRP酶標(biāo)納米抗體4-28作為檢測“二抗”，簡化ELISA實驗操作，納米抗體4-28偶聯(lián)納米磁珠，免疫沉淀B13-eGFP融合蛋白，為抗eGFP納米抗體的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

M13輔助噬菌體、噬菌粒載體pComb3XSS、E.coliTG1、E.coliDH5α、Rosetta(DE3)、pET-25b(+)載體均由本實驗室保存；弗氏佐劑購自Sigma公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒、割膠純化試劑盒購自天根生物有限公司；Taq酶、核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶等均購自TaKaRa公司；M13 Bacteriophage Antibody(HRP)購自北京義翹神州科技有限公司；HRP Anti His-Tag Mouse Monoclonal Antibody購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；人外周血淋巴分離液、所需引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

巢式PCR擴(kuò)增VHH基因，所需引物分別為：

VH-LD：CTT GGT GGT CCT GGC TGC

CH2-R：GGT ACG TGC TGT TGA ACT GTT CC

VHH1：CATGCCATGACTGTGGCCCAGGCGGCCCAGKTGCAGCTCGTGGAGTC

VHH2：CATGCCATGACTCGCGGCCGGCCTGGCCATGGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG

VHH3：CATGCCATGACTCGCGGCCGGCCTGGCCGTCTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGG

1.2 實驗儀器與設(shè)備

臺式高速冷凍離心機(jī)、酶標(biāo)儀、NanoDrop購自Thermo公司；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)購自寧波新芝公司；凝膠成像系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司；電泳儀購自BIO-RAD公司；恒溫培養(yǎng)箱和恒溫?fù)u床購自上海一恒科技公司；PCR儀購自艾本德公司；DYY-I III穩(wěn)壓電泳購自為北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 噬菌體展示文庫的構(gòu)建

分別取免疫前靜脈血作陰性組和每次免疫后靜脈血，監(jiān)測血清效價；取eGFP四免羊駝后的靜脈血50 mL提取總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，兩步巢式PCR進(jìn)行擴(kuò)增VHH基因，將純化后的VHH基因克隆至M13噬菌粒載體pComb3XSS上，電轉(zhuǎn)至E.coliTG1感受態(tài)細(xì)胞中，得到噬菌體文庫。

1.3.2 抗eGFP納米抗體的淘選與鑒定

采用固相親和淘選的方法，以eGFP為靶標(biāo)從噬菌體文庫中淘選特異性結(jié)合eGFP的納米抗體。淘選策略如下，1)逐輪降低抗原包被在酶標(biāo)板孔中的濃度：100～1 μg·mL-1；2)每輪均投入納米抗體文庫：1.0×1012cfu，3)逐輪降低抗體庫與抗原結(jié)合時間：第1輪結(jié)合60 min，第2輪結(jié)合30 min，第3～4輪結(jié)合15 min；4)逐輪增加洗滌次數(shù)：第一輪分別用磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)和磷酸鹽緩沖液(PBS)各洗滌5次，第二、三、四輪各洗滌10，15，20次；5)噬菌體洗脫：先采用pH 4.0的甘氨酸-鹽酸洗脫掉親和力較低的噬菌體，然后再采用pH 2.2的甘氨酸-鹽酸洗脫得到特異性噬菌體，每一輪的洗脫條件一致。采用間接phage-ELISA鑒定從第3，4輪測定洗脫物滴度的平板上各隨機(jī)挑取的45個單菌落，確定陽性克隆。

1.3.3 抗eGFP納米抗體的原核表達(dá)與純化

1)PCR擴(kuò)增出陽性噬菌體克隆子片段；NcoI和NotI分別酶切4-28基因與pET-25b(+)，將純化的目的片段與表達(dá)載體用T4 DNA連接酶16 ℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Rosetta(DE3)感受態(tài)中；菌落PCR驗證隨機(jī)挑取的10個克隆子并測序。

2)1%接種量轉(zhuǎn)接至100 mL培養(yǎng)基，37 ℃ 220 r·min-1震蕩培養(yǎng)至OD600≈0.6-0.8時加入終濃度為0.1 mmol·L-1IPTG，30 ℃ 220 r·min-1震蕩培養(yǎng)6 h；收集培養(yǎng)物；PBS重懸離心后的菌體，將超聲破碎后的上清經(jīng)Ni-NTAResin純化，SDS-PAGE分析純化結(jié)果。

1.3.4 ELISA鑒定抗eGFP納米抗體活性及特異性

1)將1 μg·mL-1的eGFP 4 ℃過夜包被；PBST甩洗3次，4%脫脂乳37 ℃封閉1 h；PBST甩洗3次，100 μL·孔-1加入稀釋至不同濃度純化后的納米抗體4-28，37 ℃孵育30 min；PBST洗板3次，加入二抗，37 ℃孵育30 min；PBST甩洗拍干6次，加入預(yù)熱的TMB單組份顯色液，37 ℃孵育8-10 min，最后加入濃H2SO4終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測OD450。

2)分別將eGFP，GFP，黃色熒光蛋白(YFP)，牛血清白蛋白(BSA)，卵清蛋白(OVA)稀釋至1 μg·mL-1包被于酶標(biāo)板中，按照1)的實驗方法進(jìn)行操作，測OD450。

1.3.5 親和力測定

采用OCTET系統(tǒng)生物傳感器測定納米抗體4-28與eGFP的親和力，將200 μL生物素化的eGFP固定在鏈酶親和素的探針上，洗滌，加入200 μL納米抗體，使抗原抗體結(jié)合，結(jié)束后進(jìn)行解離；最后通過軟件進(jìn)行擬合運(yùn)算計算出動力學(xué)參數(shù)。

1.3.6 HRP偶聯(lián)納米抗體4-28及工作濃度和穩(wěn)定性鑒定

1)采用過碘酸鈉法將HRP偶聯(lián)抗eGFP納米抗體4-28，向0.3 mg的溶于HAc-NaAc、(pH 5.6)溶液中HRP中加入NaIO4，使其HRP表面的糖分子氧化成醛基，1 mmol·L-1醋酸鈉緩沖液(pH 4.4)每隔4 h透析兩次后，加入150 μg的納米抗體(4-28)4 ℃反應(yīng)4 h，加入CH3BHNa(5 mol·L-1)反應(yīng)后用乙醇胺封閉，加入終飽和度45%的硫酸銨粉末，離心取沉淀即為偶聯(lián)物。

2)直接ELISA鑒定其工作濃度及穩(wěn)定性，分別包被eGFP和BSA/OVA 1μg·mL-1，封閉后加入稀釋不同倍數(shù)的HRP偶聯(lián)納米抗體4-28，加入預(yù)熱的TMB單組份顯色液反應(yīng)8-10 min后終止，測OD450值。分別將放置-20 ℃ 2個月和6個月的HRP偶聯(lián)納米抗體4-28直接ELISA(同上)的實驗操作驗證其穩(wěn)定性。

1.3.7 B13-EGFP融合蛋白的原核表達(dá)與純化

分別將eGFP PCR產(chǎn)物和pET-25b-B13經(jīng)HindIII、NheI雙酶切后T4DNA連接酶連接，鈣轉(zhuǎn)至Rosetta(DE3)感受態(tài)中；隨機(jī)挑選5個克隆子菌落PCR后測序。誘導(dǎo)表達(dá)與純化參照1.3.3操作。

1.3.8 納米抗體4-28偶聯(lián)納米磁珠及免疫沉淀B13-EGFP融合蛋白

1)羧基化的納米磁珠偶聯(lián)高親和力的納米抗體4-28，在磁力架的作用下，將磁珠固定在離心管壁上，活化3～4次，加入活化緩沖液、EDC和Sulfo-NHS，室溫孵育15 min；磁珠被固定在管壁上后吸棄上清，加入納米抗體4-28適時反應(yīng)后4 ℃過夜偶聯(lián)；重復(fù)封閉兩次，加入保存液4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2)根據(jù)抗原抗體反應(yīng)原理，免疫沉淀B13-eGFP融合蛋白。將含有pET-25b-B13-eGFP質(zhì)粒的Rosetta細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)后超聲破碎，加入抗eGFP納米抗體4-28偶聯(lián)磁珠，并用碳酸鹽緩沖液(CBS)洗滌磁珠沉淀物3次，去除未結(jié)合的雜蛋白，SDS-PAGE鑒定上清液和磁珠沉淀物。

2 結(jié)果與討論

2.1 噬菌體展示文庫的構(gòu)建

四免后的羊駝抗血清滴度超過1.28×106(圖1a)。采用兩步巢式PCR擴(kuò)增VHH基因，第一步擴(kuò)增得到了約750 bp的片段(圖1b)，第二步擴(kuò)增得到了約500 bp的目的基因(圖1c)；將VHH基因克隆至M13噬菌粒載體pComb3XSS后轉(zhuǎn)化至E.coliTG1，收獲到庫容量為1.85×108cfu納米抗體原始庫，經(jīng)MI3KO7救援后得到滴度為4×1013cfu·mL-1的噬菌體展示文庫。

2.2 抗eGFP納米抗體的淘選與鑒定

抗體的親和常數(shù)KD=Koff(解離常數(shù))/Kon(結(jié)合常數(shù))，KD值越小，抗體的親和力越高。本研究擬獲得高親和力的抗eGFP納米抗體，因此在原有的基礎(chǔ)上適當(dāng)調(diào)整了淘選策略。通過逐輪降低抗原包被濃度、逐輪減少抗體文庫與抗原的結(jié)合時間，以期保留Kon值較大的納米抗體；通過逐輪增加洗滌次數(shù)、并在洗脫前用pH 4.0的甘氨酸鹽酸除去Koff相對較大的納米抗體，淘選數(shù)據(jù)(表1)中表明抗eGFP特異性納米抗體有效富集(富集度為52.17)；由于第三四輪淘選時，包被抗原的濃度依次從20降低到5再到1 μg·mL-1以及逐輪增加淘選條件嚴(yán)格程度，使第三輪和第四輪的回收率和富集度沒有明顯增加，甚至出現(xiàn)了一定程度的降低(富集度小于1)，該結(jié)果表明，本研究采用的淘選策略有效的富集了高親和力納米抗體，除掉了低親和力納米抗體。采用間接ELISA鑒定第3、4輪克隆子，結(jié)果如圖2、3所示，陽性率達(dá)到了95.56%和97.78%；2采用DNAstar軟件進(jìn)行多序列對比分析，得到了10種納米抗體序列；將這10種納米抗體的噬菌體分別稀釋至同一濃度，采用ELISA測試其結(jié)合活性，結(jié)果如圖4所示，克隆4-28的OD450最高。

稀釋比/W(a)

表1 淘選結(jié)果

NC:陰性對照;BK:空白對照。

NC:陰性對照;BK:空白對照。

稀釋比

2.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)

按照1.3.3的方法構(gòu)建原核表達(dá)載體，菌落PCR驗證如圖5所示，將750 bp處條帶測序且測序結(jié)果顯示序列正確，表達(dá)載體構(gòu)建成功。將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta感受態(tài)中，IPTG(0.1 mmol·L-1)30 ℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h后超聲破碎，破碎上清經(jīng)Ni-NTAResin純化后得到與預(yù)期大小相符的20 kDa左右的納米抗體4-28蛋白(圖6)，BCA定量蛋白濃度為1.2 mg·mL-1。

泳道M:DNA marker DL2000;泳道1-10:隨機(jī)挑取的轉(zhuǎn)化子。

M:蛋白marker;泳道1:誘導(dǎo)前菌體總蛋白;泳道2:誘導(dǎo)后菌體總蛋白;泳道3:破碎上清;泳道4:破碎沉淀;泳道5:鎳柱純化流穿液;泳道6:20 mmol·L-1咪唑洗滌液;泳道7:100 mmol·L-1咪唑洗脫液。

2.4 抗eGFP納米抗體的結(jié)合活性及特異性分析

采用ELISA分析的結(jié)合活性，如圖7所示，隨著抗eGFP納米抗體4-28濃度的增加，其OD450值逐漸升高并趨于穩(wěn)定，表明納米抗體4-28結(jié)合活性良好；將eGFP/GFP/YFP/BSA/OVA稀釋至相同濃度包被后，加入相同濃度的納米抗體，測OD450，如圖8所示，該抗體和eGFP、GFP蛋白結(jié)合，和YFP、BSA、OVA結(jié)合很弱或不結(jié)合，表明納米抗體4-28特異性良好。

抗體濃度/(μg·mL-1)(a)

2.5 親和力測定分析

采用ForteBio Octet研究納米抗體與eGFP的親和力。結(jié)果如圖8所示，納米抗體4-28的結(jié)合常數(shù)(Kon)和解離常數(shù)(Koff)分別為2.74×105M-1和2.65×10-5M-1s-1，則KD為9.67×10-11M。表2為10種獨(dú)特序列的抗eGFP納米抗體的親和力常數(shù)(KD)，其中3-2和3-45未檢測到信號。納米抗體作為單價抗體，只有一個結(jié)構(gòu)域，其親和力與傳統(tǒng)單克隆抗體相比較低，已有文獻(xiàn)報道的納米抗體親和力常數(shù)多在1 μM-1 nM。本研究獲得的納米抗體4-28親和力相對較高，表明實驗中采用的淘選策略是正確的。

T/s

表2 10種納米抗體親和力常數(shù)

2.6 HRP標(biāo)記納米抗體4-28工作濃度及穩(wěn)定性鑒定

如圖9所示，4 ℃放置一周后，抗體活性下降，-20 ℃放置，時間長短對抗體活性無影響，由圖9可知該酶標(biāo)抗體的使用稀釋范圍為1:10 000～1:25 000(濃度100～40 ng·mL-1)，相比于市場上現(xiàn)有的檢測二抗(稀釋范圍1:5 000～1:20 000)其靈敏度更高。

2.7 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及免疫沉淀

表達(dá)后的B13-eGFP融合蛋白經(jīng)Ni柱純化時，僅用100 mmol·L-1咪唑洗脫目的蛋白，結(jié)果如圖10a所示，獲得分子量為45 kDa左右的胞內(nèi)可溶性的蛋白條帶，經(jīng)IP鑒定是目的B13-eGFP融合蛋白，但只用一個濃度的咪唑洗脫液洗脫目的蛋白時，目的蛋白純度經(jīng)Quantity one分析只達(dá)到了19.1%?？笶GFP納米抗體與羧基化磁珠偶聯(lián)后免疫沉淀破碎后的融合蛋白，結(jié)果如圖10b所示，SDS-PAGE凝膠電泳顯示在45 KDa出現(xiàn)與B13-eGFP融合蛋白大小一致且純度高的目的條帶，與蔡召忠等用Ni柱分離純化PEP-1-VP3融合蛋白[23]相比，該分離目的蛋白的方法簡單快速且純度高。

濃度/(ng·mL-1)

(a) (b)

3 總結(jié)

在羊駝免疫效價超出1.28×106時，成功構(gòu)建了抗eGFP納米抗體文庫。依據(jù)抗原-抗體相互作用的動力學(xué)規(guī)律，在淘選時通過調(diào)整eGFP的包被濃度、文庫與eGFP結(jié)合時間、洗滌次數(shù)、噬菌體洗脫方式等條件獲得了10種高親和力的納米抗體，其中納米抗體4-28親和力最高，達(dá)到了9.67×10-11M。此外，納米抗體4-28與eGFP和GFP有較好的結(jié)合，與YFP等蛋白無明顯結(jié)合。本研究獲得的高親和力納米抗體在腫瘤檢測等免疫學(xué)研究中有望成為非常理想的工具抗體。高親和力的抗eGFP納米抗體4-28與HRP酶進(jìn)行偶聯(lián)用作檢測二抗，檢測范圍在1:10 000～1:25 000(濃度100～40 ng·mL-1)，相比于市場上現(xiàn)有的檢測二抗(稀釋范圍1:5 000～1:20 000)其靈敏度更高。高親和力的納米抗體能夠特異性的和eGFP/GFP標(biāo)記的目的蛋白快速結(jié)合，在免疫沉淀實驗中，利用磁分離技術(shù)，可簡單快速分離得到沉淀復(fù)合物。